652 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 品各 10 袋 ( 片或粒, 胶囊剂取内容物 ), 研细, 取一次服用量 ; 糖浆剂口服溶液剂和煎膏剂样品量取一次服用量 ; 分别置 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声

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寇不
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1 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 651 止咳平喘类制剂中可能违禁添加的 14 种药物的 UPLC-DAD 法检测夏方亮, 王玉林, 王建强, 曹洪杰, 邵晓玮 ( 滨州市食品药品检验检测中心, 山东滨州 ) 摘要 : 建立了超高效液相色谱法检测止咳平喘类制剂中可能添加的 14 种药物采用 Acquity UPLC BEH Shield RP18 色谱柱, 以 0.25% 甲酸铵溶液 ( 用甲酸调至 ph 3.2) 甲醇为流动相, 线性梯度洗脱, 使用 UPLC-DAD 检测, 检测波长 258 nm, 结合保留时间和 UV 光谱定性结果 14 种化合物分离完全, 回收率为 96.3%~ 103.4%,RSD 为 0.08%~ 0.72% 在 16 种止咳平喘类制剂中检出了盐酸氨溴索醋酸泼尼松和咖啡因该方法准确快速灵敏度高, 可为止咳平喘类制剂中可能违禁添加化学成分的检测提供参考关键词 : 止咳平喘 ; 违禁添加 ; 超高效液相色谱 ; 含量测定中图分类号 :TQ ;O 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) DOI: /j.cnki.cjph 咳嗽和哮喘是常见的呼吸系统疾病, 一些具有止咳平喘效果的中药制剂以及部分标示有相关功效的保健品为获得快速疗效而违禁添加止咳平喘类化学成分 [1], 其添加剂量无法控制, 患者盲目服用容易产生不良反应近年来开发了很多方法检测中药制剂和保健品中违禁添加的化学成分, 如薄层色谱法 (TLC) 高效液相色谱法 (HPLC) 液相色谱 - 质谱联用法 (LC-MS/MS) 等 [2 7], 其中 TLC 法较适用于快检筛查,HPLC 法和 LC-MS/MS 法具有较高的准确度, 但耗时较长研究报道了超高效液相色谱 - 质谱联用法 (UPLC-MS/MS) [8 9], 但该方法须配备质谱检测器本研究建立了 UPLC 法, 利用二极管阵列检测器 (DAD), 在较短时间内可同时分离并检测 14 种止咳平喘类化学物质, 方法准确度和精密度高, 可为止咳平喘类中药制剂和保健品中违禁添加化学成分的检验提供参考方法 1 仪器与试药 Acquity 超高效液相色谱仪 ( 美国 Waters 公司, 配备 DAD 检测器 ) 硫酸特布他林 (1, 含量 99.8%, 批号 ) 二羟丙茶碱 (2, 含量 99.9%, 批号 ) 茶碱 (3, 含量 100.0%, 批号 ) 咖啡因 (4, 含量收稿日期 : 作者简介 : 夏方亮 (1980 ), 男, 主管药师, 从事药品质量研究 Tel: xiafl1980@126.com 99.9%, 批号 ) 多索茶碱 (5, 含量 99.9%, 批号 ) 磺胺甲噁唑 (6, 含量 99.6%, 批号 ) 盐酸二氧丙嗪 (7, 含量 99.9%, 批号 ) 富马酸酮替芬 (8, 含量 100.0%, 批号 ) 盐酸氨溴索 (9, 含量 99.9%, 批号 ) 盐酸苯海拉明 (10, 含量 99.9%, 批号 ) 枸橼酸喷托维林 (11, 含量 98.7%, 批号 ) 磷酸苯丙哌林 (12, 含量 99.8%, 批号 ) 醋酸泼尼松 (13 含量 99.7%, 批号 ) 和地西泮对照品 (14, 含量 99.9%, 批号 ) 均购自中国食品药品检定研究院 16 批样品均购自流通市场, 包括颗粒剂 4 批片剂 4 批胶囊剂 3 批糖浆剂 3 批口服溶液剂 1 批和煎膏剂 1 批, 标示主治功能为清热化痰止咳平喘等, 生产厂家来自北京广东安徽四川云南等地甲醇为色谱纯, 甲酸和甲酸铵为优级纯, 水为纯化水 2 方法与结果 2.1 溶液配制对照品溶液 : 精密称取上述 14 种对照品适量, 加甲醇溶解, 并稀释制成 1 mg/ml 的溶液, 作为对照品贮备液精密量取 1 和 11 贮备液各 5 ml,9 10 和 12 贮备液各 3 ml, 其余贮备液各 1 ml, 置同一 50 ml 量瓶中, 用甲醇定容, 作为对照品溶液 ( 即 µg/ml,9 10 和 µg/ml, 其他 20 µg/ml) 供试品溶液 : 取上述颗粒剂片剂和胶囊剂样

