中国抗生素杂志年月第卷第期文章编号 : - ( ) - - 柱后衍生化 -HPLC 法检测硫酸新霉素的有关物质张杨慧 1,2 蒋孟虹 2 赵敬丹 2 秦峰 2,3 刘浩 2,* ( 中国医药工业研究总院, 上海 ; 上海市食品药品检验所, 上海 ; 复旦大学化学系, 上海

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1 中国抗生素杂志年月第卷第期文章编号 :-()-- 张杨慧 1,2 蒋孟虹 2 赵敬丹 2 秦峰 2,3 刘浩 2,* ( 中国医药工业研究总院, 上海 ; 上海市食品药品检验所, 上海 ; 复旦大学化学系, 上海 ) 较方法摘要 : 目的建立硫酸新霉素有关物质检查的柱后衍生化 -HPLC- 荧光检测法, 并与新建的 HPLC- 电化学检测法进行比色谱柱为 COSMOSIL C 18 -PAQ(.mm mm,.μm); 以 ph. 缓冲液 [ 取庚烷磺酸钠一水合物.g 和无水硫酸钠 g, 加水溶解并稀释至 ml, 用冰醋酸调节 ph 值至 (.±.)]- 乙腈 (:) 为流动相 A,pH. 缓冲液 - 乙腈 (:) 为流动相 B; 梯度洗脱 ; 柱温为 ; 流速为.mL/min 柱后衍生化试液为邻苯二甲醛溶液 [ph 值为 (.±.)]; 流速为.mL/ min 电化学检测法采用脉冲安培检测器, 金电极为工作电极, 四电位波形工作模式结果检出个杂质柱后衍生化法的检测限和定量限分别为. 和.ng 结论性好, 可作为硫酸新霉素有关物质检查的常规方法关键词 : 新霉素 ; 有关物质 ; 高效液相色谱 ; 柱后衍生化 ; 脉冲安培检测中图分类号 :R 文献标志码 :A 柱后衍生化法与电化学检测法均柱后衍生化 -HPLC 法操作简便, 灵敏度高, 重复 Detection of the related substances in neomycin sulphate by post-column derivatization HPLC Zhang Yang-hui 1,2, Jiang Meng-hong 2, Zhao Jing-dan 2, Qin Feng 2,3 and Liu Hao 2 (1 China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai ; 2 Shanghai Institute of Food and Drug Control, Shanghai ; 3 Department of Chemistry, Fudan University, Shanghai ) Abstract Objective To establish an HPLC method with post-column derivatization for detection of the related substances in neomycin sulfate. To compare the analytical performance with a new HPLC method with pulsed amperometric detector (PAD) established for the analysis of neomycin sulfate. Methods A COSMOSIL 5C 18 -PAQ column (4.6mm 250mm, 3.5μm) was used, the mobile phase A was buffer (containing 20mmol/L 1-heptanesulfonate sodium salt and 110mmol/L sodium sulfate, ph3.4±0.1)-acetonitrile (95:5) and the mobile phase B was bufferacetonitrile (60:40); the elution was in the gradient form; the column temperature was 30 and the flow rate was 1.0mL/min. The o-phthalaldehyde (OPA) solution ph(10.4±0.1) was used for the post-column derivatization at a flow rate of 0.3mL/min. A pulsed amperometric detector (PAD) was applied in the electrochemical method with golden working electrode in a four-potential working mode. Results According to the results of the two detection methods, 24 impurities could be separated. The