年第二期文稿

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1 抗感染药学 nti Infect Pharm 2012 June; 9(2) 夏振华, 等. 克林霉素磷酸酯及其有关物质 USP 测定方法优化的研究 115 OI: /j.issn 网络出版时间 : :31 网络出版地址 : 克林霉素磷酸酯及其有关物质 USP 测定方法的优化研究夏振华 *, 井凤鸣, 陈百科苏州第四制药厂有限公司, 江苏苏州摘要目的 : 通过优化的 USP 33 版中 HPL 方法研究与比较克林霉素磷酸酯及其有关物质测定结果方法 : 采用 HPL 法, 8 色谱柱 (5 μm,4.6 mm 250 mm), 柱温 40 ; 流动相采用 ph=5.6 的缓冲液 - 乙腈 - 甲醇的混合溶液梯度洗脱, 流速 1.2 ml/min, 检测波长 214 nm 结果 : 克林霉素磷酸酯主峰与其最邻近的有关物质, 以及各有关物质得到很好的分离 ; 主成分克林霉素磷酸酯在浓度 1.41~2.09 mg/ml 范围内与峰面积响应值呈良好线性关系, 平均回收率为 98.26%; 主要有关物质在下述浓度范围与峰面积响应值线性关系良好 ; 林可霉素 0.71~32.95 μg/ml, 平均回收率为 91.73%; 林可霉素磷酸酯 0.92~33.12 μg/ml, 平均回收率为 92.88%; 克林霉素磷酸酯 0.80~64.72 μg/ml, 平均回收率为 98.04%; 克林霉素 1.11~ μg/ml, 平均回收率为 97.50% 结论 : 优化后的方法比 USP 33 版中的方法分离能力更强, 基线较为平稳, 更能准确测定克林霉素磷酸酯及有关物质的量关键词克林霉素磷酸酯 ; 有关物质 ;HPL 法 ; 优化中图分类号 R 文献标志码文章编号 (2012) Studies on Optimization for USP etermination Method of lindamycin Phosphate and Its Related Substances STRT XI Zhen-hua *,JING Feng-ming,HEN ai-ke Suzhou No.4 Pharmaceutical factory o.,ltd,suzhou Jiangsu ,hina Objective:To study and to compare the determination of clindamycin phosphate and its related substances through the optimization of the USP 33 edition of HPL method. Methods: HPL method was used with 8(250 mm 4.6 mn, 5 μ m) column and a mobile phase was gradient elution using the mixture of ph 5.6 buffer solution acetonitrile and methanol, the column temperature was at 40, flow rate was 1.2 ml/min and the detection wavelength was 214 nm. Results: The good separation of clidamycin phosphate and its relevant materials was obtained. The linear response range of clindamycin phosphate was between 1.41 and 2.09 mg/ml and the average recovery was 98.26%; the linear response range of lincomycin was between 0.71 and μg/ml and average recovery was 91.73%; the linear response range of lincomycin phosphate wasbetween 0.92 and μg/ml and average recovery was 92.88%; the linear