2 652 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 品各 10 袋 ( 片或粒, 胶囊剂取内容物 ), 研细, 取一次服用量 ; 糖浆剂口服溶液剂和煎膏剂样品量取一次服用量 ; 分别置 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声 30 min, 用甲醇定容, 过滤精密量取续滤液 1 ml, 置 50 ml 量瓶中, 用甲醇定容, 作为供试品溶液 2.2 色谱条件色谱柱 Acquity UPLC BEH Shield RP18 柱 (2.1 mm 100 mm,1.7 µm) ; 流动相 0.25% 甲酸铵溶液 ( 用甲酸调至 ph 3.2,A) 甲醇 (B), 按表 1 进行线性梯度洗脱 ; 检测波长 258 nm ; 流速 0.3 ml/min ; 柱温 40 ; 进样量 1 µl 各色谱峰之间的分离度均符合要求, 对照品 1 峰的理论板数为 9 000, 其余峰的理论板数均在以上, 色谱图见图 1A, 各化合物 UV 光谱图见图 1B 表 1 梯度洗脱条件 Tab.1 Gradient Elution Procedure t/min A/% B/% 线性试验和精密度试验取 2.1 项下 14 种对照品贮备液适量, 用甲醇逐步稀释配制系列浓度对照品溶液 (n=6), 作为线性试验用溶液, 按 2.2 项下色谱条件进样以浓度 c 为横坐标, 峰面积 A 为纵坐标, 计算线性回归方程结果见表 2 将对照品溶液分别逐级稀释并进样, 计算各化合物的信噪比, 并计算各化合物的检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 结果见表 2 取 2.1 项下对照品溶液, 按 2.2 项下色谱条件测定, 连续进样 6 次, 记录峰面积, 计算各化合物峰面积的 RSD 结果见表回收率试验精密量取 1 和 11 贮备液各 ml,9 10 和 12 贮备液各 ml, 其余成分贮备液各和 1.2 ml, 分别置同一 50 ml 量瓶中, 用未检出有违禁添加的供试品溶液定容, 配制相当于各对照品浓度 80% 100% 和 120% 的溶液, 各 3 份颗粒剂片剂胶囊剂糖浆剂口服溶液剂和煎膏剂样品各选取一种配制回收率试验溶液按 2.2 项下色谱条件测定, 计算回收率, 结果见表稳定性试验取 2.1 项下对照品溶液, 分别在和 48 h 进样, 记录色谱图, 各化合物峰面表 2 14 种化合物线性回归方程 Tab.2 Linear Regression Equations of 14 Compounds 化合物 1) 线性回归方程线性范围 /µg ml -1 LOD/µg ml -1 LOQ/µg ml -1 精密度 RSD/% 1 A=913.9c ~ A= c ~ A= c ~ A= c ~ A= c ~ A= c ~ A= c ~ A= c ~ A= c ~ A=500.8c ~ A=225.1c ~ A=821.1c ~ A= c ~ A= c ~ 注 : 1) R 2 >0.999

