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1 中国广州分析测试中心 西药中有关物质检测 吴惠勤教授 ( 广州 ) 中国广州分析测试中心

2 中国广州分析测试中心 内容提要 一 有关物质概述二 有关物质常用分析方法三 有关物质的定量方法四 中广测有关物质测试服务介绍

3 中国广州分析测试中心 一 有关物质概述 杂质 : 任何影响药物纯度的物质统称为杂质 药品中 的杂质按其理化性质一般分为三类 : 有机杂质 无 机杂质及残留溶剂 有关物质 : 有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产 物等, 可能是已知的或未知的 挥发性的或不挥发 性的 由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类 似或具渊源关系, 故通常又可称之为有关物质 有关物质包括已知杂质和未知杂质

4 中国广州分析测试中心 化学药物杂质研究技术指导原则 杂质要求 附件 1: 原料药的杂质限度 最大日剂量报告限度鉴定限度质控限度 0.10% 或 1.0mg 0.15% 或 1.0mg 2g 0.05% ( 取最小值 ) ( 取最小值 ) >2g 0.03% 0.05% 0.05% 报告限度 (Reporting Threshold): 超出此限度的杂质均应在 检测报告中报告, 并应报告具体的检测数据 鉴定限度 (Identification Threshold): 超出此限度的杂质均 应进行定性分析, 确定其化学结构 质控限度 (Qualification Threshold): 质量标准中一般允许 的杂质限度, 如制订的限度高于此限度, 则应有充分的依据

5 中国广州分析测试中心 化学药物杂质研究技术指导原则 要求 附件 2: 制剂的杂质限度 报告限度 鉴定限度 质控限度 最大日剂量 1g >1g 限度 0.1% 0.05% 最大日剂量 <1mg 1mg-10mg >10mg-2g >2g 限度 1.0% 或 5μg ( 取最小值 ) 0.5% 或 20μg ( 取最小值 ) 0.2% 或 2mg ( 取最小值 ) 0.10% 最大日剂量 <10mg 10mg-100mg >100mg-2g >2g 限度 1.0% 或 50μg ( 取最小值 ) 0.5% 或 200μg ( 取最小值 ) 0.2% 或 3mg ( 取最小值 ) 0.15%

6 中国广州分析测试中心有关物质研究的重要意义 (1) 安全性的重要保证 关注毒性杂质 (2) 评价仿制药质量是否一致的关健指标之一 杂质的种类和数量不高于被仿制药 (3) 准确评价药品质量 杂质检查方法不合适或方法学验证不完善, 杂质检查不可靠, 则无法准确评价药品质量

7 中国广州分析测试中心 仿制药与被仿制药一致性要求 药学方面一致 ( 含量 结构 杂质 其它检查项等 ) 杂质的数量和种类低于被仿制药, 否则需要分析杂质的安全性并提供有关数据, 必要时应进行相关的安全性试验 建立杂质适宜的杂质检查方法用于判断一致性 用于工艺优化 去除杂质 考察稳定性 控制药物质量

8 中国广州分析测试中心有关物质研究的迫切性 国家药品安全 十二五 规划 在 主要任务和重点项目 项下明确提出, 全面提高仿制药质量 对 2007 年修订的 药品注册管理办法 施行前批准的仿制药, 分期分批与被仿制药进行质量一致性评价, 其中纳入国家基本药物目录 临床常用的仿制药在 2015 年前完成, 未通过质量一致性评价的不予再注册, 注销其药品批准证明文件 药品生产企业必须按 药品注册管理办法 要求, 将其生产的仿制药与被仿制药进行全面对比研究, 作为申报再注册的依据

9 中国广州分析测试中心二 有关物质常用分析方法 有机杂质的检测方法包括化学法 光谱法 色谱法等, 因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法 通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离 检测, 从而达到对杂质的有效控制 目前普遍采用的杂质检测方法主要有 : ⑴ 高效液相色谱法 (HPLC): 目前采用的分析方法主要以高效液相色谱法为主, 为常用的分析方法 选择不同的色谱柱对杂质进行有效的分离

10 中国广州分析测试中心 ⑵ 薄层色谱法 (TLC) 是色谱法中的一种, 是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术, 但准确性较低 ⑶ 气相色谱法 (GC) 气相色谱法主要是用于能气化的物质的检测和分离 一般用于有机残留溶剂的检测和分离 也可用于一些能挥发的杂质的检测

11 中国广州分析测试中心 (4) 色谱 - 质谱联用法 (LC-MS 或 GC-MS): 结合了色谱高分离能力和质谱高鉴别能力的优势, 能实现对含量极低的有关物质进行准确的定量和定性分析, 极大地提高了对未知杂质的定性鉴别能力, 且其样品前处理简单, 在有关物质检测与鉴别中应用越来越广泛, 还可为解析 有关物质的结构提供直接证据