response range of clindamycin phosphate was between 0.80 and μg/ml and average recovery was 98.04%; the linear response range of clindamycin was between 1.11 and μg/ml and average recovery was 97.50%. onclusion: The separation results show that the optimization method possess a stronger enantioselectivity than USP 33 edition method, the baseline is more stable and the amount of clidamycin phosphate and its related substances can be accurately detected. KEY WORS clindamycin phosphate; related substances; HPL; optimization [nti Infect Pharm,2012,9(2):115~119] 克林霉素磷酸酯 (clindamycin phosphate) 又称 [1] 克林霉素 -2- 磷酸酯, 是以盐酸林可霉素为起始物料的半合成抗菌药物, 具有良好的吸收性, 被广泛应用于临床其合成过程产生的主要杂质有林可霉素磷酸酯克林霉素磷酸酯克林霉素 7- 表克林霉素磷酸酯克林霉素 -3- 磷酸酯以及其他未知杂质由于林可霉素常常出现在克林霉素磷酸酯原料药中, 故将其作为有关物质一并讨论, 而其中 7- 表克林霉素磷酸酯和克林霉素 -3- 磷酸酯正处在分离纯化阶段, 故暂将其视作未知杂质现行美国药典 (USP) 33 版采用 HPL 法测定克林霉素磷酸酯及有关物 [2] 质的量, 但克林霉素磷酸酯主峰与其邻近的杂质峰作者简介 : * 夏振华 (1965-), 男, 高级工程师联系电话 : xiazhenhua8@yahoo.com.cn

2 116 ISSN /N /R nti Infect Pharm 抗感染药学 2012 June; 9(2) 分离度较差, 出峰重合, 影响检测结果的选择度和准确度笔者参照 USP 33 版中有关克林霉素磷酸酯及其有关物质 HPL 测定方法, 通过调整流动相的 ph 值, 按照 IH [3] 要求进行了方法学考察, 测定了主要有关物质的响应因子, 并将其测定结果与 USP 33 版法作了比较 1 仪器与试药 L-20 型高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司 ) ( 包括 : 四元泵自动进样器 SP-20 型检测器 L-solution 工作站 );1200 型高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦公司 )( 包括 : 四元泵自动进样器 VW 检测器 chemstation 工作站 );P211 型电子天平 ( 十万分之一,Sartorius 公司 ) 供试品 : 克林霉素磷酸酯 ( 批号 :SPT , SPT , SPT , SPT , SPT , 苏州第四制药厂有限公司 ) 对照品 : 克林霉素磷酸酯盐酸林可霉素盐酸克林霉素克林霉素磷酸酯 ( 苏州第四制药厂有限公司自制作为工作标准品 ); 林可霉素磷酸酯 ( 美国某公司提供 ); 乙腈甲醇 (HPL 级, 美国 TEI 公司生产 ); 磷酸氨水 ( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司生产 ) 2 方法与结果 2.1 对照品溶液及供试品溶液的制备对照品溶液精密称取克林霉素磷酸酯对照品 22 mg, 倾入 10 ml 容量瓶中, 按流动相的配制项下的稀释剂稀释至刻度, 超声处理 5 min 使其完全溶解, 得对照品溶液 ( 以下称液 ) 供试品溶液 -1 精密称取克林霉素磷酸酯供试品 22 mg, 倾入 10 ml 容量瓶中, 按流动相的配制项下的稀释剂稀释至刻度, 超声处理 5 min 使其完全溶解, 得供试品溶液 -1( 以下称液 ) 供试品溶液 -2 精密称取克林霉素磷酸酯供试品 22 mg, 