limit of detection and the limit of quantitation for the post column derivatization method were 1.1 and 3.5ng, respectively. Conclusion Post column derivatization method was proved to be userfriendly, sensitive, and repeatable, and can be applied to the detection of related substances in neomycin sulfate. Key words Neomycin; Related substances; HPLC; Post-column derivatization; Pulsed amperometric detection 收稿日期 :-- 作者简介 : 张杨慧, 女, 生于年, 在读硕士研究生, 研究方向为抗生素质量分析与研究, zhangyh@.com * 通讯作者 : Liuhao@hotmail.com

2 张杨慧等新霉素 (neomycin) 是首个被发现的 - 脱氧链霉 [1] 胺双取代氨基糖苷类抗生素由于硫酸新霉素的 [2] 有关物质较多 ( 图 ), 杂质 ( 如新霉胺 ) 一般活性较低且具有一定的毒性, 会影响临床疗效, 导致不良反应, 因此对新霉素进行有关物质的检测是产品质量控制十分重要的环节新霉素及其有关物质缺乏特征的紫外吸收, 中 [3] 国药典年版采用 TLC 法仅控制新霉胺限度 [2] 欧洲药典. 版收载的硫酸新霉素有关物质检测方法为 HPLC- 脉冲安培检测 (PAD) 法, 流动相为三氟乙酸溶液, 但此方法并不能将杂质 LP-B 与新霉素 B [5] 分离, 且新霉胺与杂质 LP-A 不能完全分离虽然 [4-5] Hoogmartens 等改进了欧洲药典方法, 但该类分析系统价格昂贵, 对操作人员的技能要求较高, 不利于检测方法的普及国内外文献报道硫酸新霉素的有关物质分析方法还有 HPLC- 蒸发光散射检测 (ELSD) 法 [6-7] [8-9] [10-13], 柱前衍生化 -HPLC 法,LC-MS 法等 ELSD 具有通用性强维护要求低等优点, 但其要求流动相具有挥发性, 这使得色谱分离系统的优化受到较大的限制柱前衍生化法通常采用的衍生化试剂为邻苯二甲醛, 茚三酮等, 但该方法操作繁琐, 且柱前衍生物不稳定, 易发生荧光淬灭文献报道 [10] 两种 LC-MS 法, 第一种采用三氟乙酸 / 五氟丙酸色谱系统分离, 但该流动相中的多氟羧酸会抑制质 [11-13] 谱离子化效率第二种是采用 HILIC 柱, 但该色谱柱无法将新霉素及其有关物质有效分离, 仅在血浆, 动物的药物残留检测中应用较多本文参考文献 [5] 采用分离能力较强的离子对 HPLC 分离系统, 新建了硫酸新霉素有关物质检查的柱后衍生化 -HPLC- 荧光检测法该方法操作简便, 灵敏度高, 不仅提高了色谱分离能力, 同时避免了昂贵的电化学检测器的使用, 有利于方法的普及, 可作为新霉素有关物质检测的常规方法本文同时将新建 HPLC 分离系统与电化学检测器联用, 并对两种方法进行了比较仪器与材料仪器 :Agilent 高效液相色谱仪,Agilent 荧光检测器,Pickering PCX 柱后衍生化系统,ICS- + 型离子色谱仪 (Thermo Scientific), Waters //SFO 制备液相色谱仪庚烷磺酸钠一水合物 ( 色谱纯 ) 由东京化成工业株式会社提供 ; 乙腈和甲醇 ( 色谱纯 ) 由 Merck 公司提供 ; 冰醋酸无水硫酸钠硼酸氢氧化钠和 - R 4 H 2 C NH H 2 C O 2 R O 1 O R2 NH 2 O OH NHR 3 NH 2 R 1 R 2 R 3 R 4 新霉素 B H CH 2 NH 2 H NH 2 新霉素 C CH 2 NH 2 H H NH 2 巴龙霉素 I H CH 2 NH 2 H OH 巴龙霉素 II CH 2 NH 2 H H OH LP-B H CH 2 NH 2 Ac NH 2 R 2 H 2 C H 2 N O NHR 1 NH 2 R 1 R 2 新霉胺 H NH 2 巴龙霉胺 H OH LP-A Ac NH 2 图新霉素及其主要杂质结构 Fig. Structures of neomycin and its chief impurities 巯基乙醇 ( 分析纯 ) 均由上海凌峰化学试剂有限公司提供 ; 邻苯二甲醛 ( 色谱纯 ) 由北京百灵威科技有限公司提供 ; 水为纯化水电化学检测系统采用的无水硫酸钠由 SIGMA 提供,% 氢氧化钠溶液由 ACROS 提供硫酸新霉素标准品 ( 批号 :-, 中国食品药品检定研究院 ); 硫酸新霉素对照品 ( 批号 :,USP 对照品 ); 硫酸新霉素对照品 ( 批号 : N,Batch. 