3 1~14 14 drugs might be added illegally in anti-cough and antiasthmatic preparations 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 653 AU t/min A λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm λ nm B A : 对照品溶液典型色谱图,B :UV 光谱图 1-1 ;2-2 ;3-3 ;4-4 ;5-5 ;6-6 ;7-7 ;8-8 ;9-9 ;10-10 ;11-11 ;12-12 ;13-13 ;14-14 图 1 对照品溶液的典型色谱图 (A) 以及各成分的 UV 光谱图 (B) Fig.1 Typical Chromatograms of Reference Solution (A) and UV Spectrograms of 14 Compounds (B) 积的 RSD 均不超过 0.3%, 表明对照品溶液在 48 h 内稳定性良好 2.6 样品测定取 2.1 项下供试品溶液, 按 2.2 项下色谱条件测定, 根据保留时间和 UV 光谱定性, 按外标法以峰面积计算含量, 测得 16 批样品中有 2 批检出 9, 含量以每日服用剂量计算分别为和 mg ; 有 1 批检出 13, 含量以每日服用剂量计算为 21.5 mg ; 有 1 批检出 4, 含量以每日服用剂量计算为 mg 3 讨论本试验选择的 14 种化合物中 7 11 和 12 具有止咳作用,9 具有祛痰作用, 可抑制哮喘, 为抗过敏药, 同时 13 是肾上腺皮质激素类

4 654 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 表 3 回收率试验结果 1) /%(n=9) Tab.3 Results of Recovery Test 1) /%(n=9) 化合物颗粒剂片剂胶囊剂糖浆剂口服溶液剂煎膏剂 (0.57) 99.0(0.32) 97.2(0.47) 97.2(0.31) 96.5(0.21) 97.8(0.14) (0.28) 97.3(0.36) 97.8(0.38) 96.8(0.33) 98.2(0.60) 98.3(0.08) (0.32) 100.9(0.19) 98.1(0.22) 99.0(0.28) 98.9(0.35) 98.5(0.32) (0.22) 99.7(0.25) 101.4(0.30) 101.3(0.14) 101.3(0.32) 97.3(0.36) (0.13) 98.5(0.38) 101.6(0.19) 102.5(0.60) 102.8(0.41) 99.0(0.25) (0.17) 101.6(0.09) 98.5(0.28) 100.4(0.54) 97.2(0.52) 101.3(0.18) (0.11) 96.9(0.23) 97.8(0.33) 98.3(0.72) 98.1(0.47) 102.6(0.56) (0.16) 98.8(0.17) 99.6(0.64) 96.4(0.17) 97.6(0.43) 103.4(0.42) (0.33) 102.7(0.40) 98.7(0.62) 97.1(0.62) 100.5(0.30) 102.5(0.66) (0.25) 96.3(0.51) 99.4(0.15) 99.2(0.30) 102.6(0.51) 98.2(0.51) (0.61) 97.8(0.58) 98.2(0.66) 102.5(0.47) 101.7(0.56) 96.8(0.47) (0.69) 100.5(0.55) 100.2(0.63) 98.1(0.45) 97.5(0.62) 102.9(0.33) (0.38) 98.4(0.39) 102.3(0.70) 99.1(0.39) 98.2(0.71) 98.0(0.28) (0.44) 98.9(0.29) 97.4(0.55) 101.8(0.58) 98.6(0.36) 97.8(0.19) 注 : 1) 括号内为相应 RSD 结果 (n=9) 药物, 还具有抗炎抗风湿免疫抑制作用 ;4 是一种黄嘌呤生物碱化合物, 为中枢神经兴奋剂 ;6 是一种广谱抗菌药, 临床常用于治疗尿路感染呼吸道感染等 ;14 是一种苯二氮䓬类抗焦虑药, 随用药量增大而具有抗焦虑镇静催眠及中枢性肌肉松弛作用这 14 种化合物均为临床常用药品, 疗效确切且价廉易得, 容易被违禁添加在中药制剂或保健品中, 长期服用会对身体健康造成不良影响 14 种化合物大多在及 300 nm 处有最大吸收, 但 230 nm 左右有较大的溶剂吸收, 基线波动较大, 而 300 nm 附近某些化合物吸收较弱, 影响定量准确性, 因此选取 258 nm 为检测波长, 在该波长处除 1 10 和 11 吸收偏弱,LOD 稍高外, 其余化合物均具有较低的 LOD, 且理论板数较高国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件 ( 批准件编号 ) 收录了止咳平喘类中成药中违禁添加化学药品的检验方法, 分 2 组共检验 8 种化合物, 每次进样运行时间超过 50 min 文献报道采用 HPLC-DAD-MS/MS 法测定止咳平喘类中药制剂中添加的 12 种化学药品 [6], 每次进样运行时间超过 60 min 与已有工作相比, 本研究所建立的色谱条件采用更易推广的 DAD 检测器, 可同时检测 14 种可能会添加的化学药物, 且运行时间缩短至 7 min, 极大地提高了工作效率参考文献 : [1] 徐硕, 徐文峰, 金鹏飞, 等. 止咳平喘类中成药和保健品中非法添加化学药物检测技术的研究进展 [J]. 中南药学, 2017, 15(6): [2] 孔卫东, 周世玉. 高效液相色谱法检测止咳平喘类中成药中非法添加的醋酸泼尼松茶碱 [J]. 中国药业, 2013, 22(14): [3] 王艳红, 李冰, 陈真. 高效液相色谱法同时测定止咳平喘类中成药中违规添加的磺胺嘧啶等 7 种化学抗菌物质 [J]. 中国药学杂志, 2014, 49(8): [4] 沈于兰, 申兰慧, 苏嘉焱. HPLC 法同时测定止咳平喘类中成药中非法添加的 9 种化学成分 [J]. 中国药品标准, 2016, 17(1): [5] 高辉, 李冰, 王杰. HPLC-DAD-MS/MS 法用于止咳平喘类中成药中添加 14 种肾上腺皮质激素的筛查和定量研究 [J]. 药物分析杂志, 2015, 35(8): [6] 李奕婧, 李晓琳, 韩家忠, 等. HPLC-DAD-MS/MS 法检测止咳平喘类中药制剂中非法添加的 12 种化学药品 [J]. 药学学报, 2017, 52(6): [7] 宋祥珍, 李莉, 张自强. 非法添加止咳平喘类药物中药制剂的 HPLC-MS/MS 检测系统研究 [J]. 药物分析杂志, 2010, 30(10): [8] 陈涛, 张燕, 陈安珍, 等. UPLC-MS/MS 法检测止咳平喘类中药制剂中非法添加的茶碱 [J]. 中国药师, 2010, 13(7): [9] 陈晓虎, 秦剑, 苏晶, 等. UPLC-Q-TOF 检测止咳平喘类中成药中非法添加的 8 种化学药品 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2015, 21(4):

