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1 第 6 卷第 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2014 年 月 Vol.6 No. JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Mar 文章编号 : (2014) 防治奶牛隐性乳房炎中药制剂 蒲和饮 1 的 HPLC 指纹图谱研究 李娇 1, 聂奎 1, 苏亮 2, 胡宇莉 2, 肖蓉 1, 路孝兵 1 1. 西南大学动物科技学院, 重庆 ;2. 重庆市兽药饲料检测所, 重庆 摘要 : 目的 : 建立中药制剂 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱, 为其质量控制提供依据. 方法 : 以 AgilentC18 色谱柱 (250 mm 4.6 mm,5μm) 为固定相, 乙腈 磷酸盐缓冲液为流动相, 梯度洗脱, 流速 1.0 ml/min, 检测波长 26nm, 柱温为 0. 用中国国家药典委员会中药指纹图谱相似度评价软件 (2004A 版 ) 对 蒲和饮 的 HPLC 图谱进行数据处理. 结果 : 蒲和饮 有效成分连翘苷 咖啡酸和芍药苷分别在 0.021~2.12 mg/ml,0.0125~ mg/ml,0.05~2.10 mg/ml 体积质量分数范围内呈良好的线性关系 ; 稳定性 精密性和重复性试验色谱峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD( 相对标准偏差 ) 都在 % 以内, 即制剂的稳定性 仪器精密性及方法重复性良好. 在 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱中, 标定出 15 个共有峰 ; 通过对照品色谱图确定了 个有效成分色谱峰的归属, 分别为咖啡酸 芍药苷和连翘苷. 随机抽取的 10 批样本的 HPLC 图谱与标准对照图谱间的相似度均大于 结论 : 建立了中药制剂 蒲和饮 HPLC 指纹图谱的考察方法, 以及该方法下 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱. 关键词 : 中药制剂 蒲和饮 ;HPLC; 指纹图谱 ; 相似度中图分类号 :S851. 文献标志码 :A 中药是中医治疗疾病的重要物质, 中医临床用药则是以方剂为主要形式和手段. 方剂是在中医辨证立 法的基础上, 按照组方原则, 选择适当的药物进行恰当配伍而成. 方剂组成后, 就具有增强药物疗效, 减少 药物的毒副作用和扩大治疗范围等作用. 但因中药方剂是一个具有复杂组分的化学库, 其质量控制是中药 现代化研究领域的重点和难点. 现代中药学研究表明, 中药 HPLC 指纹图谱能较好地反映中药药物化学成 [1-4] 分的全貌, 可在整体上控制中药的质量, 达到鉴别真伪 评定药材优劣的目的. 一些研究结果显示, 某 些中药的 HPLC 指纹图谱多见于其单味药材的研究 [5-6], 而能整体反映由多味中药组成的方剂特征的 [7] HPLC 指纹图谱的相关报道则少见. 本研究采用 HPLC 法建立了由连翘 蒲公英等组成的中药制剂 蒲 和饮 的指纹图谱, 通过对样品的 HPLC 图谱数据进行相似度评价 聚类分析, 验证了该方法的可行性, 为 蒲和饮 的质量控制提供标准. 1 材料 1.1 主要仪器 高效液相色谱仪 ( 美国 Waters2695); 恒温水浴锅 ( 瑞士 Salvislab WB20); 超声仪 ( 昆山市超声波仪器 1 收稿日期 : 基金项目 : 重庆市科委重点攻关资助项目 (CSTC2011AB200); 重庆市科技创新能力建设基金资助项目 (CSTC2009CB1010). 作者简介 : 李娇 (1988 ), 女, 云南昆明人, 硕士研究生, 主要从事动物传染病与寄生虫研究. 通信作者 : 聂奎, 博士, 教授.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 6 卷 有限公司 KQ-250DB). 