欧洲药典 ); 弗莱菌素 ( 新霉素 B 组分, 华曙制药集团 ); 新霉素 C( 华曙制药集团 ); 新霉胺 ( 批号 :-, 中国食品药品检定研究院 ); 核糖霉素 ( 批号 :, 中国食品药品检定研究院 ); 巴龙霉素 I(paromomycin sulfate 批号 : -EOD--,Toronto Research Chemicals); 巴龙霉胺 ( 批号 :P,Toronto Research Chemicals); 硫酸新霉素 ( 批号 :N-- N-- N--B N--A, 上海新亚药业有限公司 ) 方法. 色谱分离系统.. 柱后衍生化 -HPLC 法色谱系统色谱柱 :COSMOSIL C 18 -PAQ(.mm mm,.μm); 流动相 A:pH. 缓冲液 [ 取庚烷磺酸钠一水合物.g 和无水硫酸钠 g, 加水溶解并稀释至

3 ml, 用冰醋酸调节 ph 值至 (.±.)]- 乙腈 (:); 流动相 B:pH. 缓冲液 - 乙腈 (:); 按表进行线性梯度洗脱 ; 流速 :.ml/min; 柱温 ; 进样体积 :μl 柱后衍生系统 : 衍生化试剂 [ 取邻苯二醛.g 甲醇 ml - 硫基乙醇 ml 和硼酸盐缓冲液 ( 称取.g 硼酸和.g 氢氧化钠, 加水溶解并稀释至 ml, 用 mol/l 硼酸溶液或 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph 值至.±.)mL, 混匀, 用.μm 滤膜滤过 ] 的流速为.mL/min 荧光检测器 : 激发波长 :nm, 发射波长 : nm.. HPLC-PAD 法色谱系统同柱后衍生化法 -HPLC 的色谱分离条件, 进样体积为 μl 柱后碱溶液 ( 量取超纯水 ml, 氦气脱气 min 后, 量取 % 氢氧化钠溶液 ml, 混合, 继续通氦气脱气 min 即得 ); 流速为.mL/min. 溶液的配制.. 柱后衍生化 -HPLC 法系统适用性溶液 : 取国产硫酸新霉素对照品约 mg, 置于 ml 量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 表梯度洗脱程序 Tab. Gradient elution procedures 流动相 /% 流动相 /% 中国抗生素杂志年月第卷第期摇匀即得 (.mg/ml)( 图 A) 供试品溶液 : 取硫酸新霉素适量, 加水溶解并稀释制成浓度为.mg/mL 的溶液.. HPLC-PAD 法系统适用性溶液 : 取国产硫酸新霉素对照品约 mg, 置于 ml 量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀即得 (.mg/ml)( 图 B) 供试品溶液 : 取硫酸新霉素适量, 加水溶解并稀释成浓度为.mg/mL 的溶液方法学考察. 专属性取硫酸新霉素约 mg, 精密称定, 置于 ml 量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为样品贮备液 (mg/ml); 酸破坏试验 : 取样品贮备液 ml, 加 mol/l 盐酸.mL, 混匀, 室温放置 h, 加 mol/l 氢氧化钠溶液.mL 中和碱破坏试验 : 取样品贮备液 ml, 加 mol/l 氢氧化钠.mL, 混匀, 室温放置 h, 加 mol/l 盐酸溶液.mL 中和氧化破坏试验 : 取样品贮备液 ml, 加 % 双氧水 ml, 混匀, 室温放置 h 高温破坏试验: 取样品贮备液 ml, 于高温放置 h 光照破坏试验: 取样品贮备液 ml, 于和 nm 紫外光放置 h 分别将上述破坏样品用纯水稀释制成约含新霉素.mg/ ml 的溶液按.. 项下色谱条件进样分析色谱图如图所示主峰与降解杂质峰之间均分离良好, 新建方法的专属性良好. 重复性精密称取同一批号 (N--B) 的硫酸新霉素份, 加水溶解并稀释制成约含新霉素.mg/ ml 的溶液, 进样分析, 按面积归一化法计算, 新 A Pespoe/mm ~ 和 ~: 未知杂质 ;: 巴龙霉胺 ;:LP-A;: 新霉胺 ;: 核糖霉素 ;: 巴龙霉素 I;:LP-B;: 新霉素 C;: 新霉素 B; A: 柱后衍生化 -HPLC 法 ;B:HPLC-PAD 法图系统适用性溶液典型色谱图 Fig. HPLC chromatogram for system suitability solution B

