中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 6 批号 D04006 ; 河南润弘制药股份有限公司, 含量 8.%, 批号 D600 ; 国药集团容生制药有限公司, 含量 8.3%, 批号 D600) ; 庚烷磺酸钠邻苯二甲醛甲酸乙腈

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曳仕邓
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1 66 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 单硫酸卡那霉素的杂质谱蒋孟虹, 赵敬丹, 张含智, 秦峰,, 刘浩 * (. 上海市食品药品检验所, 上海 003;. 复旦大学化学系, 上海 00433) 摘要 : 本试验研究了单硫酸卡那霉素的杂质谱, 综合比较多个分离分析方法, 采用 HPLC- 柱后衍生化 - 荧光检测法对 6 家企业的单硫酸卡那霉素进行杂质谱研究, 通过半制备技术对主要杂质进行分离和富集, 并应用高效液相色谱 - 四级杆 - 飞行时间质谱技术分析杂质结构, 检出个副产物杂质和 4 个降解产物杂质本研究填补了各国药典缺少卡那霉素有关物质仪器分析方法的空白, 可应用于卡那霉素原料药及其制剂的质量控制, 对提高产品质量具有重要意义关键词 : 单硫酸卡那霉素 ; 杂质谱 ; 衍生化 ; 高效液相色谱 ; 液质联用中图分类号 :TQ ;6. + 文献标志码 :A 文章编号 :00-8(08) DI:0.6/j.cnki.cjph 卡那霉素 (kanamycin,) 是 98 年由日本明治制果药业株式会社开发生产的 α- 去氧链胺衍生物组成的氨基糖苷类抗菌药 [], 临床所用为其硫酸盐主要与细菌核糖体 30S 亚单位结合, 抑制细菌蛋白质合成, 具有广谱抗菌作用 [] 由卡那链霉菌 Stretpomyces kanamyceticus 发酵生产, 发酵和纯化工艺中可能产生卡那霉素 B() 卡那霉素 D(3) 等副产物和降解产物 [3] 这些副产物可能存在于原料药及其制剂中, 影响产品质量和临床使用效果目前, 仅美国药典第 40 版 (USP 40) 和日本药典第版 (JP ) 收载了 TLC 法检测的有关物质, 该方法的专属性准确性和检测灵敏度均较低, 不利于有关物质的控制中国药典 0 年版 (ChP 0) 中收载的硫酸盐中采用 HPLC-ELSD 法测定其中的, 未对 3 及其他有关物质进行检查但该方法对杂质的分离能力较差, 而且应用 ELSD 要求流动相具有挥发性, 使得色谱系统的优化受到限制文献报道的有关物质的检测方法主要有 LC- 收稿日期 :0--0 作者简介 : 蒋孟虹 (988 ), 女, 硕士研究生, 专业方向 : 抗菌药的质量分析与研究 Tel: jmhow@63.com 通信联系人 : 刘浩 (968 ), 男, 博士, 主任药师, 从事药品分析研究 Tel: liuhao968@hotmail.com 脉冲安培电化学 (PED) 检测法 [4 ] 柱前衍生化 - HPLC 法和 HPLC- 柱后衍生化法 [6 8] LC-PED 法具有灵敏度高的优点, 但流动相中不能含有电化学活性物质, 且电极易钝化, 仪器成本较高, 方法尚未普及 ; 柱前衍生化 -HPLC 法操作繁琐, 影响因素多, 测定结果的准确性较差本研究采用了简便快捷的 HPLC- 柱后衍生化 - 荧光检测法, 较柱前衍生化法的稳定性更好, 且有关物质能得到良好分离同时通过杂质对照品确认半制备色谱和液质联用技术, 对主要杂质进行结构推导, 分析杂质来源, 为改进生产工艺完善质量标准以及提高药品质量提供参考仪器与试药 00 型高效液相色谱仪和型四级杆 / 飞行时间质谱联用仪 ( 美国 Agilent 公司 );Vector PCX 型柱后衍生化仪 ( 美国 Pickering Laboratories 公司 ) 对照品 ( 纯度 80.%, 批号 R090) 由美国药典委员会提供 ; 对照品 ( 纯度 00%, 批号 ) 由中国食品药品检定研究院提供 ;- 脱氧链霉胺 ( 美国 Aldrich 公司, 纯度 9%, 批号 08389) ;6--(3- 氨基 -3- 脱氧 -α-d- 葡吡喃糖基 ) 脱氧链霉胺 ( 加拿大 TRC 公司, 纯度 9%, 批号 D63) ; 单硫酸盐原料药 ( 丽珠集团福州福兴医药有限公司, 含量 80.3%, 批号 ysk4003 ; 古田福兴医药有限公司, 含量 8.%, 批号 C030/ D000 ; 福建古田药业有限公司, 含量 9.0%, 批号 YL ; 遂成药业股份有限公司, 含量.8%,