12 中国广州分析测试中心二 有关物质的定量方法 1 外标法 ( 杂质对照品法 ) 方法 : 按各品种项下的规定, 精密称 ( 量 ) 取对照品和供试品, 配制成溶液, 分别精密取一定量, 注入仪器, 记录色谱图, 测量对照品和供试品待测成分的峰面积 ( 或峰高 ), 计算杂质含量 由于微量注射器不易精确控制进样量, 当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时, 以定量环进样为好 特点 : 定量比较准确, 但需要购齐杂质对照品

13 中国广州分析测试中心 2 加校正因子的主成分自身对照法 方法 : 测定杂质含量时, 按个品种项下规定的杂质限度, 将供试品溶液稀释成和规定中限度相当的溶液作为对照溶液, 进样, 调节仪器灵敏度, 使对照溶液的主成分峰高达满量程的 10%~25% 然后取供试品溶液和对照溶液适量, 分别进样, 供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的 2 倍, 测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积, 分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较, 依法计算各杂质含量 特点 : 应对校正因子进行严格测定, 仅适用于已知杂质的控制

14 中国广州分析测试中心 3 不加校正因子的主成分自身对照法方法 : 当没有杂质对照品时, 也可以采用不加校正因子的主成分自身对照法 同上述配制对照溶液并调节仪器灵敏度后, 取供试品溶液和对照溶液适量, 分别进样, 前者的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的 2 倍, 测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积, 并与对照溶液主成分的峰面积比较, 计算杂质含量 特点 : 前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同

15 中国广州分析测试中心 4 峰面积归一化法 方法 : 测定供试品中各杂质及杂质的总量限度采用不加校 正因子的峰面积归一法 计算各杂质峰面积及其总和, 并 求出占总峰面积的百分率 但溶剂峰不计算在内 色谱图 的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定, 为该 品种项下主成分保留时间的倍数 特点 : 简便快捷, 但因各杂质与主成分响应因子不一定相同 与主成分量不一定在同一线性范围内等因素, 所以在质量标准中采用有一定的局限性

16 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 1 专属性空白对照应无干扰, 主成分峰或需定量的杂质峰与其它峰应能完全分离, 分离度不得小于 检测限与定量限检测限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 3 定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 10 配 6 份最低定量限浓度的溶液, 所测 6 份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于 2.0%, 峰面积的相对标准差应不大于 5.0%

17 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 3 准确度对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证方法的准确度 : 杂质的限度为 0.2%, 可分别配制该杂质浓度为 0.1% 0.2% 和 0.3% 的杂质溶液各三份, 分别测定其含量, 将实测值与理论值比较, 计算回收率, 各浓度下的平均回收率均应在 80%-120% 之间 ; 杂质的浓度为定量限, 则该浓度下的平均回收率可在 70%-130%, 相对标准差应不大于 10%

18 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 4 精密度 适用与有定量要求的杂质检查 重复性配制 6 份杂质浓度 ( 一般为 0.1%) 相同的供试品溶液, 由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试, 所得 6 份供试液含量的相对标准差应不大于 15% 中间精密度配制 6 份杂质浓度 ( 一般为 0.1%) 相同的供试品溶液, 分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试, 所得 12 个含量数据的相对标准差应不大于 20%

19 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 5 线性 适用与有定量要求的杂质检查 在定量限至一定的浓度范围内配制 6 份浓度不同的供试液, 分别测定该杂质峰的面积, 计算相应的含量 以含量为横坐标 (X), 峰面积为纵坐标 (Y), 进行线性回归分析 可接受的标准为 : 回归线的相关系数 (R) 不得小于 0.990,Y 轴截距应在 100% 响应值的 25% 以内, 响应因子的相对标准差应不大于 10%

20 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 6 耐用性 分别考察流动相比例变化 ±5% 流动相 ph 值变化 ±0.2 柱温变化 ±5 检测波长变化 ±5nm 流速相对值变化 ±20% 以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时, 仪器色谱行为的变化, 每个条件下各测试两次 可接受的标准为 : 各杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0, 杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离 ; 各条件下的杂质含量数据 (n=6) 的相对标准差应不大于 2.0%, 杂质含量的绝对值在 ±0.1% 以内

21 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 7 系统适应性 适用与有定量要求的杂质检查 配制 6 份相同浓度的杂质溶液进行分析, 该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%, 保留时间的相对标准差应不大于 1.0% 另外, 杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0, 理论塔板数应符合质量标准的规定

22 中国广州分析测试中心有关物质的定量要求 8 溶液稳定性 按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液, 平行测定两次主成分与杂质的含量, 然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室 (4 ) 中, 在 和 7 天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量 可接受的标准为 : 主成分的含量变化的绝对值应不大于 2.0%, 杂质含量的绝对值在 ±0.1% 以内, 并不得出现新的大于报告限度的杂质 根据统计数据确定供试品溶液的保存条件及效期

