[ ] 实验条件 实验流程 样品制备 : 莫西沙星注射液 ( 光照 10 天 ) 样品直接进样 A.LC / UPLC 条件 LC 系统 : 色谱柱 : ACQUITY UPLC SS T3(100 x 2.1mm, 1.8 µm) Part o.: 柱温 : 35 C 进样量

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1 [ ] 王志英沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 应用优势 n 使用亚 2 µm 色谱柱, 分析时间由 60 min 缩短至 25 min, 提高了分析效率 n 使用 Xevo G2-S QTof 能得到准确的分子量, 其质量偏差在 0.8 mda 以内 n 通过 MassLynx 及 MetaboLynx TM 软件快速自动进行杂质解析, 节省人力及时间 前言莫西沙星 (Moxifloxacin) 为人工合成的喹诺酮类抗菌药, 是一类较新的合成抗菌药 具有抗菌性强 抗菌谱广 不易产生耐药性, 并对常见耐药菌有效 半衰期长 不良反应少等优点 临床上用于治疗呼吸系统感染 生殖系统感染 皮肤软组织感染等 莫西沙星原研厂家为德国拜耳, 其注射剂在中国的专利保护期即将到期, 国内也有多个厂家正在进行莫西沙星的仿制 但如今基于药品安全的考虑, 仿制药中的有关物质的检测越发引起注意, 中国药典上也明确规定, 药物中杂质, 含量高于 0.1% 的所有杂质均需对其杂质结构进行鉴别 ( 毒性药物限度则更低 ) 所以, 如何高效快速地测定药物中的杂质, 这一课题逐渐成为药物研究过程中亟待解决的难点 本文采用沃特世 (Waters ) 超高效液相色谱飞行时间质谱 (ACQUITY UPLC/ Xevo G2-S QTof) 联用技术对莫西沙星注射液 ( 光照 10 天 ) 样品中杂质进行分析, 采用亚 2 µm 色谱柱 UPLC 方法, 使整个分离时间由 60 分钟缩短至 25 分钟, 且杂质得到有效分离 ; 应用 MassLynx 和 MetaboLynx 软件, 自动得到包含各个杂质分子量 分子式 及结构信息的杂质列表, 使整个杂质鉴定过程高效快速 节省人力 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC 图 1. 莫西沙星 (Moxifloxacin) C Xevo G2-S QTof 质谱仪 MassLynx MetaboLynx 软件 SS T3(100*2.1mm, 1.8 µm) 色谱柱 关键词 UPLC QTof 杂质鉴定 MassLynx MetaboLynx 莫西沙星 1

2 [ ] 实验条件 实验流程 样品制备 : 莫西沙星注射液 ( 光照 10 天 ) 样品直接进样 A.LC / UPLC 条件 LC 系统 : 色谱柱 : ACQUITY UPLC SS T3(100 x 2.1mm, 1.8 µm) Part o.: 柱温 : 35 C 进样量 : 1 µl 流速 : 流动相 : 0.45 ml/min 水 (850mL)/ 乙腈 (150 ml)/ 醋酸 (30 ml) 图 2. 实验流程图 B. MS 条件 MS 系统 : Xevo G2-S QTof 离子化模式 : ESI+ 毛细管电压 : 2.0 KV 源温度 : 120 C 雾化气温度 : 550 C 雾化气流速 : 800 L/h 锥孔气流速 : 50 L/h 结果与讨论使用方法转换器及色谱柱选择卡, 将客户提供的 PLC 普通液相平行转化为 UPLC 方法, 如表 1 图 3 为客户使用 PLC 得到的紫外谱图, 图 4 为转化为亚 2 µm 色谱柱后得到的紫外谱图 从结果可看出, 分析时间由 60 分钟缩短至 25 分钟, 流速由 1.0 ml/min 降低到 0.45 ml/min, 使用 UPLC 可提高效率 大大节省成本 ; 同时, 从谱图的分离度及响应来看,UPLC 的分离度更好, 响应更高 ( 进样量由 5 µl 降为 1 µl) 其中谱图中红色箭头处几个大峰为我们特别关注的杂质 表 1. 将样品检测方法转化到亚 2 µm 色谱柱上进行分离 采集模式 : C. PDA 检测器紫外检测波长 : D. 软件 MassLynx MetaboLynx MS E 293nm 分析条件 PLC 方法 UPLC 方法 色谱柱 C 18, 4.6*150 mm,3.5 µm SS T3, 100*2.1 mm, 1.8 µm 流速 1.0 ml/min 0.45 ml/min 进样量 5 µl 1 µl 分析时间 60 min 25 min 2

