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1 人参皂苷的 UHPLC 新方法的开发 应用 液相色谱 ; 超高效液相色谱 ; 自动方法开发系统及方法筛选 ; 人参皂苷 作者 安蓉邢占磊李浪肖尧 * 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司液相色谱应用部, 北京 摘要 目的 : 使用带有自动方法开发 / 色谱柱筛选功能的超高效液相色谱 (UHPLC) 系统对于人参皂苷类成分的适宜分离条件进行快速筛选及探索, 并在此基础上优化得到快速高效重现性良好的定性定量分析方法 方法 : 使用自动方法开发系统对分离条件进行筛选和优化 后, 得到两种基于不同选择性条件的最终方法, 方法 1, 色谱柱 :Agilent Zorbax Bonus RP (3.0 x 50 mm,1.8 µm), 柱温 25 C, 流动相为超纯水 (A)- 乙腈 (B), 梯度分析, 流速 1.0 ml/min, 检测波长 203 nm; 方法 2, 色谱柱 :Agilent Zorbax SB-C18(3.0 x 150 mm,1.8 µm), 柱温 50 C, 流动相为超纯水 (A)- 乙腈 (B), 梯度分析, 流速 0.6 ml/min, 检测波长 203 nm 结果 : 使用上述两个方法对标准品和样品进行了分析, 所需分析时间均小于 10 分钟, 重现性良好, 保留时间 RSD < 0.2%, 峰面积 RSD < 1.0%, 样品中的干扰成分与被测成分均可以得到良好分离 结论 : 两种方法分析快速切分离度良好, 能够充分发挥 UHPLC 的分离能力, 适合于含有人参皂苷类成分的药材及制剂的分析 Agilent 的方法筛选软件可以快速 无人照管地选择最佳的色谱柱 色谱条件 ; 使方法开发的步骤更趋系统化, 更为合理

2 前言 人参皂苷 (Ginsenoside) 是一种固醇类化合物, 三萜皂苷 主要存在于人参属药材中 人参皂苷被视为是此类药材中的活性成分, 具有增加白细胞数量 提高人体免疫力 促进物质代谢 抗疲劳 抗衰老等作用 [1], 使用液相色谱方法分析此类成分是控制人参 三七等药材或含此类活性成分药品的重要手段, 但是相关样品中的人参皂苷一般需要很长的分析时间, 例如 : 中国药典的方法需要大概 90 至 120 分钟时间 [2] UHPLC 技术的出现可以使液相色谱分析时间大为缩短, 在不损失分离度的情况下大幅提高分析速度, 目前已经广泛应用于中药分析领域 在分析方法的开发过程中, 通过改变色谱柱的种类, 柱温等条件可以改变分离选择性, 从而对较难分离的化合物进行更好的分析, 在人参皂苷的分析中,Re 及 Rg1 是一对比较难分离的成分, 通常需要比较长时间 ( 大概 20 分钟 [3]) 的等度或缓梯度先把这两个化合物分开, 但是这会严重影响分析速度, 延长分析时间 在这篇文章中, 我们使用了基于 Agilent 公司的 1260 或 1290 超高效液相色谱系统的自动方法开发系统及软件 [3] 对色谱柱和其他分析条件进行了自动筛选, 并从中选出最适合人参皂苷分析的色谱柱及相应分析条件, 并在此基础上进行改进和优化, 最终得到了两个基于不同选择性特性的高效快速的分析方法, 可分别用于不同的分析目的 通过这个研究, 我们找到了人参皂苷在不同色谱柱上的色谱行为差异 ; 同时也为类似的方法开发工作推荐一个有用的工具 仪器试剂及色谱条件 仪器和试剂 Agilent 1290 Infinity 自动方法开发系统, 包括 :1290 色谱泵 自动进样器 两个柱温箱 ( 均配置 8 位 9 通阀 ) 组成的柱温箱簇 二极管阵列检测器 ; ChemStation 色谱工作站及 Agilent ChemStation Method Scouting Wizard 软件 方法开发系统及方法筛选软件是仪器根据不同需求增加不同切换阀 柱温箱构成 利用方法筛选软件对多根色谱柱 ( 最多 8 根 ) 及多个色谱条件进行排列组合, 在无人照管的情况下自动完成分析任务 方法筛选软件能根据谱图中色谱峰数量 分离度及保留时间等方法开发所关注的参数生成报告 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统, 配备脱气机, 四元泵, 自动进样器, 柱温箱, 二极管阵列检测器 Agilent 1220 Infinity 整体式液相色谱, 配备脱气机, 二元泵, 自动进样器, 柱温箱, 二极管阵列检测器 色谱柱 :Agilent Zorbax Bonus RP (3.0 x 50 mm,1.8 µm),agilent Zorbax SB-C18(3.0 x 150 mm,1.8 µm) 以上设备, 耗材及软件均由 Agilent Technologies, Inc.( 美国 ) 生产制造 实验所用的对照品均购买自中国食品药品检定研究院 ; 乙腈为 HPLC 级试剂 (Sigma-Aldrich), 实验用水由 Milli-Q 纯水机 (Merck-Millipore, 德国 ) 制备 ; 所有样品购自本地药店 实验条件 方法 1: 色谱柱 Agilent Zorbax Bonus RP (3.0 x 50 mm,1.8 µm), 柱温 25 C, 流动相 : 超纯水 (A)- 乙腈 (B), 梯度洗脱条件见表 1, 流速 :1.0 ml/min, 进样量 :3 µl, 检测波长 203 nm 表 1. 方法 1 梯度洗脱时间表 时间 B% 方法 2: 色谱柱 Agilent Zorbax SB-C18 (3.0 x 150 mm,1.8 µm), 柱温 :50 C, 流动相 : 超纯水 (A)- 乙腈 (B), 梯度洗脱条件见表 2, 流速 :0.5 ml/min, 进样量 :3 µl, 检测波长 203 nm, 检测波长 203 nm 表 2. 方法 1 梯度洗脱时间表 时间 B%