4 张杨慧等 A B C D E A: 酸破坏 ;B: 碱破坏 ;C: 高温破坏 ;D: 光照破坏 ;E: 氧化破坏 ;: LP-A;: 新霉胺 ;: 核糖霉素 ;: 巴龙霉素 I;:LP-B;: 新霉素 C;: 新霉素 B 图专属性试验色谱图 Fig. HPLC Chromatograms for specificity test 霉胺均为.%; 核糖霉素的平均值为.%,RSD 为.%(n=); 巴龙霉素 I 的平均值为.%,RSD 为.%(n=); 杂质总量的平均值为.%,RSD 为.%(n=), 该方法重复性良好. 检测限 (LOD) 与定量限 (LOQ) 本方法的 LOD 和 LOQ 按新霉素 B 峰的信噪比 : 和 : 计, 分别为. 和.ng. 稳定性取批号为 N--B 的供试品溶液, 在 h 内每隔 h 进样次, 最大杂质峰面积的平均值为.%, RSD 为.%(n=); 杂质总量的平均值为.%, RSD 为.%(n=), 表明供试品溶液在 h 内稳定. 耐用性分别考察了供试品溶液在 Cosmosil C -PAQ Zorbax Eclipse plus C TSKGEL ODS-S C XBridge C 种不同品牌填料的色谱柱上的分离情况, 各杂质之间以及与新霉素 B 和新霉素 C 之间均能得到有效分离, 说明本方法的耐用性较好样品测定采用柱后衍生化 -HPLC 法对批硫酸新霉素以及国产与进口对照品按.. 项下色谱条件及.. 项下样品浓度进行有关物质检查, 按归一化法计算, 结果表明, 国产硫酸新霉素杂质总量 (.%~.%) 大于进口对照品的杂质总量 (.%~.%), 同时采用 HPLC-PAD 法按.. 项下色谱条件及.. 项下样品浓度进样分析 ( 表 ) 讨论. 分离条件优化本文采用含烷基磺酸盐的离子对 HPLC 系统, 分别考察了己烷磺酸钠庚烷磺酸钠和辛烷磺酸钠种离子对试剂对分离的影响结果显示, 采用相同浓度的己烷磺酸钠, 则保留较弱, 有关物质在 min 内全部洗脱, 且几乎均未分离 ; 采用辛烷磺酸钠则保留过强, 新霉素 B 在 min 后才洗脱考虑到分析时间的合理性, 选择了庚烷磺酸钠作为离子对试剂考察了不同浓度庚烷磺酸钠 ( 和 mmol/l) 对色谱分离的影响浓度较低时 ( 和 mmol/l),

5 中国抗生素杂志年月第卷第期表有关物质检测的结果 Tab. The results of the related substances detection 批号方法新霉胺 /% 核糖霉素 /% 巴龙霉素 I/% 其他最大单个杂质 /% 杂质总量 /% 新霉素 C/% N-- 柱后衍生化 -HPLC 法 N N--B N--A ( 中检院 ) N(EP) (USP) N-- HPLC-PAD 法 N N--B N--A ( 中检院 ) N(EP) (USP) 注 : - 表示未检出新霉素 C 与其前相邻杂质共洗脱浓度为 mmol/ L 时, 各峰之间分离较好, 最终确定庚烷磺酸钠浓度为 mmol/l 考察了不同浓度硫酸钠 ( 和 mmol/l) 对色谱分离的影响浓度越高, 保留时间越短综合考虑分离度, 分析时间合理性, 确定硫酸钠浓度为 mmol/l 采用冰醋酸调节缓冲液 ph 值, 考察了 ph... 和. 条件下新霉素 B 及其有关物质的分离情况 ph 在.~. 范围内,pH 值对新霉素及其有关物质之间的分离影响极小,pH. 时, 新霉素 C 与其前相邻杂质具有较高的分离度, 新霉素 B 峰对称性较好故确定缓冲液 ph 值为 (.±.) 考察了流动相中添加乙腈或甲醇对分离的影响结果显示, 采用乙腈可获得更好的分离和更高的柱效, 故选择乙腈作为有机改性剂考察了色谱柱温对分离的影响, 结果显示, 降低柱温不仅可改善分离, 也可改善新霉素 C 与其前相邻杂质之间的分离, 但柱温降低至 ~ 时, 峰形拖尾严重, 保留时间过长, 故选择柱温为. 杂质 LP-A 和 LP-B 确认采用制备液相, 分别制备 HPLC- 柱后衍生系统中保留时间约为和 min 的杂质, 氮吹富集后, 采用文献 [5] 的 HPLC-PAD 系统进行确认结果显示收集的杂质与文献中的杂质 LP-A 和杂质 LP-B 峰对应, 推断保留时间约为 min 的杂质为 LP-A, min 的杂质为 LP-B. HPLC-PAD 法与柱后衍生化 -HPLC 法比较.. 检测方法的比较邻苯二甲醛 (OPA) 与氨基糖苷类抗生素的衍生化反应位点为伯氨基, 如果目标物中不含伯氨基基团, 则无法进行衍生化, 从而不会被紫外活荧光检 [14] 测器检测到 HPLC-PAD 法采用脉冲安培检测器 ( 四电位波形 ), 电活性分子的羟基在工作电极表面发生氧化还原反应, 从而产生电极信号而被检测到实验结果显示, 两批样品 ( 批号 :N-- N--B) 分别在柱后衍生化 -HPLC 与 HPLC- PAD 系统中检出的杂质个数相同, 即 HPLC-PAD 系统中检测到的杂质在柱后衍生化 -HPLC 系统中均可检测到, 但两种方法的检测结果存在差异, 这与两种检测方法的检测原理不同有关 ( 图和表 ).. 灵敏度比较 HPLC-PAD 法的检测限按新霉素 B 峰的信噪比 : 计, 约为.ng, 与柱后衍生化 -HPLC 法检测限 (.ng) 相近柱后衍生化 -HPLC 法与 HPLC-PAD 法均具有较高的灵敏度.. 实验条件比较 HPLC-PAD 法对实验人员的操作技能要求较高 ; PAD 的电极易钝化, 需要经常清洗, 且清洗电极之后 [15] 分析系统需要较长的平衡时间 ; 实验用到的水和试剂均不得含有电化学活性杂质而柱后衍生化 -HPLC 法在仪器及试剂等方面要求较低, 具有更好的普适性结论