3 客户 UV 质谱图 客户 RT RT 检测用 1 AC 将检至 Waters Corporation 图 3. 客户使用 PLC 得到的紫外谱图 UV 色谱图 客户关心 图 4. 转化为亚 2 µm 色谱柱后得到的紫外谱图 与液相紫外相连的为 Xevo G2-S QTof 质谱, 采用 MS E 这种简单实用的专利技术采集样品, 可以实现样品进样一次同时得到一级质谱图和丰富的离子碎片信息, 其中包括了母离子扫描 子离子扫描和中性丢失扫描的结果, 并且避免了杂质信号的丢失 如图 5 为一针进样同时得到莫西沙星注射液 ( 光照 10 天 ) 样品的一级质谱总离子流图 二级质谱总离子流图 图 6 为主峰的一级和二级质谱图 二级质谱总离子流图 一级质谱总离子流图 图 5. 一针进样即可得到莫西沙星注射液 ( 光照 10 天 ) 样品的一级质谱及二级质谱总离子流图 3

4 主峰的一级质谱图 主峰的二级质谱图 盐酸莫西沙星注射液 ( 天光照 ) 样品主峰的一级和二级质谱图 图 6. 主峰的一级质谱图和二级质谱图 采用 MassLynx 软件, 通过准确的质量数和同位素匹配确定分子式, 之后再根据二级碎片质谱对结构进行 确认 以主峰为例说明判断分子式的过程, 如图 7 确认分子式 再通过软件 Massragment 功能对二级碎片 进行自动解析, 如图 8, 可看出, 其碎片的精确度也非常好, 质量偏差很小 质量偏差 同位素分布 tion 7 图 7. 通过准确的质量数和同位素分布来确定分子式 ( 以主峰为例 ) 8 图 8. 通过准确的质量数和同位素分布来确定分子式 ( 以主峰为例 ) 4

5 使用 MetaboLynx 对杂质进行自动解析, 其解析结果界面如图 9, 可以自动得到杂质列表, 其中包含分子量 分子式 质量偏差 峰面积及其结构信息 软件还自动显示每个杂质在样品中的提取离子流图 在空白中的提取离子流图 一级质谱图和二级质谱图, 使杂质的分析更明确 通过此软件可快速得到其整个样品谱图上所有杂质的信息, 具体如图 10 显示 其中从 质量偏差 (mda) 可看出由 Xevo G2-S QTof 可获得很好的质量精度, 其质量偏差在 0.8 mda 以内 杂质与母药关系 一栏, 可快速获得其结构的相关信息 如写 ydroxylation 即 主峰的结构 +, ydroxylation + desaturation 即 主峰的结构 +- 2 另外出现如 (R_0:-C 2 ) 等 R_ 的形式是指软件自动对主峰进行烷基化断裂后的结构 ( 软件已自动给出结构 ), 如 ydration-c 2 (R_0:-C 2 ) 即指 主峰 -C2 后的结构再 + 2 -C 2, 其结构也已呼之欲出 杂质列表 杂质的二级质谱图 杂质的一级质谱图 样品中杂质的提取离子流图 空白中杂质的提取离子流图 主峰结构 图 9. MetaboLynx 对杂质进行自动解析的界面 保留时间 与母药的质量 质量偏差 杂质数 分子量 杂质与母药关系 分子式 m/z[+] 峰面积 (MS) (min) 差异 (mda) ydroxylation + desaturation C x ydroxylation C x ydroxylation + Desaturation C ydroxylation C Quinone formation C Quinone formation + Glycine conjugation- C7122 (R_5:-C7122) C Quinone formation C Quinone formation-+ (R_2:-+) C x ydroxylation-c7122 (R_5:-C7122) C ydroxylation C ydroxylation C ydroxylation C Quinone formation + xidative Defluorination C ydroxylation + desaturation C Parent-C34 (R_4:-C34) C Desaturation-C2 (R_0:-C2) C ethoxyl to acid C ydroxylation + desaturation C Decarbonylation C ydration-c2 (R_0:-C2) C Decarbonylation-C2 (R_0:-C2) C Demethylation + hydroxylation-c C (R_5:-C7122) xidative Defluorination C ydroxylation C Methylation C ydroxylation + xidative Defluorination C xidative Defluorination + Desaturation C C C Waters Corporation 10 图 10. 通过软件自动得到的莫西沙星注射液 ( 光照 10 天 ) 样品杂质列表, 包含杂质峰 m/z 保留时间 分子量 分子式 质量偏差 峰面积及具体的结构信息等 5