1.2 主要试剂 连翘苷 ( 批号 ,98.9%) 咖啡酸 ( 批号 ) 芍药苷 ( 批号 , 96%) 均购自中国药品生物制品检定所, 乙腈 ( 色谱纯, 美国 Fisher 公司 ), 甲醇 ( 色谱纯, 美国 Fisher 公 司 ), 磷酸二氢钠 ( 分析纯, 重庆川东化工有限公司 ). 2 方法 2.1 色谱条件 流动相为乙腈 (A) 和磷酸盐缓冲液 (B)( 取磷酸二氢钠 1.56g, 加 1000mL 水使之溶解, 再加 1% 磷酸 溶液调节 ph 值至.8~4.0, 即得 ) 梯度洗脱 ; 洗脱梯度 :0~10 min,8% A,10~12 min,8%~12% A, 12~15 min,12%~15% A,15~25min,15%~0% A,25~26min,0%~8% A,26~40min,8% A; 柱温 :0 ; 检测波长 :26nm; 进样体积 :10μL; 流速 :1.0mL/min. 2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取连翘苷对照品 mg, 咖啡酸对照品 10.0 mg 和芍药苷对照品 mg, 各至 10mL 容量瓶中, 加甲醇超声溶解并稀释至刻度, 摇匀, 分别制得体积质量分数为 1.06mg/mL 的连翘苷 1.00mg/mL 的咖啡酸 1.05mg/mL 的芍药苷对照品储备液, 避光保存. 2. 供试品溶液的制备 取 0.5mL 中药制剂 蒲和饮, 加入 0.5mL 甲醇, 漩涡混匀, 过 0.45μm 滤膜即得. 2.4 中药制剂 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱方法学的建立与考察 连翘苷 咖啡酸 芍药苷线性关系的考察 (1) 连翘苷线性关系的考察 取连翘苷对照品储备液, 用甲醇配制成体积质量分数为 0.021mg/mL,0.05mg/mL,0.106mg/mL, 0.424mg/mL,1.06mg/mL,2.12 mg/ml 的对照品溶液, 在 2.1 色谱条件下进样, 记录其色谱峰并计算 回归方程. (2) 咖啡酸线性关系的考察 取咖啡酸对照品储备液, 用甲醇配制成体积质量分数为 mg/mL,0.0251mg/mL,0.0502mg/mL, 0.100mg/mL,0.2006mg/mL,0.4012mg/mL 的对照品溶液, 在 2.1 色谱条件下进样, 记录其色谱峰并计算 回归方程. () 芍药苷线性关系的考察 取芍药苷对照品储备液, 用甲醇配制成体积质量分数为 0.05mg/mL,0.105mg/mL,0.210mg/mL, 0.420mg/mL,1.05mg/mL,2.10 mg/ml 的对照品溶液, 在 2.1 色谱条件下进样, 记录其色谱峰并计算 回归方程 稳定性试验 取同一份中药制剂 蒲和饮, 分别于 0h,8h,12h,24h,48h 进样对其进行检测, 记录色谱图, 考察其 色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性. 以峰面积占总峰面积 5% 以上的峰的相对保留时间和相对 峰面积的 RSD 均在 % 以内作为判定标准, 即符合 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 ( 中国国家药品监 [8] 督管理局 ) 的规定 精密性试验 取同一份中药制剂 蒲和饮, 连续进样 5 次, 考察其色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性. 以峰面积占总峰面积 5% 以上的峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均在 % 以内作为标准 重复性试验 取中药制剂 蒲和饮 5 份, 在 2.1 的色谱条件下测定. 考察其色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的 一致性. 以峰面积占总峰面积 5% 以上的峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均在 % 以内作为标准.