2 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 6 批号 D04006 ; 河南润弘制药股份有限公司, 含量 8.%, 批号 D600 ; 国药集团容生制药有限公司, 含量 8.3%, 批号 D600) ; 庚烷磺酸钠邻苯二甲醛甲酸乙腈和甲醇均为色谱纯 ; 无水硫酸钠 - 巯基乙醇冰乙酸氢氧化钠和硼酸均为分析纯方法与结果. 溶液制备供试品溶液 : 精密称取单硫酸盐原料药适量 ( 相当于 0 mg), 置 00 ml 量瓶中, 加水溶解并定容, 制成 0. mg/ml 的溶液系统适用性溶液 : 精密称取对照品 0 mg, 置 0 ml 量瓶中, 加 mol/l 盐酸 ml, 振摇混匀, 00 水浴加热 30 min, 用 mol/l 氢氧化钠溶液 ml 中和, 加入对照品 mg 和对照品 mg, 振摇使溶解, 用水定容, 摇匀, 作为系统适用性溶液. 色谱条件.. 衍生化条件柱后衍生化试液 : 取邻苯二甲醛 0.8 g 甲醇 300 ml - 巯基乙醇 ml 和硼酸盐缓冲液 ( 称取硼酸.0 g 和氢氧化钠 43.0 g, 加水溶解并稀释至 4 L, 用 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph 值至 0.4±0.) 00 ml, 混匀, 用 0.4 mm 滤膜过滤, 即得试验条件 : 衍生化试液流速 0.8 ml/min ; 衍生化反应温度 3 ; 检测器荧光检测器 ; 激发波长 340 nm ; 发射波长 4 nm.. 色谱条件及系统适用性试验色谱柱 Zorbax Eclipse Plus C 8 柱 (4.6 mm 00 mm,3. mm) ; 流动相 ph 3.4 缓冲液 ( 取庚烷磺酸钠一水合物 8. g 和无水硫酸钠 3 g, 加水溶解并定容至 L, 用冰乙酸调节 ph 值至 3.4±0.) 甲醇 (9,A),pH 3.4 缓冲液甲醇 (60 40, B), 线性梯度洗脱 ( 程序见表 ) ; 柱温 3 ; 流速.0 ml/min ; 进样量 µl 表线性梯度洗脱程序 Tab. Linear Gradient Elution Procedure A/% B/% 取系统适用性溶液和供试品溶液进样分析, 和色谱峰之间的分离度不小于.0, 峰与相邻杂质峰之间的分离度符合要求, 其拖尾因子不大于.0 系统适用性溶液和供试品溶液的典型色谱图见图.3 专属性试验取单硫酸盐原料药适量, 分别进行酸碱氧化高温和光照破坏按. 项下色谱条件进样分析, 色谱图见图结果表明, 在以上破坏条件下各降解产物峰分离良好, 均不干扰本品有关物质的测定, 方法专属性良好 A B 6 A : 系统适用性溶液,B : 供试品溶液 - ;- ;3- 杂质 Ⅰ ;4- 杂质 Ⅱ ;- 杂质 Ⅲ ;6- 杂质 Ⅳ ;- 杂质 Ⅴ 图典型色谱图 Fig. Typical Chromatograms

68 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49().4 检测限以信噪比 S/N=3 计, 的检测限为 8 ng/ml, 的检测限为 44 ng/ml. 耐用性试验分别考察了供试品溶液在 Zorbax Eclipse Plus C 8 色谱柱 (4.6 mm 00 mm,3. µm) Symmetry C 8 色谱柱 (4.