6 [ ] 客户特别关心的三个大峰紫外谱图中 5.93 min 8.60 min min 的杂质信息如表 2 其中 5.93 min 和 8.60 min 的峰包含有多个杂质, 未完全分开 从图 11 中,RT 5.93 min 的一级质谱图可看出 :m/z 为带了双电荷的分子离子, 与 m/z 为同一化合物, 且 m/z 的含量较高 图 12 可以看出, 为带了双电荷的分子离子, 与 为同一化合物, 此杂质浓度较高 图 分别列出了这三个色谱峰的一级质谱图 每个杂质组分的二级质谱图及可能的结构 表 2. 客户关心峰的杂质信息 紫外谱图中保留时间 (min) 保留时间 (min) 分子量杂质与母药关系分子式 m/z[++] 质量偏差 (mda) ydroxylation + desaturation +- 2 C Decarbonylation -C C ydration-c 2 (R_0:-C 2 ) + 2 -C 2 C xidative Defluorination -+ C ydroxylation + C C C 7 11 C RT5.93min 峰的一级质谱图 m/z 的二级质谱图 m/z 的二级质谱图 m/z 的二级质谱图 2 m/z 的可能结构 2013 Waters Corporation m/z 的可能结构 m/z 的可能结构 图 11. 紫外谱图中 RT 5.93 min 峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构 RT8.60 min 峰的一级质谱图 m/z 的二级质谱图 m/z 的二级质谱图 m/z 的可能结构 m/z 的可能结构 2013 Waters Corporation 13 图 12. 紫外谱图中 RT 8.60 min 峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构 6

7 18.68min 杂质二级质谱图 18.68min 杂质一级质谱图 图 13. 紫外谱图中 RT min 峰包含的杂质一级及二级质谱图及可能结构 结论本实验将常规 PLC 色谱柱检测方法平行转化为亚 2 µm 的 UPLC 色谱柱检测, 分析时间由 60 min 缩短至 25 min, 大大提高分析效率, 同时流速由 1 ml/min 降至 0.45 ml/min, 节约了溶剂成本 分离度及出峰情况与原谱图保持一致 应用 Xevo G2-S QTof 能得到最准确的分子量, 其杂质质量偏差在 0.8 mda 以内, 同时利用 MeteboLynx 智能软件, 快速得到包含所有杂质峰 m/z 保留时间 分子量 分子式 质量偏差 峰面积及具体结构信息的杂质列表, 提取离子流图 一级和二级质谱图等信息, 大大节省人力及时间 通过此杂质列表及质谱图可得到杂质的可能结构, 再通过 Massragment 功能对杂质二级碎片结构进行匹配进而确定杂质结构 从此推断流程可看出, 在高效的 UPLC 精准的 QTof 仪器及强大的智能软件帮助下, 复杂的杂质结构鉴定工作变得更简单轻松, 对人员的经验 资历背景依赖性降低, 大大节省人力 物力和时间成本, 对于药物的有关物质研究工作起到积极的推动作用 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, Xevo, MassLynx, ACQUITY UPLC, UPLC 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 MetaboLynx 是沃特世公司的商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 2014 年沃特世公司 2014 年 7 月印制于中国 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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