3 第期 李 娇,等:防治奶牛隐性乳房炎中药制剂 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱研究 2.5 中药制剂 蒲和饮 HPLC 指纹图谱的测定 随机抽取 10 批中药制剂 蒲和饮 分别过 0.45μm 滤膜,装瓶,上机.在 2.1 的色谱条件下进样,每次 10μL,记录 5 mi n 内的色谱图.用相似度评价系统软件对该 10 批样本色谱峰的共有峰进行标定,进行相 似度评价,并用聚类分析法对结果进行分析. 结 果.1 蒲和饮 制剂 HPLC 指纹图谱方法学的考察结果.1.1 线性关系 ( 1)连翘苷线性关系 在2.1 色谱条件下进样,记录了其色谱峰.以峰面积( A)为纵坐标,以体积质量分数( C)为横坐标进行 回归分析.其线性方程为 A = 106 C R2 = / 表明连翘苷在 0 体积质量分数范围内与峰面积呈良好的线性关系( 图 1)..021~2.12 mg ml ( 2)咖啡酸线性关系 以峰面积( A)为 纵 坐 标,以 体 积 质 量 分 数 ( C)为 横 坐 标 对 咖 啡 酸 色 谱 峰 数 据 进 行 回 归 分 析.其 线 性方程为 A =4 107C R2 = / 表明咖啡酸在 0 体积质量分数范围内与峰面积呈良好的线性关系( 图 2)..0125~ mg ml 图 1 连翘苷对照品的标准曲线 图 2 咖啡酸对照品的标准曲线 ( )芍药苷线性关系 在2.1 色谱条件下 进 样,记 录 其 色 谱 峰.以 峰 面 积( A)为纵 坐 标,以 体 积 质 量 分 数 ( C:mg/mL)为 横 坐标进行回归分析.其线性方程为 A =1 107C R2 = 表明芍药苷在 0.05~2.10 mg/ml 体 积 质 量 分 数 范 围内与峰面积呈良好的线性关系(图 )..1.2 稳定性试验 各检测时间点峰面积占总 峰 面 积 5% 以 上 的 各 个 色谱峰相对 保 留 时 间 的 RSD 为 0.19% ~0.84%,相 对峰面积的 RSD 为 0.59% ~2.67%,均 在 % 以 内, 表明 蒲和饮 制剂稳定性好. 图 芍药苷对照品的标准曲线.1. 精密性试验 精密性试验中,5 次 进 样 图 谱 中 峰 面 积 占 总 峰 面 积 5% 以 上 的 各 个 色 谱 峰 相 对 保 留 时 间 的 RSD 为

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 6 卷 0.1%~0.54%, 相对峰面积的 RSD 为 0.45%~2.46%, 均在 % 以内, 表明仪器的精密度良好..1.4 重复性试验 重复性试验结果显示,5 份样品图谱峰面积占总峰面积 5% 以上的各个色谱峰相对保留时间的 RSD 为 0.24%~0.78%, 相对峰面积的 RSD 为 0.65%~2.82%, 均在 % 以内, 表明该方法重复性良好..2 中药制剂 蒲和饮 HPLC 指纹图谱的建立 将 10 批中药制剂 蒲和饮 在 2.1 的色谱条件下注入色谱仪后, 得到 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱 ( 图 4). 相似度评价软件对这 10 批中药制剂 蒲和饮 样品的 HPLC 图谱进行分析, 生成 蒲和饮 标准 对照图谱 R, 标定出 15 个共有色谱峰 ( 图 5). 其中 5 号色谱峰为咖啡酸,8 号色谱峰为芍药苷,15 号色 谱峰为连翘苷, 且各色谱峰保留时间分别与咖啡酸 芍药苷及莲翘苷 种对照品混合溶液 HPLC 图谱中 色谱峰的保留时间一致 ( 图 6). 各共有指纹峰的保留时间及峰面积的 RSD 均在 % 以内, 数字化信息详 见表 1. 表 1 蒲和饮 制剂 HPLC 指纹图谱 15 个共有指纹峰的保留时间和峰面积 编号 保留时间 S1 S2 S S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 保留时间平均峰面积 RSD/% 峰面积 RSD/% 图 4 10 个批次中药制剂 蒲和饮 的指纹图谱