23 中国广州分析测试中心 四 中广测有关物质测试服务介绍 1 依据 中国药典 具体品种有关物质项下的测定 : 按 中国药典 中的规定, 采用高效液相色谱法 气相色谱 法, 通过测定比较供试液和对照液的色谱峰面积, 测定药物中有 关物质相对于药物主成分的含量 此法测定的是各种有关物质的 总的相对含量, 不能鉴定有关物质的化学成分, 因此只作为制药 企业产品的日常质控 可提供的服务 中国药典方法实例 1: 甘露醇有关物质测定 ( 液相色谱法 ) 中国药典方法实例 2: 樟脑有关物质测定 ( 气相色谱法 )

24 中国广州分析测试中心甘露醇有关物质测定 ( 液相色谱法 ) 1 HPLC 测定条件 : 取系统适用性试验溶液 20μL 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 甘露醇峰与山梨醇色谱峰之间的分离度应大于 2.0 照高效液相色谱法( 附录 V D ) 试验, 用磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子钙型交换柱 ( 或分离效能相当的色谱柱 ), 以水为流动相, 流速为每分钟 0. 5ml, 柱温为 80, 示差折光检测器, 检测温度为 55, 取对照溶液 20μL 注人液相色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分色谱峰的峰高约为满量程的 30% ; 再精密量取供试品溶液和对照溶液各 20μL, 分别注人液相色谱仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的 2 倍

25 中国广州分析测试中心甘露醇有关物质测定 ( 液相色谱法 ) 2 样品制备: 取本品, 加水溶解并稀释制成每 1ml 中含 50mg 的溶液, 作为供试品溶液 ; 精密量取 1ml, 置 100ml 量瓶中, 用水稀释至刻度, 作为对照溶液 ; 另取甘露醇与山梨醇各 0. 5g, 置 100ml 量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 作为系统适用性试验溶液 ; 3 结果评定: 供试品溶液溶液的色谱图中如显杂质峰, 各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的 2 倍 ( 2.0%) 供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积 0.05 倍的峰可忽略不计

26 中国广州分析测试中心 系统性试验 : 甘露醇峰与山梨醇峰分离度 3.0, 大于药典规定的 2.0 RID1 A, Refractive Index Signal (R D) nriu 甘露醇 山梨醇 min

27 nriu 中国广州分析测试中心 RID1 A, Refractive Index Signal (R D) 对照溶液 min nriu RID1 A, Refractive Index Signal (R D) 甘露醇供试品溶液 min

28 中国广州分析测试中心樟脑有关物质测定 ( 气相色谱法 ) 1 GC 测定条件 : 照气相色谱法 ( 附录 V E) 试验, 以聚乙二醇 20M ( 或极性相近 ) 为固定液 ; 起始温度为 50, 维持 10 分钟, 以每分钟 2 的速率升温至 100, 再以每分钟 1 0 的速率升温至 200, 维持 10 分钟 ; 进样口温度为 220 ; 检测器温度为 250 ; 取系统适用性试验溶液 1μL 注人气相色谱仪,3, 7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇峰与乙酸龙脑酯峰的分离度应大于 2.0; 再取对照溶液注人气相色谱仪, 调节检测灵敏度, 使主成分峰高约为满量程的 20% ; 再精密量取供试品溶液和对照溶液各 1μL, 分别注人气相色谱仪 ;

29 中国广州分析测试中心樟脑有关物质测定 ( 气相色谱法 ) 2 样品制备: 取本品约 2. 5 g, 精密称定, 置 25ml 量瓶中, 加正庚烷溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液 ; 精密量取 1ml, 置 100ml 量瓶中, 用正庚垸稀释至刻度, 摇匀, 作为对照溶液 ; 另取 3, 7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇与乙酸龙脑酯各适量, 加正庚烷溶解并稀释制成每 l ml 中各约含 0. 5mg 的混合溶液, 作为系统适用性试验溶液 ; 3 结果评定: 供试品溶液如有杂质峰, 单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的 2 倍 (2.0%), 各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的 4 倍 (2.0%)

30 中国广州分析测试中心 对照溶液 樟脑供试品溶液

31 中国广州分析测试中心 可提供的服务 2 采用色 - 质联用技术对有关物质化学成分的鉴定 : 制药企业新研发或生产的药品在报批时, 国家药监 局要求药品研发和生产单位必须确定药物中有关杂质 的化学成分 通常要求用液相色谱 - 质谱法或气相色谱 - 质谱法进行鉴定, 明确有关物质的化学成分, 包含的 信息有 : 分子式 分子量 化学结构式 化学名称等 服务实例 : 头孢地尼有关物质鉴定 (LC-MS 法 )

