应用文集 工作参数 流动相组成 表 1 色谱质谱条件 1) Full Scan, ESI 源, 正离子模式, M/Z:-; 负离子模式 :-;Scan time.4s, FWHM. 2) 子离子扫描 ( 母离子根据 (1) 扫描得到 ): 正负离子同时扫描,Full scan M/Z=-,Scan

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1 DGLC-16 采用二维柱切换液质联用法对流动相进行在线除盐分析 阿莫西林中有关物质 关键词 在线除盐 阿莫西林 有关物质 二维柱切换 液质联用 DGLC-16 Determination of amoxicillin and related substances by onlinedesalt of mobile phase with 2D column switch and LC- Key words Online-desalt, amoxicillin, related substances, 2D column switch, LC- 引言 阿莫西林 Amoxicillin 又名安莫西林或安默西林 学名 羟氨苄青霉素 英文名 AMOXICILLIN CAS No 是一种最常用的青霉素类广谱 β- 内酰胺类抗生素 为一种白色粉末 是目前应用较为广泛的口 服青霉素之一 其制剂有胶囊 片剂 颗粒剂 分散片等等 O OH O HO N O N H S NH2 图 1 阿莫西林 在 药典 版中 分析阿莫西林有关物质时 采用 HPLC 紫外检测器法 流动相为.mol/L 磷酸二氢 钾溶液 用 2mol/L 氢氧化钾溶液调节 ph 值至. 和乙腈 梯度分析 由于 该方法不能直接进行质谱分析 因此 本方法采用了二维色谱配置 在液相色谱紫外检测器分析完后 转入二维色谱柱 先进行在线脱盐 然后 采用 对质谱兼容的流动相 进行定性分析 找到有关物质的结构信息 进行质量标准研究工作 测试条件 仪 器 Ultimate DGP 3 系 列 包 括 带 有 在 线 脱 气 单 元 的 双 三 元 梯 度 泵 带 有 一 个 六 通 阀 的 柱 温 箱 DADRS TSQ Vantage 仪器连接图见图 2 一维分析柱 Acclaim 1 C18 µm 4.6 1mm P/N: 9148 二维色谱柱 Acclaim PA2 3µm 3. mm P/N: 色谱质谱条件见表 1 84

2 应用文集 工作参数 流动相组成 表 1 色谱质谱条件 1) Full Scan, ESI 源, 正离子模式, M/Z:-; 负离子模式 :-;Scan time.4s, FWHM. 2) 子离子扫描 ( 母离子根据 (1) 扫描得到 ): 正负离子同时扫描,Full scan M/Z=-,Scan time.2s,fwhm.,ce V,Energy Ramp:3eV 一维分析流动相 ( 右泵 ):A:.1 mol/l 磷酸二氢钾溶液 ( 用 2mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph 值至 6.),B:A 与乙腈 2:8 混合 梯度洗脱 时间 流速 A B min ml/min % % 二维分析流动相 ( 左泵 ):A:.mol/L 醋酸铵,pH 用乙酸调节至. B: 乙腈 时间 流速 A B min ml/min % % 阀切换时间 * 根据每个化合物的保留时间与基质情况, 可以适当调整 注明 : 每一个化合物的分析需单独进样一次 化合物峰保留时间六通阀切换质谱进样阀可能的母编号 /min 时间 /min 切进质谱时间 /min 离子 M/Z 子离子碎片 M/Z M-H M-H M+H M+H M+H M+H ( 负离子 ) M+H 2.2 ( 正离子 ) 柱温 六通阀 初始位置,6-1,Loop 环体积,µL 进样方式及体积 自动进样 :.µl UV 检测波长 2nm