倾入 10 ml 容量瓶中, 加入一定量的盐酸林可霉素林可霉素磷酸酯克林霉素以及盐酸克林霉素对照品, 按流动相的配制项下的稀释剂稀释至刻度, 超声处理 5 min 使其完全溶解, 得供试品溶液 -2( 以下称液 ) 流动相的配制 ⑴ 缓冲液 : 取 14 ml 磷酸加入 ml 纯化水中, 加氢氧化铵溶液, 调节溶液至 ph=5.6;⑵ 有机溶液 : 取乙腈和甲醇按体积 (9 1) 混合均匀 ;⑶ 稀释剂 : 取上述缓冲液和有机溶液按体积 (8 2) 混合均匀 ;⑷ 溶液 -: 取缓冲液和有机溶液按体积 ( ) 混合均匀 ;⑸ 溶液 -: 取缓冲液和有机溶液按体积 ( ) 混合均匀克林霉素磷酸酯及有关物质的测定梯度洗脱情况, 见表 1 时间 (t/min) 0 0~40 40~41 41~ 色谱条件采用 HPL 法, 8 色谱柱 5 μm,4.6 mm 250 mm); 柱温 40 ; 紫外检测波长 214 nm; 流速 1.2 ml/min; 进样量 20 μl 在以上色谱条件下, 克林霉素磷酸酯理论塔板数为 , 与其最邻近峰的分离度为方法学考察表 1 梯度洗脱程序专属性取对照品按 2.2 色谱条件项下的方法进行分离检测, 并用对照品 ( 盐酸林可霉素林可霉素磷酸酯克林霉素磷酸酯盐酸克林霉素 ) 分别对各杂质峰进行定位结果表明该色谱条件测定专属性良好, 克林霉素磷酸酯主峰与其最邻近的杂质峰完全分离 ( 分离度 R>2) 克林霉素磷酸酯及其有关物质的 HPL 色谱图情况, 见图溶液 - (%) E F 溶液 - (%) 溶液稳定性试验取供试品溶液 -2 项下液, 分别于 0,4,8,12,24,32,44,48 h 时测定, 按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 记录色谱图, 计算克林霉素磷酸酯及有关物质的质量每次应取对照品溶液项下液同法测定, 用于校正不同时间测定仪器导致的误差其 8 次测试结果的 RS 分别为 : 克林霉素磷酸酯为 0.36%, 林可霉素为 0.51%, 林可磷酸酯 RS 为 1.20%, 克林霉素磷酸酯 RS 为 0.40%, 克林霉素 RS 为 5.50% 表 G H I 备注平衡线性梯度线性梯度平衡注 :. 林可霉素磷酸酯 ;. 林可霉素 ;. 未知杂质 ;. 克林霉素磷酸酯 ;E. 未知杂质 ;F. 未知杂质 ;G. 克林霉素磷酸酯 ;H. 未知杂质 ;I. 克林霉素图 1 克林霉素磷酸酯及有关物质的 HPL 色谱图

3 ISSN /N /R nti Infect Pharm 抗感染药学 2012 June; 9(2) 117 明 48 h 内克林霉素磷酸酯溶液稳定性良好最低检测限 (LO) 与最低定量限 (LOQ) 试验取供试品溶液 -2 项下液用流动相的配制项下的稀释剂进行适当稀释后按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 记录色谱图, 直至各色谱峰峰高响应值 ( H) 约为基线噪音的 10 倍和 3 倍根据此时进样溶液的浓度计算各有关物质的 LOQ 和 LO 结果显示 : 林可霉素 LOQ 为 0.71 μg/ml,lo 为 0.25 μg/ ml; 林可磷酸酯 LOQ 为 0.92 μg/ml,lo 为 0.32 μg/ ml; 克林霉素磷酸酯 LOQ 为 0.80 μg/ml,lo 为 0.28 μg/ml; 克林霉素 LOQ 为 1.11 μg/ml,lo 为 0.39 μg/ml 线性和范围精密称取一定量的克林霉素磷酸酯对照品, 配制成 5 种不同质量浓度的溶液 : 1.41,1.57,1.77,1.88,2.09 mg/ml 按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 记录峰面积响应值 () 结果表明 : 克林霉素磷酸酯在 1.41~2.09 mg/ml 浓度范围内, 质量浓度 (ρ) 与峰面积响应值 () 呈良好线性关系, 回归方程为 ρ= (r 2 = ) 配制 5 种不同质量浓度, 分别含 4 种有关物质 ( 林可霉素林可霉素磷酸酯克林霉素磷酸酯和克林霉素 ) 的溶液, 并以该物质 LOQ 为起始浓度按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 记录峰面积响应值 () 结果表明 : 在下述范围内, 