32 中国广州分析测试中心头孢地尼有关物质鉴定 (LC-MS 法 ) 1 样品制备 : 取本品适量, 置棕色量瓶中, 加 20mM 乙酸铵 ( 乙酸调 ph5.5) 溶解, 并稀释制成每 1mL 约含 5.0mg/mL 的溶 液, 作为供试品溶液 ; 2 LC 测定条件 : 流动相 A: 20mM 乙酸铵 ( 乙酸调 ph5.5) (Buffer); 流动相 B:Buffer- 乙腈 - 甲醇 (50:30:20), 十八烷基硅 烷键合相色谱柱, 流速 0.6mL/min; 进样量 :20μL; 柱温 : 40 ; 检测波长 :254nm, 梯度洗脱 ( 洗脱条件省略 ) 3 质谱条件 : 电喷雾电离 (ESI), 正离子模式 干燥气 (N2) 温 度 :350ºC; 雾化气 (N2) 压力 :40.0psi; 干燥气 (N2) 流量 :10.0 L/min; 电喷雾电压 :3500V; 扫描范围 :m/z 250~1220

33 中国广州分析测试中心 头孢地尼 UV 图 头孢地尼 TIC 图

34 中国广州分析测试中心 主峰质谱图 杂质质谱图

35 中国广州分析测试中心 可提供的服务 3 综合 MS IR NMR 等方法法鉴定有关物质化学结构 : 制药企业如需确定有关杂质的化学结构, 则需要综合 LC-MS GC-MS,IR NMR 等进行结构解析

36 中国广州分析测试中心近年完成的有关物质定性报告 1 主要药物有: 头孢丙烯 头孢地嗪 头孢地尼 头孢噻肟 头孢甲肟 头孢孟多酯 头孢唑肟 头孢硫脒 硫普罗宁 法罗培南 美罗培南 西替利嗪 阿托伐他汀 舍曲林 氨曲南 克拉维酸 舒他西林 阿莫西林等 2 药品剂型包括胶囊 片剂 粉剂等

37 中国广州分析测试中心药物有关物质检测报告所含内容 有关物质的分子式 分子量 化学结构式 化学名称 检测方法及条件 内容详实, 编排合理符合药品评审中心送审要求频获客户好评 色谱和质谱的原始谱图

38 中国广州分析测试中心药物有关物质检测报告模板

39 中国广州分析测试中心服务案例 -1 头孢地尼 客户仿制药 - 剂型 A 仿制药 - 剂型 B 原研药

40 中国广州分析测试中心服务案例 -2 法罗培南钠 客户仿制药 -A 批仿制药 -B 批 日本原研药

41 中国广州分析测试中心服务案例 -3 阿托伐他汀钙 客户仿制药 -A 批次 仿制药 -B 批次 原研药 立普妥

42 中国广州分析测试中心服务案例 -3 阿托伐他汀钙 客户仿制用原料药 -A 测试条件客户仿制用原料药 -B

43 中国广州分析测试中心服务案例 -4 西替利嗪破坏性试验 酸破坏样品 碱破坏样品 氧化破坏样品

44 中国广州分析测试中心服务案例 -4 西替利嗪破坏性试验 西替利嗪成品辅料测试条件

45 中国广州分析测试中心 药物有关物质测试送检要求 1 填写委托单 : 按 中国药典 中采用色谱法测定有关物质含量的, 填写 一般样品分析检验委托登记表 ; 需采用液相色谱 - 质谱法鉴定有关物质的化学成分的, 填写 未知物剖析相关表格 以上相关表格可在本中心网站上 ( 下载 2 需要提供的样品及数量 : 送检单位需提供待测样品 500mg( 主成分含量 ) 以上, 对照品 10mg 3 需要提供的相关资料 : 送检单位需提供待测药物的合成路线, 国内外对该药物有关物质成分分析的报道等相关资料

46 中国广州分析测试中心 一 按照 中国药典 中规定的色谱方法测定有关物质 : 500 元 / 样品 5 个工作日 收费标准与服务周期 二 LC-MS 鉴定有关物质收费包括以下三个方面 : 1 液相色谱 - 质谱检测基本收费 :800 元 / 样品 ( 只含药物主成分测定, 不含有关物质成分测定 ) 2 提供检测方法条件 ( 药物有关物质的检测方法及其测定条件 ):1000 元 / 项 3 有关物质检测费用 ( 按杂质成分的个数计算 ):1000 元 / 成分 ; 只确定分子量 :300 元 / 成分 20 个工作日

47 中国广州分析测试中心 药品检测业务联系方式 联系人 : 吴惠勤教授地址 : 广州市越秀区先烈中路 100 号大院 34 号楼 (510070) 电话 : ; 传真 : 手机 : 邮箱 : @139.com 网址 :

48 中国广州分析测试中心

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