3 68 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49().4 检测限以信噪比 S/N=3 计, 的检测限为 8 ng/ml, 的检测限为 44 ng/ml. 耐用性试验分别考察了供试品溶液在 Zorbax Eclipse Plus C 8 色谱柱 (4.6 mm 00 mm,3. µm) Symmetry C 8 色谱柱 (4.6 mm 0 mm, µm) 和 Prodigy DS3 色谱柱 (4.6 mm 00 mm, µm)3 种色谱柱上有关物质的分离情况结果表明, 各杂质峰之间及与主峰之间均能得到有效分离, 本方法的耐用性较好.6 样品测定按. 项下方法制备供试品溶液, 分别进样分析按面积归一化法计算得 6 批样品的有关物质, 结果见表结果表明, 不同来源的原料药中杂质检出个数差别不大, 但不同企业样品中发酵副产物 (0.6%~.6% ) 和杂质 Ⅲ (0.%~.9%) 的含量差异较大 ; 降解产物杂质 Ⅳ 最低含量为 0.%, 最高可达.8%. 杂质鉴定通过半制备技术对系统适用性溶液中的主要杂质进行分离和富集, 并应用 LC-Q-TF-MS 技术分析杂质结构, 检出个副产物杂质和 4 个降解产物杂质.. 液质联用条件色谱柱 DionexIonPac TM CG 弱阳离子交换柱 A B C D E F A : 酸破坏,B : 碱破坏,C : 氧化破坏,D : 高温破坏,E : 光照破坏,F : 未破坏 - ;- ;- 杂质 Ⅲ ;6- 杂质 Ⅳ ;- 杂质 Ⅴ 图专属性试验色谱图 Fig. Chromatograms of Specificity Test

