外用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子凝胶 Waiyong Chongzu Ren Lixibao Jushixibao Cijiyinzi Recombinant Granulocyte / Macrophage Colony- stimulating Factor Gel for External U
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- 显昙 湛
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1 外用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子凝胶 Waiyong Chongzu Ren Lixibao Jushixibao Cijiyinzi Recombinant Granulocyte / Macrophage Colony- stimulating Factor Gel for External Use C 639 H 1003 O 196 N 171 S 8 Mr Da 本品系由含有可高效表达人粒细胞巨噬细胞刺激因子 ( 简称人粒细胞巨噬细胞刺激因子 ) 基因的大肠杆菌, 经发酵 分离和高度纯化后获得的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子, 加入凝胶基质制成 含适宜稳定剂 防腐剂, 不含抗生素 1 基本要求生产和检定用设施 原材料及辅料 水 器具 动物等应符合 凡例 的有关要求 2 制造 2.1 工程菌菌种 名称及来源重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子工程菌株系具有表达人人粒细胞巨噬细胞刺激因子基因的大肠杆菌菌株 人粒细胞巨噬细胞刺激因子 cdna 由人工合成 种子批的建立 传代及保存应符合 生物制品生产检定用菌毒种管理规程 的规定 菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面的检定 划种 LB 琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态, 无其他杂菌生长 染色镜检应为典型的革兰氏阴性杆菌 对抗生素的抗性应与原始菌种相符 电镜检查 ( 工作种子批可免做 ) 应为典型大肠杆菌形态, 无支原体 病毒样颗粒及其他微生物污染 生化反应应符合大肠杆菌生化反应特性
2 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子表达量在摇床中培养, 应不低于原始菌种的表达量 质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符 目的基因核苷酸序列检查 ( 工作种子批可免做 ) 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符 2.2 原液 种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基 ( 含适量四环素 ) 中培养 发酵用培养基采用适宜的不含抗生素的培养基 种子液接种及发酵培养 在灭菌培养基中接种适量种子液 在适宜的温度下进行发酵, 应根据经批准的发酵工艺进行, 并确定相应的发酵条件, 如温度 ph 值 溶解氧 补料 发酵时间等 发酵液应定期进行质粒丢失率检查 ( 通则 3406) 发酵液处理用适宜的方法收集 处理菌体 初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化, 使其纯度达到规定的要求 高度纯化经初步纯化后, 采用经批准的纯化工艺进行高度纯化, 使其达到 3.1 项要求, 加入适宜稳定剂, 过滤后即为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子原液 如需存放, 应规定时间和温度 原液检定按 3.1 项进行 2.3 半成品采用的基质应符合凝胶剂基质要求 ( 通则 0114) 配制应按经批准的配方进行 凝胶制备应按经批准的工艺进行 凝胶应均匀 细腻, 在常温时保持胶状, 不干涸或液化 半成品检定按 3.2 项进行 2.4 成品 分批应符合 生物制品分批规程 规定 分装
3 应符合 生物制品分装和冻干规程 及通则 0114 有关规定 规格 100μg rh GM-CSF /10g/ 支 包装应符合 生物制品包装规程 及通则 0114 有关规定 3 检定 3.1 原液检定 生物学活性依法测定 ( 通则 3526) 量取胎牛血清 (FBS)100ml 1mol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES) 10ml 10 4 IU/ml 青链霉素溶液 10ml, 加入 RPMI 1640 培养液 880ml 中, 摇匀,2~8 保存, 作为基础培养液 ; 取基础培养液加 1% 谷氨酰胺 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每 1ml 含 5ng, 作为完全培养液 ; 以二甲亚砜为裂解液 ; 在 96 孔细胞培养板中, 每孔分别留 100μl 标准品溶液 / 供试品溶液 ; 向加有标准品溶液和供试品溶液的 96 孔细胞培养板中加入每 1ml 含 ~ 个细胞的细胞悬液, 培养 40~52 小时 ; 每孔加入 MTT 溶液后培养 4~5 小时 蛋白质含量依法测定 ( 通则 0731 第二法 ) 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比, 每 1mg 蛋白质应为 ~ IU 纯度 电泳法依法测定 ( 通则 0541 第五法 ) 用非还原型 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法, 分离胶胶浓度为 15%, 加样量应不低于 10μg( 考马斯亮蓝 R250 染色法 ) 或 5μg( 银染法 ) 经扫描仪扫描, 纯度应不低于 95.0% 高效液相色谱法取本品, 