中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 655 Determination of Fourteen Illegally Added Drugs in Anti-cough and Antiasthmatic Preparations by UPLC-DAD XIA Fangliang, WANG Yulin, WANG

5 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 655 Determination of Fourteen Illegally Added Drugs in Anti-cough and Antiasthmatic Preparations by UPLC-DAD XIA Fangliang, WANG Yulin, WANG Jianqiang, CAO Hongjie, SHAO Xiaowei (Binzhou Food and Drug Inspection and Testing Center, Binzhou ) ABSTRACT: A UPLC-DAD method was established for the determination of fourteen drugs that may be illegally added in anti-cough and antiasthmatic preparations. An Acquity UPLC BEH Shield RP18 column was used, with the mobile phase of 0.25% ammonium formate solution (adjusted to ph 3.2 with formic acid) methanol by linear gradient elution, at the detection wavelength of 258 nm. The qualitative analysis was carried out based on retention time and spectrum by UPLC-DAD. Under the above conditions, all of the fourteen compounds have a good separation. Their recoveries were 96.3%-103.4%, with RSDs of 0.08%-0.72%. Ambroxol hydrochloride, prednisone acetate and caffeine were detected in sixteen kinds of anti-cough and antiasthmatic samples. This method is accurate, rapid and sensitive, which could be a reference method for the determination of some drugs that may be illegally added in anti-cough and antiasthmatic preparations. Key Words: anti-cough and antiasthmatic; illegally adding; UPLC; content determination UPLC pump A pump B high pressure mixing injector column DAD detector 1~14 14 drugs might be added illegally in anti-cough and antiasthmatic preparations

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

652 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 品各 10 袋 ( 片或粒, 胶囊剂取内容物 ), 研细, 取 一次服用量 ; 糖浆剂 口服溶液剂和煎膏剂样品量取一次服用量 ; 分别置 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声

652 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2018, 49(5) 品各 10 袋 ( 片或粒, 胶囊剂取内容物 ), 研细, 取一次服用量 ; 糖浆剂口服溶液剂和煎膏剂样品量取一次服用量 ; 分别置 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声