3 图 2 仪器连接图 样品前处理方法分别对两份阿莫西林样品 ( 编号分别为 :3,19), 进行了破坏性试样, 分别取装量差异项下的内容物, 混合均匀, 精密称取适量, 加流动相 A 溶解并稀释制成每 1 ml 中含阿莫西林 2 mg 的溶液, 作为样品 酸破坏试验 : 取样品 ml, 加浓盐酸 1 滴, 置沸水浴中加热破坏 min, 过滤, 待测 碱破坏试验 : 取样品 ml, 加氢氧化钠试液调节 ph 值至., 置 水浴中加热破坏 min, 过滤待测 结果和讨论 样品紫外谱图分析结果 mau RT: E UV_VIS_1 UV 4a4 图 3 样品紫外谱图 ( 碱破坏 ) 根据酸破坏和碱破坏紫外谱图, 发现碱破坏杂质峰更多, 因此, 选用碱破坏样品进行杂质分析, 从图 3 可以看出, 号峰为杂质峰,3 号峰为阿莫西林 通过阀切换, 把每个杂质峰先切到 Loop 环里, 然后, 再启动左泵洗脱除盐后, 再进质谱分析 质谱分析结果及谱图质谱上进样阀不同切换时间对比 86

4 RT: 应用文集 6.76E m /z= F: - p [.-.] 4a3 8.82E6 m /z= F: - p [.-.] 4a Time (m in) RT: E = F: - p [.-.] 4a2_ Tim e (m in) 图 4 质谱上进样阀时间对比 (TIC 图 ) 2.E = F: - p [.-.] 4a2_ 从以上图 4 上边的图可以看出, 上面部分 ( 黑色的 ) 为负离子模式下, 磷酸盐 (M-H 97) 的 TIC 图, 下面部分 ( 棕色 ) 为化合物的特征离子图, 显然, 流动相中的盐没有去除干净 从下边的图可以看, 流动相中的盐基本除净 因此, 质谱上的进样阀的时间, 需要准确控制, 否则有可能造成, 盐没有去除干净或者目标化合物随着盐份一起流失出去 因此, 在质谱的进样阀切换时间, 控制在 3.min 左右, 由于前面的化合物保留较弱, 很容易在二维柱上洗脱下来, 因此不宜过长, 而对于后期保留较强的化合物, 质谱进样阀的时间可以适当延后, 以减少基质的干扰 样品分析的 TIC 图及子离子扫描碎片图 1 号杂质 RT: E6 = F: - p [.-.] 4a1_ E7 TIC F: - p ESI Q3 [.-.] 4a1_ 图 TIC 谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为正离子模式 ) 87

5 4a1_ #7 RT:7.9 AV:1 SB: , E F:- p [.-.] a2_1219 #1627 RT:8.AV:1 9.2E4 F:- p ESI Full ms [1.-3.] 图 6 特征离子谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为正离子模式 ) 通过与文献报道, 及阿莫西林碎裂规律, 该杂质分子离子峰为 M-H= 号杂质 RT: E7 TIC F: - p ESI Q3 [.-.] 4a2_ E = F: - p [.-.] 4a2_ 图 7 TIC 谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为负离子 SIM 模式 ( 根据文献报道,M-H=338.)) 88

6 应用文集 4a2_ #668 RT:8.71 AV:1 SB: , E4 F:- p [.-.] a2_1219 #1627 RT:8. AV:1 9.2E4 F:- p ESI Full ms [1.-3.] 图 8 特征离子谱图 ( 左图为负离子模式, 右图为负离子模式下做子离子扫描 ) 经过负离子模式子离子扫描碎片, 为 , 发现与文献报道基本一致, 基本可以确认为该杂 质分子离子峰为 M-H= 号化合物 - 阿莫西林 RT: E6 TIC F: - p [.-.] 4a3 3.47E7 TIC F: + p [.-.] 4a 图 9 TIC 谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为正离子模式 ) 4a3 #1714 RT:16.49 AV:1 2.76E F: - p [.-.] a3 #1721 RT:16. AV:1 9.88E F: + p [.-.] 图 特征离子谱图 ( 左图为负离子模式, 右图为正离子模式 ) 89

7 通过, 正负离子碎片比对,M-H 为 364.1,M+H 为 366.2, 因此, 该化合物为阿莫西林主成分 4 号杂质化合物 RT: E7 TIC F: - p [.-.] 4a4 2.79E8 TIC F: + p [.-.] 4a 图 11 TIC 谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为正离子模式 ) 4a4 #36 RT:32.9 AV:1 2.83E6 F: - p [.-.] a4 #33 RT:32.6 AV:1 1.16E7 F: + p [.-.] 图 12 特征离子谱图 ( 左图为负离子模式, 右图为正离子模式 ) 通过, 正负离子碎片比对,M-H 为 338.1,M+H 为 3.1, 因此, 初步确认该化合物为 M 为 对 M+H=3.1 进行了子离子扫描, 谱图如下, 与文献报道基本一致 4a4_ #3912 RT:31.9 AV:1 2.2E6 F: + p ESI Full ms2 3. [.-3.] 图 13 子离子碎片谱图 (M+H = 3.1)