4 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 69 表样品测定结果 /% Tab. Determination Results of Samples/% 批号杂质 Ⅲ 杂质 Ⅳ 杂质 Ⅴ 总杂质 ysk C030/D YL D D D (0.4 cm cm); 流动相 0.% 甲酸水溶液 0.% 甲酸乙腈溶液 ( ); 柱温 30 ; 流速.0 ml/min ; 进样量 µl 离子源电喷雾电离源 (ESI), 正离子模式扫描 ; 雾化器温度 0 ; 雾化器流速 9 L/min ; 喷雾电压 V ; 扫描范围 m/z 0 ~ m/z 00.. 杂质制备及 LC-MS 测定取系统适用性溶液, 按. 项下的色谱条件进样, 分别收集目标馏分, 浓缩制备后进行 LC-MS 测定结果杂质 Ⅰ 的 [M+H] + 峰为 m/z 80, 二级质谱信息与的 A 环或 B 环的碎片峰基本一致, 推测其结构为 3- 氨基 -3- 脱氧葡萄糖或 6- 氨基 -6- 脱氧葡萄糖杂质 Ⅱ 的 [M+H] + 峰为 m/z 63, 二级碎片离子 m/z 4 m/z 8 m/z 0, 均与 - 脱氧链霉胺碎片峰一致, 并通过杂质对照品加样检测, 进一步确证为 - 脱氧链霉胺杂质 Ⅲ 的 [M+H] + 峰为 m/z 486, 因无市售杂质对照品, 故仅结合二级碎片离子信息, 推测其结构为中 A 环的氨基转化成羟基, 为发酵副产物 3 杂质 Ⅴ 的 [M+H] + 峰为 m/z 34, 结合裂解规律及 6--(3- 氨基 -3- 脱氧 -α-d- 葡吡喃糖基 ) 脱氧链霉胺对照品的定位, 确证其为脱 B 环的降解产物, 即 6--(3- 氨基 - 3- 脱氧 -α-d- 葡吡喃糖基 ) 脱氧链霉胺杂质 Ⅳ 的 [M+H] + 峰也为 m/z 34, 推测其为杂质 Ⅴ 的同分异构体, 属于的降解产物结合裂解规律, 初步鉴定杂质 Ⅳ 为脱 A 环的降解产物杂质解析结果见表 3..3 杂质来源分析的主要降解途径为水解, 通过杂质对照品确认半制备色谱和液质联用技术确认杂质 Ⅰ Ⅱ Ⅳ 和 Ⅴ 均为糖苷键断裂产生的降解产物在酸性和高温条件下, 杂质 Ⅳ 和 Ⅴ 显著增加, 可作为反映原料药及制剂内在质量的指标所建方法可有效检出生产或贮藏过程中产生的降解物 3 讨论 3. 有关物质分析方法的选择现行 ChP 0 二部仅收载的 HPLC-ELSD 检查方法, 对杂质的控制不全面, 缺乏对发酵工艺中因不同合成路径可能产生的其他生物合成副产物及降解产物的控制, 亟需建立一个全面的有关物质检查方法以表征杂质的含量国内外药典中对氨基糖苷类抗菌药的有关物质检查多采用 TLC HPLC- ELSD LC-PED 和 HPLC- 柱后衍生化等方法, 本研究综合比较多个分离分析方法, 从检出杂质数量分离能力色谱系统重现性及稳定性角度综合分析, 选择最合适的分离分析方法 3.. HPLC-ELSD 法 ChP 采用 HPLC-ELSD 法测定, 采用流动相为 0. mol/l 三氟乙酸溶液甲醇, 结果除外仅检测到保留时间为约. min 的杂质将该杂质经半制备色谱分离纯化, 按. 项下的色谱条件进样分析, 结果显示该杂质为混合物, 可能为杂质 Ⅲ Ⅳ 和 Ⅴ 被同时洗脱, 表明该方法对杂质的分离能力较差, 无法真实表征杂质谱改用其他多氟羧酸作为流动相或采用碱性流动相, 分离均未得到改善 3.. LC-PED 法 LC-PED 法测定氨基糖苷类抗菌药含量已在 ChP 欧洲药典 (EP) 和美国药典 (USP) 的多个品种中得到应用本研究首先采用 USP 40 方法测定, 但未检测到相关物质 ; 采用 HPLC-ELSD 法, 以多氟羧酸乙腈为流动相体系, 考察结果显示杂质分离较 HPLC-ELSD 法稍有改善, 但的保留时间约 30 min, 分析时间过长进一步调整流动相, 采用硫酸钠辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液流动相体系和线性梯度洗脱, 保留时间提前至 40 min, 但的保留时间仍大于 00 min, 不适用于日常药品的检验 3..3 HPLC- 柱后衍生化 - 荧光检测法