5 第 期李娇, 等 : 防治奶牛隐性乳房炎中药制剂 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱研究 5 图 5 中药制剂 蒲和饮 HPLC 标准对照指纹图谱 图 6 咖啡酸 芍药苷及连翘苷 种对照品混合溶液 HPLC 图谱. 中药制剂 蒲和饮 HPLC 指纹图谱的相似度评价 用相似度评价软件对 蒲和饮 样品 (S1-S10) 的 HPLC 图谱进行相似度分析, 设定参照图谱, 将色谱峰 自动匹配, 并分别与该软件生成的标准对照图谱 R 比较, 得出所测样品的 HPLC 指纹图谱与对照图谱的相 似度均大于 0.914( 表 2). 表 2 10 批 蒲和饮 制剂 HPLC 指纹图谱与对照指纹图谱 R 的相似度 S1 S2 S S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 R S S S S S S S S S S R 中药制剂 蒲和饮 HPLC 指纹图谱的聚类分析 为了更多地利用中药指纹图谱包含的信息, 采用相似度计算的同时结合聚类分析来综合评价中药制 剂 蒲和饮 的质量. 将 10 批 蒲和饮 样品各个色谱图的共有峰面积做成 矩阵, 应用软件 SPSS

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 6 卷 对 10 批次样品进行相关系数聚类, 采用离差平方和法, 以欧氏距离为测度, 分析结果详见图 7. 当聚类 距离 L1=2 时, 样品聚为两类, 之后全部聚为一类, 即均为制剂 蒲和饮. 图 7 基于 HPLC 的中药制剂 蒲和饮 聚类分析结果 4 讨论 随着中药研究的现代化, 中药质控逐渐从对单一有效成分的分析转向对多种有效成分的研究. 鉴于 此,HPLC 指纹图谱正发展成为中药质量分析的常用手段之一. 中药制剂 蒲和饮 是含有咖啡酸 芍药苷 和连翘苷等多种有效成分的方剂. 据研究报道可知, 咖啡酸 芍药苷和连翘苷的最大吸收波长各不相同 [9], 为了使各有效成分色谱峰均得到较大的响应值, 且干扰峰较少, 本研究采用二极管阵列检测器对供试品进 行全波长扫描, 最终选择 26nm 作为检测波长. 本研究分别考察了甲醇 磷酸盐缓冲液 乙腈 磷酸盐缓 冲液为流动相时对供试品的分离效果, 结果显示乙腈 磷酸盐缓冲液的洗脱能力较甲醇 磷酸盐缓冲液的 强, 所得峰型较好, 无拖尾现象,40min 内可以使全部色谱峰流出, 且大部分峰得到较好的基线分离. 故 本试验选用乙腈 磷酸盐缓冲液作为流动相梯度洗脱. 共有峰 保留时间是 HPLC 指纹图谱的 2 个核心参数, 在 蒲和饮 制剂的 HPLC 指纹图谱中具有代表 性, 在与其他制剂的辨别中有较好的特征性, 可避免含相同成分的不同药物之间的误鉴. 它们的引入将复 [10-12] 杂的 HPLC 指纹图谱简化, 对中药质量作了数字化和具体化的描述. 本文采用中药指纹图谱相似度 评价软件对 10 批 蒲和饮 样品的指纹图谱色谱峰进行分析, 标定出 15 个共有峰作为中药制剂 蒲和饮 指 纹图谱的特征峰. 这些共有峰很好地抓住了中药制剂 蒲和饮 之间的共性, 构成了 蒲和饮 特有的指纹, 能被很好地区别于其他成分. 由 蒲和饮 制剂的 HPLC 指纹图谱与对照品的 HPLC 图谱比较, 可知 5,9, 15 号色谱峰保留时间分别与对照品图谱中的咖啡酸 芍药苷和连翘苷色谱峰的保留时间一致, 故认定 5,9, 15 号色峰对应的有效成分分别为咖啡酸 芍药苷和连翘苷. 本文有效地结合了中药指纹图谱相似度评价和 聚类分析两种方法检验不同批次 蒲和饮 制剂的 HPLC 指纹图谱, 结果无明显差异, 验证了本研究建立的 中药制剂 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱方法的可行性. 因此, 本研究建立的 HPLC 指纹图谱方法可用于中药 制剂 蒲和饮 的质量评价. 参考文献 : [1] 任德权. 中药质量控制的里程碑 中药指纹图谱 [J]. 中成药,2001,2(1):1. [2] 王丽峰, 彭敬东, 王宁. 高良姜药材高效液相指纹图谱研究 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版,2008,(6): 4-8. [] 邹亮, 彭镰心, 罗杰英, 等. 中药补阳还五汤的 HPLC 指纹图谱研究 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2009, 1(4): [4] 曾礼娜, 夏之宁, 颜磊. 槐米的高效毛细管电泳指纹图谱研究 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2008,0(1):