加流动相稀释制成每 1ml 中含 1mg 的溶液作为供试品溶液 照高效液相色谱法 ( 通则 0512) 试验, 用适合分离分子质量为 5~60kD 蛋白质的色谱用凝胶为填充剂 ; 以 0.1mol/L 磷酸盐 -0.1mol/L 氯化钠缓冲液 ( 取磷酸氢二钠 10.3g 磷酸二氢钠 3.36g 与氯化钠 2.92g, 加水 1000ml 使溶解, 调节 ph 值为 7.0) 为流动相 ; 检测波长为 280nm 精密量取供试品溶液 50μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以人粒细胞巨噬细胞刺激因子色谱峰计算的理论板数应不低于 1500 按面积归一化法计算, 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子主峰面积应不低于总面积的 95.0% 相关蛋白质取本品适量, 加 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 (ph7.0)( 取磷酸二氢钾 2.65g 与磷酸氢二钠 10.91g, 加水 750ml 溶解, 用磷酸调节 ph 值至 7.0, 用水稀释至 1000ml) 稀释制成每 1ml 中含重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子 0.5mg 的溶液, 作为供试品溶液 取重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子对照品与人或牛血清白蛋白适量, 加 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 (ph7.0) 稀释
4 制成每 1ml 中均含 0.1mg 的溶液, 作为系统适用性溶液 照高效液相色谱法 ( 通则 0512) 测定, 用丁基硅烷键合硅胶为填充剂 ( mm, 孔径 300Å); 以 0.1% 三氟醋酸水溶液为流动相 A, 以 0.1% 三氟醋酸 90% 乙腈溶液为流动相 B; 流速为每分钟 1.2ml; 检测波长为 214nm 按下表进行梯度洗脱 取系统适用性溶液 100μl, 注入液相色谱仪, 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子主峰与牛血清白蛋白峰之间的分离度应不小于 2, 连续进样 4 次, 主峰峰面积的相对标准偏差应不大于 1.5% 取供试品溶液 100μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子峰的保留时间约为 22 分钟 按峰面积归一化法计算保留时间为 5~30 分钟的相关蛋白峰面积, 单个相关蛋白峰面积不得大于 1.5%, 总相关蛋白质不得大于 4% 时间 ( 分钟 ) 流动相 A(%) 流动相 B(%) 分子量依法测定 ( 通则 0541 第五法 ) 用还原型 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法, 分离胶胶浓度为 15%, 加样量应不低于 1.0μg, 制品的分子质量应为 14.5kD±1.4kD 外源性 DNA 残留量每 1 次人用剂量应不高于 10ng( 通则 3407) 宿主菌蛋白质残留量应不高于蛋白质总量的 0.10%( 通则 3412) 残余抗生素活性依法测定 ( 通则 3408), 不应有残余四环素活性 等电点主区带应为 4.7~5.7, 且供试品的等电点图谱应与对照品一致 ( 通则 0541 第六法 ) 紫外光谱取本品适量, 加水或 0.7% 氯化钠溶液稀释至每 1ml 约含 100~500μg 的溶液, 在光路 1cm 波长 230~360nm 下进行扫描, 最大吸收峰波长应为 279±3nm( 通则 0401) 肽图依法测定 ( 通则 3405), 应与对照品图形一致 N 端氨基酸序列 ( 至少每年测定 1 次 ) 用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定, N 端序列应为 : Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Thr-Gln-Pro-Trp-Glu-His 3.2 半成品检定 无菌检查
5 依法检查 ( 通则 1101), 应符合规定 3.3 成品检定 鉴别试验按免疫印迹法 ( 通则 3401) 或免疫斑点法 ( 通则 3402) 测定, 应为阳性 物理检查 外观应为微黄色透明凝胶 装量依法检查 ( 通则 0114), 应符合规定 均匀性取样品 3 支, 分别称取 0.5g 置 1ml 离心管中, 每分钟 转离心 30 分钟, 应无分层及沉淀 化学检定 ph 值取本品 1.0g, 加水 20ml, 搅拌均匀, 依法测定 ( 通则 0631),pH 值应为 6.0~ 对羟基苯甲酸甲酯含量取本品适量, 加流动相溶解并稀释制成每 1ml 中含对羟基苯甲酸甲酯 1μg 的溶液, 作为供试品溶液 照高效液相色谱法 ( 通则 0512) 测定, 用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂 ; 以甲醇 -1% 冰醋酸 (60:40) 为流动相 ; 检测波长为 254nm 取供试品溶液 20μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图 ; 另取对羟基苯甲酸甲酯对照品适量, 同法测定 按外标法以峰面积计算, 对羟基苯甲酸甲酯含量应为 0.105%~0.195% 聚山梨酯 80 含量称取凝胶 0.05g 于离心管中, 依法测定 ( 通则 3203), 含量应为 0.07%~0.13% 生物学活性按 项进行 供试品生物学活性应为标示量的 80%~150% 无菌检查依法检查 ( 通则 1101), 应符合规定 4 保存 运输及有效期于 2~8 避光密闭贮藏和运输 自生产之日起, 按批准的有效期执行 5 使用说明应符合 生物制品包装规程 规定和批准的内容 起草单位 : 广东省药品检验所联系方式 : 复核单位 : 吉林省药品检验所
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