5 660 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 表 3 杂质谱研究中杂质的 LC-Q-TF-MS 测定数据及解析 Tab.3 LC-Q-TF-MS Data and Proposed Chemical Structures of Impurities 杂质名称 [M+H] + (m/z) MS 碎片离子 (m/z) 分子式杂质结构杂质 Ⅰ(3- 氨基 -3- 脱氧葡萄糖或 6- 氨基 -6- 脱氧葡萄糖 ) C 6 H 3 N 或杂质 Ⅱ(- 脱氧链霉胺 ) C 6 H 4 N 3 杂质 Ⅲ(3) C 8 H 3 N 3 杂质 Ⅳ[4--(6- 氨基 -6- 脱氧 -α- D- 葡吡喃糖基 ) 脱氧链霉胺 ] C H N 3 杂质 Ⅴ[6--(3- 氨基 -3- 脱氧 -α- D- 葡吡喃糖基 ) 脱氧链霉胺 ] NH C H N 3 NH 柱后衍生化技术是一种常用的在线处理技术, 该方法在硫酸异帕米星及其注射液 (JP 收载 ) 庆大霉素妥布霉素等氨基糖苷类抗菌药中已得到广泛应用 [9 0], 可以实现自动化在线衍生, 同时具有良好的重现性等优势本研究通过对衍生化反应条件离子对试剂种类和浓度流动相缓冲液 ph 值有机溶剂种类和浓度等的摸索, 建立了分离能力良好的方法用于研究杂质谱 4 结论杂质谱的研究是为了加强工艺控制, 提高用药安全本试验建立的 HPLC- 柱后衍生化 - 荧光检测有关物质测定方法可对单硫酸盐中的杂质进行更全面的分离分析, 不仅可以弥补现行 ChP 中测定方法的灵敏度低的缺陷, 解决杂质 Ⅲ Ⅳ 和 Ⅴ 同时被洗脱的问题 ; 而且还填补了各国药典无有关物质测定仪器分析方法的空白, 提高了各国药典方法有效控制有关物质的能力通过鉴定杂质结构分析杂质来源, 为改进工艺提供依据, 对提高产品质量具有重要意义参考文献 : [] Umezawa H, Ueda M, Maeda K, et al. Production and isolation of a new antibiotic: kanamycin [J]. J Antibiot (Tokyo), 9, 0(): [] 李玉林, 陈真文, 周玲, 等. 硫酸卡那霉素注射液中有关物质测定方法研究 [J]. 中国药业, 0, 0(0): [3] Park JW, Park SR, Nepal KK, et al. Discovery of parallel pathways of kanamycin biosynthesis allows antibiotic manipulation [J]. Nat Chem Biol, 0, (): [4] 习玲玲, 朱岩. 液相色谱 - 脉冲安培电化学法测定硫酸卡那霉素中各组分含量 [J]. 分析化学, 00, 3(): [] Manyanga V, Dhulipalla RL, Hoogmartens J, et al. Improved liquid chromatographic method with pulsed electrochemical detection for the analysis of kanamycin [J]. J Chromatogr A, 00, (4): [6] 王建. 硫酸卡那霉素及其注射液的 HPLC 衍生化测定 [J]. 中国医药工业杂志, 99, 6(3): 0-. [] 姜皓然, 李祥鹏, 玄光善. 柱前衍生化 HPLC 检测硫酸卡那霉素的方法研究 [J]. 海峡药学, 009, (): [8] 鞠建刚, 杜迎彬. 注射用硫酸卡那霉素有关物质分析方法研究 [J]. 山东化工, 0, 44(): [9] 赵敬丹, 王曦, 刘浩, 等. 柱后衍生化 -HPLC 法测定硫酸异帕米星注射液的含量和有关物质 [J]. 中国抗菌药杂志, 0, 4(): [0] 何丹, 杨林. 柱后衍生化高效液相色谱法测定妥布霉素滴眼液的含量 [J]. 中国抗菌药杂志, 00, 3(0): - 3.

6 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 66 Impurity Profile of Kanamycin Monosulfate LC-QTF-MS NH NH NH NH NH peak : kanamycin peak : kanamycin B NH or 或 peak 3: 3-amino-3-deoxy-α-D-glucose peak 4: deoxystreptamine or 6-amino-6-deoxy-α-D-glucose peak : kanamycind Typical Chromatogram of Kanamycin Monosulfate System Suitability Solution by Post-column Derivatization HPLC-fluorescence Detection peak 6: JIANG Menghong, ZHA Jingdan, ZHANG Hanzhi, QIN Feng,, LIU Hao * (. Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 003;. Dept. of Chemistry, Fudan University, Shanghai 00433) ABSTRACT: The impurity profile of kanamycin monosulfate was investigated to identify the structures and sources of major impurities. The impurities in samples from six manufactures were profiled by an HPLC with post-column derivatization method. The major impurities were prepared by semi preparation technology and identified by LC-Q-TF- MS. Two by-products and four degradation products were identified in this study. ur work has not been found in the pharmacopoeias and could be used for the quality control of kanamycin and its preparations. Key Words: kanamycin monosulfate; impurity profile; derivatization; HPLC; LC-MS 4--(6-amino-6-deoxy-α-D-glucopyranosyl)- deoxystreptamine NH NH peak : 6--(3-amino-3-deoxy-α-D-glucopyranosyl) - deoxystreptamine

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 6 批号 D04006 ; 河南润弘制药股份有限公司, 含量 8.%, 批号 D600 ; 国药集团容生制药有限公司, 含量 8.3%, 批号 D600) ; 庚烷磺酸钠 邻苯二甲醛 甲酸 乙腈

中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 08, 49() 6 批号 D04006 ; 河南润弘制药股份有限公司, 含量 8.%, 批号 D600 ; 国药集团容生制药有限公司, 含量 8.3%, 批号 D600) ; 庚烷磺酸钠邻苯二甲醛甲酸乙腈