7 第 期李娇, 等 : 防治奶牛隐性乳房炎中药制剂 蒲和饮 的 HPLC 指纹图谱研究 [5] 杨树声. 连翘 HPLC 指纹图谱的建立及其化学模式识别研究 [J]. 西部中医药,2011,24(11):2-25. [6] 朱丹, 赵鑫, 徐俏, 等. 东北地区 11 种蒲公英 RP-HPLC 指纹图谱研究 [J]. 中国中药杂志,2011,6(7): [7] 邵建强. 中药指纹图谱的研究进展 [J]. 中草药,2009,40(6): [8] 中国兽药典委员会. 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 ( 暂行 )[J]. 中成药,2000,22(10): [9] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典 (2010 年版二部 )[M]. 北京 : 中国农业出版社,2011. [10] 谢培山. 中药色谱指纹图谱鉴别的概念 属性 技术与应用 [J]. 中国中药杂志,2001,26(10): [11] 蔡宝昌, 刘训红. 常用中药材 HPLC 指纹图谱测定技术 [M]. 北京 : 化学工业出版社,2005. [12] 刘超, 刘圆, 彭镰心. 白花丹药材 HPLC 指纹图谱的研究 [J]. 西南农业大学学报 : 自然科学版,2006,28(6): HPLCFingerprintofthe Puheyin Preparation LI Jiao 1, NIE Kui 1, SU Liang 2, HU Yuḻi 2, XIAO Rong 1, LU Xiaoḇing 1 1.SchoolofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2. ChongqingVeterinaryDrugsandFeedControlCenter,Chongqing401147,China Abstract:Objective:ToestablishtheHPLCfingerprintof Puheyin,aChinesemedicinepreparationagainstcowrecessivemastitis,andprovideasuitablemethodforitsqualitycontrol.Methods:TheoperationofgradientelutionwascarriedoutonAgilentC18column (250mm 4.6mm,5μm),withtheacetonitrile-NaH2PO4bufersolutionasthemobilephaseandwithaflowrateof1.0 ml/min,adetection wavelengthof26nmandacolumntemperatureof0.theresultingdatawereprocessedbythesofṯ ware SimilarityEvaluationSystemforChromatographicFingerprintofTCM publishedbygpc (Version 2004A).Results:The Puheyin activecomponents (cafeicacid,peoniflorinandforsythin)showeda goodlinearitybetween mg/ml, mg/mland mg/ml,respectively.thersdofstabilitytest,precisiontestandrepetitivenesstestresultswerelessthan%.fifteen consensuspeaksweremarkedinthehplcfingerprintof Puheyin andconsensusfingerprintwasestaḇ lished.thesimilarityindexbetween10samplestakenrandomlyandthestandardreferencefingerprintwas nolessthan0.914.conclusion:a methodof HPLCfingerprintfor Puheyin wasestablishedandthe HPLCfingerprintof Puheyin wasobtained. Keywords: Puheyin ;HPLC;fingerprint;similarityindex 责任编辑夏娟

8 8 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 6 卷

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