6 张杨慧等本文建立的柱后衍生化 -HPLC- 荧光检测法操作简便分离能力强, 准确度和精密度均较好, 适用于硫酸新霉素有关物质的检测参考文献 [] [] [] [] [] [] [] A 1 :N-- 柱后衍生化法 ;A 2 :N-- 电化学检测法 ;B 1 :N--B 柱后衍生化法 ;B 2 :N-- 电化学检测法 Huang F, Spiteller D, Koorbanally N A, et al. Elaboration of neosamine eings in the biosynthesis of neomycin and butirosin[j]. Chem Bio Chem,, (): -. 国家药典委员会. 中华人民共和国中国药典 ( 版二部 )[S]. 北京 : 中国医药科技出版社, : -. 欧洲药典委员会. 欧洲药典. 版 [S]. 欧洲药典质量管理局, : -. Adams E, Roets E, Hoogmartens J, et al. Determination of neomycin sulfate by liquid chromatography with pulsed electrochemical detection[j]. J Chromatogr A,, (): -. Zawilla N H, Diana J, Hoogmartens J, et al. Analysis of neomycin using an improved liquid chromatographic method combined with pulsed electrochemical detection[j]. J Chromatogr B,, (): -. 孙学志, 史静杰, 岳素雪. HPLC-ELSD 法测定新霉素的有关物质 [J]. 医学前沿,, ():. 戴向东, 李慧义, 张启明. HPLC-ELSD 法测定硫酸新霉素的含量及有关物质新霉胺 [J]. 药物分析杂志,, (): -. A B Pespoe/mm Pespoe[mm] - 图两种分析系统分析硫酸新霉素的图谱 Fig. The results of analysis of sulfate neomycin with two analytical systems - [] [] A.. 曾令高, 范能全, 曾杰. 柱前衍生化反相高效液相色谱法测定硫酸新霉素的含量 [J]. 中国生化药物杂志,, (): -. 李锋, 邱小明, 石贤爱. OPA 柱前衍生法测定硫酸新霉素的含量 [J]. 福州大学学报 ( 自然科学版 ),, (): -. [] Stypulkowskaa K, Blazewicza A, Fijalek Z, et al. Determination of neomycin and related substances in pharmaceutical preparations by reversed-phase high performance liquid chromatography with mass spectrometry and charged aerosol detection[j]. J Pharmaceut Bio Med,, : -. [] Oertel R, Renner U, Kirch W. Determination of neomycin by LC-tandem mass spectrometry using hydrophilic interaction chromatography[j]. J Pharmaceut Biomed,, (): B.... [] Kumar P, Rubies A, Centrich F, et al. Hydrophilic interaction chromatography for the analysis of aminoglycosides[j]. J Sep Sci,, (): -. [] Chen L, Chen H, Shen M. Hydrophilic interaction chromatography combined with tandem mass spectrometry method for the quantification of tobramycin in human plasma and its application in a pharmacokinetic study[j]. J Chromatogr B,, C: -. [] 周茂金, 梅如冰, 苏美英, 等. 种氨基糖苷类抗生素 FDNB 衍生化产物的电喷雾离子阱质谱及色谱行为研究 [J]. 中国药业杂志,, (): -. [] 齐雪琴. 电化学液相色谱分析庆大霉素的方法 [J]. 福建分析测试,, ():

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.