各有关物质 ( 林可霉素在 0.71~32.95 μg/ml, 林可霉素磷酸酯在 0.92~ μg/ml, 克林霉素磷酸酯在 0.80~64.72 μg/ ml, 克林霉素在 1.11~32.91 μg/ml) 的质量浓度 (ρ) 与峰面积响应值 () 线性关系良好, 回归方程分别为 : 林可霉素 ρ= (r 2 =0.9997); 林可霉素磷酸酯 ρ= (r 2 = ); 克林霉素磷酸酯 ρ= (r 2 = ); 克林霉素 ρ= (r 2 = ) 精密度试验取供试品溶液 -2 项下液, 按 2.2 色谱条件项下的方法操作, 连续进样 6 次, 记录色谱图, 计算克林霉素磷酸酯及有关物质的质量结果显示 : 克林霉素磷酸酯 RS 为 0.44%, 林可霉素 RS 为 0.00%, 林可霉素磷酸酯 RS 为 0.78%, 克林霉素磷酸酯 RS 为 0.40%, 克林霉素 RS 为 3.30% 表明该方法精密度良好中间精密度试验由另一分析人员在次日重新配制液, 并采用另一台仪器, 按 2.2 色谱条件项下的方法操作, 连续进样 6 次, 记录色谱图, 计算克林霉素磷酸酯及有关物质的质量结果显示 : 克林霉素磷酸酯 RS 为 0.35%, 林可霉素 RS 为 2.40%, 林可霉素磷酸酯 RS 为 3.10%, 克林霉素磷酸酯 RS 为 0.40%, 克林霉素 RS 为 8.90% 表明该方法中间精密度良好回收率试验精密称取克林霉素磷酸酯供试品 11 mg 倾入 10 ml 容量瓶中 ( 共 9 份 ), 分别加入 3 组不同质量浓度的克林霉素磷酸酯溶液, 各浓度平行 3 份按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 记录色谱图, 计算克林霉素磷酸酯回收率结果显示克林霉素磷酸酯回收率为 98.04% 精密称取克林霉素磷酸酯供试品 22 mg, 倾入 10 ml 容量瓶中, 加入 3 种含有不同质量浓度的 4 种有关物质 ( 林可霉素林可霉素磷酸酯克林霉素磷酸酯和克林霉素 ) 的溶液, 以该有关物质 LOQ 为起始浓度, 每一浓度配制 3 份按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 记录色谱图, 计算该 4 种物质的回收率, 结果显示 : 林可霉素为 91.73%, 林可霉素磷酸酯为 92.88%, 克林霉素磷酸酯为 98.04%, 克林霉素为 97.50% 表明该方法的回收率在 90% 以上方法耐用性试验在 2.2 色谱条件项下方法的基础上做微小变动, 改变流动相 ph 值 ( 为 5.5, 5.7) 流速 ( 为 1.1,1.3 ml/min) 和柱温 ( 为 38, 42 ) 取供试品溶液 -2 液, 按照上述变动后的条件分别按 2.2 色谱条件项下的方法连续测定, 进样 6 次, 记录色谱图, 计算条件变动前后克林霉素磷酸酯及有关物质的 RS% 结果表明: 该检测方法流动相 ph 在 5.5~5.7, 流速在 1.1~1.3 ml/min, 柱温在 38~42 均可适用, 对检测结果没有明显影响其方法耐用性测试情况, 见表 2 表 2 改变流动相条件后耐用性测试结果物质的名称克林霉素磷酸酯林可霉素林可霉素磷酸酯克林霉素磷酸酯克林霉素 RS(%) ph 5.5 ph ml/min 1.3 ml/min

4 118 ISSN /N /R nti Infect Pharm 抗感染药学 2012 June; 9(2) 有关物质的校正因子 (RRF) 试验精密称取克林霉素磷酸酯供试品约 22 mg, 倾入 10 ml 容量瓶中, 加入 5 种不同浓度的 4 种有关物质 ( 林可霉素林可霉素磷酸酯克林霉素磷酸酯和克林霉素 ) 的溶液, 以该有关物质 LOQ 为起始浓度按 2.2 色谱条件项下的方法进样, 每一质量浓度连续测试, 进样 3 次, 记录色谱图以该有关物质的加入量为 x 轴, 测得量为 y 轴, 得回归方程 ( 斜率的倒数即为 RRF) 计算如下 : 林可霉素 y= x (r 2 = ,RRF=0.51); 林可霉素磷酸酯 y= x (r 2 = ,RRF=0.83); 克林霉素磷酸酯 y= x (r 2 = ,RRF=1.16); 克林霉素 y= x (r 2 =1,RRF=0.92) 2.4 优化后方法与美国药典法测试结果的比较取供试品 ( 批号 :SPT ,SPT , SPT ,SPT ,SPT )5 批次, 按供试品溶液 -1 项下液, 分别按美国药典 (USP 33 版 ) 方法和本实验优化后的方法操作, 进样, 记录色谱图并分别计算供试品中克林霉素磷酸酯及有关物质的质量美国药典 (USP 33 版 ) 方法和新法测试情况, 见表 3 3 讨论克林霉素磷酸酯是以发酵产品盐酸林可霉素为起始原料经过多步合成制得, 由于主结构有 4 个活性强弱不同的 OH 基团, 合成过程中会产生不同位置的杂质 ( 如 3- 克林霉素磷酸酯 ), 而合成需要表 3 新法与美国药典法测试结果样品批号 SPT SPT SPT SPT 测试项目 *1 检测结果优化后的方法 USP 33 版方法偏差 * * * *2

5 ISSN /N /R nti Infect Pharm 抗感染药学 2012 June; 9(2) 119 续表 3 优化后的方法与美国药典法测试结果样品批号 SPT 测试项目 *1 检测结果优化后的方法 USP 33 版方法偏差 *2 注 : *1 为未检出 ; 为不适用 ; 为小于定量限 ; *2 克林霉素磷酸酯含量为相对偏差, 其余均为绝对偏差加温, 且在强酸性条件下, 反应时间较长, 也容易产生多种立体异构体 ( 如 7- 表克林霉素磷酸酯等 ) 及其各类聚合物此外, 克林霉素磷酸酯稳定性不好, 特别在碱性条件下产生降解产物 ( 如克林霉素林可霉素磷酸酯 ), 所以克林霉素磷酸酯有关物质种类多, 不同生产工艺, 产品质量 ( 特别是有关物质 ) 参差不齐, 从工艺质量标准及检测方法控制其质量显得尤为重要由于克林霉素有关物质种类多 [4-6], 如果采用恒度洗脱, 不能很好兼顾到容量因子很小的和容量因子很大的各有关物质的分离, 所以本法采用和 USP 相同的梯度洗脱, 大胆改动缓冲液的 ph 值的方法, 使各有关物质得到很好分离, 而且基线较为平稳改动 ph 值后克林霉素磷酸酯及其有关物质 HPL 色谱图与美国 USP 33 版的色谱图, 见图 2, E F G 注 :. 未知杂质 ;. 克林霉素磷酸酯 ;. 未知杂质 ;. 未知杂质 ; E. 未知杂质 ;F. 克林霉素磷酸酯 ;G. 未知杂质 ;H. 克林霉素图 2 克林霉素磷酸酯典型 HPL 图谱 ( 改进方法 ) 由于克林霉素磷酸酯没有紫外特征吸收, 只有末端吸收, 所以采用 214 nm 低波长检测这一波长接近于有机溶剂波长截止, 是基线漂移和产生鬼峰的主要原因, 所以流动相的水和乙腈质量非常重要, 同时也对仪器的污染程度非常敏感本法通过调整流动相 ph 值, 即可使各色谱峰得到非常好的 H E F 注 :. 克林霉素磷酸酯 ;. 未知杂质 ;. 未知杂质 ;. 未知杂质 ; E. 克林霉素磷酸酯 ;F. 克林霉素图 3 克林霉素磷酸酯典型 HPL 图谱 (USP 33 版 ) 分离而且基线比较平稳, 鬼峰 (ghost peak) 明显减少, 减轻了基线漂移, 有助于测定的准确性通过两种方法的测试供试品各种指标的结果 ( 表 3) 显示优化后的方法测试克林霉素磷酸酯及其有关物质的各种指标接近于美国药典 (USP 33 版 ) 参考文献 [1] 夏振华, 毛彩娟, 韩新丰, 等. HPL 法测定克林霉素磷酸酯及其有关物质的方法学研究 [J]. 药物分析杂志,2002,22 (4): [2] 徐丽萍, 吴嵘, 翁志斌. 克林霉素磷酸酯原料中 N,N- 二甲基酰胺测定的方法学考察 [J]. 抗感染药学,2012,9(1): [3] The United States Pharmacopeial onvention.usp33- NF28[S] [4] International onference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of nalytical Procedures: Test and Methodology[M] [5] 李悦, 吴彤, 陈述增, 等. 克林霉素磷酸酯原料药杂质的分离和结构鉴定 [J]. 药学学报,2010,45(11): [6] 陈述增, 李悦, 吴彤. 克林霉素磷酸酯降解产物的 L-MS 研究 [J]. 中国医药工业杂志,2009,40(9): ( 收稿日期 : 修回日期 : ) ( 责任编辑 : 丁龙其 )

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.