8 应用文集 通过对 M+H =3.1 进行子离子扫描, 碎片为 号杂质化合物 RT: E7 TIC F: - p ESI Q3 [.-.] 4a_ E8 TIC F: + p ESI Q3 [.-.] 4a_ 图 14 TIC 谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为正离子模式 ) 4a_ #44 RT:34.41 AV:1 2.98E6 F: - p [.-.] a_ # RT:34.41 AV:1 1.43E7 F: + p [.-.] 图 特征离子谱图 ( 左图为负离子模式, 右图为正离子模式 ) 通过, 正负离子碎片比对,M-H 为 338.1,M+H 为 3.1,378.2, 因此, 根据文献报道, 及保留时间对比, 初步确认该化合物为 M 为 对 M+H=378.2 进行了子离子扫描, 谱图如下, 与文献报道基本一致 4a-all #83 RT:34.14 AV:1 1.14E7 F: + p ESI Full ms [.-.] 图 16 子离子碎片谱图 (M+H=378.2) 91

9 通过对 (M+H=378.2) 进行子离子扫描, 碎片为 号杂质化合物 RT: E7 TIC F: - p [.-.] 4a 图 17 TIC 谱图 ( 上图为负离子模式, 下图为正离子模式 ) 4a6 #3918 RT:38.4 AV:1 1.E6 F: - p [.-.] 图 18 特征离子谱图 ( 负离子模式 ) 通过以上图可以看出,M-H 为 186.9, 未见文献报道 7 号杂质化合物 RT: E7 TIC F: + p [.-.] 4a6 1.2E9 TIC F: + p [.-.] 4a7 3.27E8 TIC F: - p [1.-.] 4a 图 19 TIC 谱图 ( 上图为正离子模式, 下图为负离子模式 ) 92

10 应用文集 4a7 # RT:38.14 AV:1 SB: , E7 F: - p [1.-.] 有 4a7_ M+H # RT:38.14 AV:1 碎片 在不确定的情况下 1.E7, 分别对 M-H= a7_ 和 M+H=2.1 #8374 RT:38.12 AV:1 7.96E7 进行了子离子扫描, 谱图如下, 以方 F: - p ESI Full ms [.-3.] F: + p ESI Full ms2 2. [.-3.] 便进一步质谱碎裂解析工作 a7_ #8378 RT:38.14 AV:1 1.E a7_ #8374 RT:38.12 AV:1 7.96E7 F: - p ESI Full ms [.-3.] F: + p ESI Full ms2 2. [.-3.] a7 #33 RT:38.17 AV:1 SB: , E7 F: + p [.-.] 4a7 # RT:38.14 AV:1 SB: , E7 4a7 #33 RT:38.17 AV:1 SB: , E7 F: - p [1.-.] F: + p [.-.] 图 特征离子谱图 ( 左图为负离子模式, 右图为正离子模式 ) 通过以上图可以看出,M-H 为 ,M+H 为 2.1, 未见文献报道该类杂质 但该化合物正离子模式中含 2.1 图 21 子离子碎片谱图 ( 左图为 M-H=293.1, 右图为 M+H=2.1) 通过文献比对, 该化合物可能为 M+H=2.1, 其负离子子离子碎片 , 正离子子离子碎片 结论通过该方法, 对每一个杂质进行单独切换后, 通过定量环转移至二维色谱柱上, 再采用与质谱兼容的流动相, 把二维色谱柱上保留的盐份通过 上的切换阀去除掉, 然后把目标化合物洗脱下来, 进质谱分析, 该方法取得了较好的结果 本方法同时对 19 号样品进行了类似分析, 结果类似 因此, 该二维在线去除流动相中的盐份的方法, 可以参照用于该类型研究, 解决相关难题 93

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