3 结果及讨论 方法 1 的分析结果 重现性 : 对上述样品进行了重现性考察, 重现性良好, 保留时间 RSD 均小于 0.2%, 峰面积 RSD 均小于 1.0%, 结果见图 2 根据上述条件 ( 方法 1) 对含有三七成分的中药成分进行了分离, 五种主要人参皂苷类成分分离良好, 并且不受其他干扰组分的影响, 具体分析结果见图 1: 图 1. 用方法 1 对含有三七的成方制剂中人参皂苷的分析 图 2. 重现性 ; 含有三七的成方制剂中人参皂苷的分析 3

4 专属性 : 进行专属性考察, 对空白 标样及样品分别进行了分析, 从结果可以看出 ( 图 5), 溶剂中的杂质对实际样品的分析没有干扰 样品分析和方法的调整 : 在分析样品时, 发现不同样品中所含有的干扰成分会有所差别, 从而对被测成分分析产生影响, 因此需要根据实际情况对梯度进行细微的调整以保证分离效果, 图 4 至 6 为分析不同样品的结果 图 3. 样品 对照品及空白谱图的重叠 图 4. 样品 : 三七总皂苷 4

5 图 5. 含有三七的成方制剂 A 图 6. 含有三七的成方制剂 B 5

6 方法 2 的分析结果图 7 是使用方法 2 对含有三七的中药制剂进行分析得到的结果, 各个被测组分均可以与干扰物质得到良好分离, 与方法 1 相比较, 分析时间变为 12 分钟, 且 Rg1 与 Re 的出峰顺序发生颠倒, 但是由于使用线性梯度, 使得 Rg1 与 Re 峰型更加尖锐, 并且使各个被测组分峰位置分布比较平均, 为应对不同样品中的干扰成分时进行的梯度微调留下了更多余地 方法筛选和优化的思路 根据本实验室原来从药典方法转换的 UHPLC 方法的色谱条件, 稍加修改后, 选择三种不同的梯度程序, 四根不同品牌 ( 分别是 : Bonus RP,Zorbax SB-C18,Eclipse Plus C18 及 Extend C18) 同样规格的色谱柱,25 C 及 30 C 两个不同色谱柱温度排列组合 图 8 即其中一个结果 ; 在 25 C 条件下其中一个梯度程序下的四种不同色谱柱的比较结果 图 7. 用方法 2 对含有三七的成方制剂中人参皂苷的分析 图 8. 不同色谱柱对人参皂苷 Re 及 Rg1 的选择性 6

7 从对以上四根色谱柱的筛选结果可以看出,Bonus RP 色谱柱对于极性较大的几个人参皂苷成分, 尤其是 Re 和 Rg1 两个较难分离的化合物有最好的分离选择性, 由于分离效果良好, 可以在此色谱柱的基础上进行进一步优化, 提高起始有机相比例, 从而进一步提升分析速度 同时, 在对这个分析法进行优化时发现, 温度对人参皂苷 Re 及 Rg1 分离的影响很大, 从方法筛选的结果中可以观察到, 温度提高会使这两个峰的分离度下降 所以在方法 1 中选择了 25 C 作为最终条件 同时 ; 乙腈比例的提高也引起这两个峰的分离度下降, 所以在方法筛选中起始条件的乙腈含量不能超过 22% 因此, 如果想加快分析速度, 只能使用更陡的梯度曲线洗脱保留较强的其他人参皂苷, 导致方法后半段的峰容量降低, 增加强保留人参皂苷成分之间以及与干扰组分分离的难度 为了使梯度变化更加缓和, 提高方法后半段峰容量, 根据方法筛选的结果, 选择了一根对 Re 及 Rg1 保留最强的 Agilent Zorbax SB C18 色谱柱, 尝试将温度提高 同时提高条件起始时的乙腈比例,Re 及 Rg1 两个物质的出峰顺序颠倒, 并且可以达到良好的分离 结论 同样根据方法筛选的结果, 开发了另一种分析人参皂苷的方法 这第二种方法使用极其经典 耐用的 Agilent Zorbax SB-C18 柱, 在较高色谱柱温度 更高的起始有机溶剂比例的条件下, 用线性梯度在 10 分钟内也完成了人参皂苷的分析 因使用线性梯度 1.8 µm 颗粒 150 mm 长的超高效色谱柱, 提供更高的分离能力 参考文献 1 窦德强, 靳玲等, 人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望, 沈阳药科大学学报,1999,02 2 中国药典 2010 版 ( 一部 ), 马双成等, 常用中药标准物质分析谱图 ; 人民卫生出版社, Agilent 1200 Infinity Series Multi-method Solutions, EN, Sept 更多信息 本文仅代表典型的结果 更多有关我们产品和服务, 请访问我们的网站 : 使用方法开发系统及自动方法筛选软件, 可以系统地开发新方法 通过对方法筛选结果的分析, 找到了更适用于人参皂苷分析的色谱柱 :Bonus RP 使用 1.8 µm 颗粒 50 mm 长的 Bonus RP 超高效液相色谱柱开发了分析时间仅需 6 分钟的超高效液相色谱方法 该方法重现性良好, 通过对各种有代表性样品的分析, 证明这个方法对各种样品都具有很好的分离度, 杂质干扰也很小 7

8 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本资料中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 3 月 3 日, 中国印刷 CHCN

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