2.2 抗体的效价及 I g 亚类鉴定 (1) 效价测定 : 用纯化的 NRP-1 b1b2 融合蛋白以 5 μg. ml -1 的浓度包被 96 孔板, 用间接 ELISA 进行测定 (2 ) 亚类的鉴定 : 采用鼠亚类 ELISA 检测试剂盒进行鉴定 2.3 细胞免疫荧光分析 NRP-1 在 L

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采戎
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1 抗人 NRP-1 单克隆抗体对结肠癌 LOVO 细胞株的促凋亡作用曹畅 1#, 吕莎 2#, 李哲 2, 王显江 2, 杨云 2, 罗芳洪 2, 王生育 2, 颜江华 2*, 史涛 1* (1. 中国人民解放军 174 医院药剂科, 福建厦门 ;2. 厦门大学医学院抗癌研究中心, 福建厦门 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究抗人神经菌毛素 1(neuropilin1,NRP-1) 单克隆抗体对结肠癌 LOVO 细胞的促凋亡作用方法 : 小鼠腹水法生产抗 NRP-1 单克隆抗体 (NRP-1 MAb) 并用 rprotein A 亲和柱纯化抗体 ; 间接 ELISA 检测抗体的滴度水平 ; 细胞免疫荧光检测 NRP-1 蛋白在结肠癌细胞株 LOVO 上的表达 ;MTT 法检测 NRP-1 MAb 对 LOVO 的生长抑制作用 ;DAPI 荧光显微镜法观察细胞凋亡形态 ; ANNEXIN V-FITC/PI 流式细胞仪法检测 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞凋亡 ; DNA Ladder 方法检测 NRP-1 MAB 诱导 LOVO 的凋亡作用 ; Western blotting 检测凋亡蛋白 Caspase-3 蛋白的表达结果 : SDS-PAGE 和间接 ELISA 检测纯化的 NRP-1 MAb 具有较高纯度和效价 ; 细胞免疫荧光染色显示 NRP-1 定位于 LOVO 细胞膜上 ;MTT 法检测和 ANNEXIN V-FITC/PI 流式细胞仪法检测结果显示,NRP-1 MAb 对 LOVO 细胞有生长抑制作用和促凋亡作用 ;DAPI 染色, 荧光显微镜观察发现,NRP-1 MAb 可以诱导 LOVO 细胞核浓缩与碎裂 ;DNA Ladder 表明在 NRP-1 MAb 的作用下,LOVO 细胞 DNA 提取物呈现很亮的彗星梯状拖尾, 说明发生凋亡 ;Western blotting 检测到在 NRP-1 MAb 作用下,LOVO 细胞的 Caspase-3 蛋白表达量增加结论 : 纯化的 NRP1 MAb 能抑制 LOVO 细胞的生长并诱导其凋亡 [ 关键词 ] NRP-1; 单克隆抗体 ;LOVO 细胞株 ; 促凋亡作用人神经菌毛素 1(Neuropilin-1,NRP-1) 是一个新型的多功能受体, 最初作为轴突导向因子 Semaphorin3(Sema3) 的受体, 在神经细胞导向轴突生长方面发挥调节作用 ; 同时也作为血管内皮细胞因子 (Vascular endothelial growth factor,vegf) 的共受体, 对内皮细胞的活化增殖与迁移进行调控, 介导血管的生成 NRP-1 与肿瘤的发生发展密切相关, 人类的许多肿瘤组织上都有 NRP-1 的高表达, 包括乳腺癌黑色素瘤神经胶质瘤结肠癌, 但是在相应的正常组织细胞中却少有表达最近研究表明,NRP-1 既可作为多种细胞因子的共受体, 涉及多种细胞因子介导的经典信号通路, 而且其本身也有独立的信号通路, 参与多种肿瘤细胞的恶性表型调控因此,NRP-1 被认为是继 VEGFR 后又一重要的抗肿瘤新靶标本实验室在前期的工作中, 利用基因工程技术克隆与表达了 NRP1 b1b2 蛋白, 并利用细胞融合杂交瘤技术建立了能稳定分泌抗 NRP1/b1b2 单克隆抗体的杂交瘤细胞株本文在前期工作的基础上, 进一步研究了 NRP-1 MAb 对结肠癌细胞株 LOVO 的促凋亡作用为发展一种针对 NRP-1 靶标的新型抗肿瘤策略奠定基础 1 材料 1.1 仪器蛋白电泳仪购自 Bio-Rad 公司 rprotein A 亲和层析柱购自瑞典 GE,Healthcare 流式细胞仪 ( 型号 FACSCali2bur) 为美国 BD 公司产品 Model 3550 酶标仪购自 Bio-Rad 公司 1.2 动物及试剂抗人 NRP-1 杂交瘤细胞, 由本实验室制备 LOVO 结肠癌细胞株由厦门大学抗癌研究中心保存 6~8 周龄雌性 Balb/c 小鼠由厦门大学医学院实验动物中心提供 ANNEXINV-FITC /PI 凋亡双染试剂盒, 购自南京凯基生物公司四氮唑蓝 (MTT), 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG,caspase-3 抗体, 鼠亚类 ELISA 检测试剂盒购自 Sigma 公司 O-phenylenediamine (OPD), 蛋白酶抑制剂 PMSF,Enhanced chemiluminescence (ECL) 购自上海生工生物工程公司荧光染液 DAPI, 细胞裂解液 RAPI,DNA Ladder 抽提试剂盒购自碧云天生物公司 PVDF 膜购自 Bio-Rad 公司 2 方法 2.1 抗体的制备与纯化抗体的制备 : 常规培养已建立的抗 NRP-1 杂交瘤细胞将高压湿热灭菌的石蜡油腹腔注射 Balb/c 小鼠,0.5 ml/ 只,1~2 周后每只小鼠腹腔注射个杂交瘤细胞, 注射细胞 7~10 d 后, 当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水,3 000 r. min -1 离心 10 min, 收集中间澄清腹水备用抗体的纯化 :(1) 去掉 rproteina 亲和层析柱顶部和下端的盖子, 排出柱内的储存液 ; (2) 用结合缓冲液 (0.05 mol L -1 Boric acid,4.0 mol L -1 NaCl,pH9.0) 平衡柱子 ; (3) 将 NRP-1 腹水用适量结合缓冲液稀释后上样, 待样品完全进入层析柱后, 用结合缓冲液洗柱 ;(4) 用洗脱液 (0.05 mol L -1 Sodium phosphate,0.05 mol L -1 Sodium citrate, 0.3 mol L -1 NaCl, ph 3.0) 洗脱 ;(5) 收集洗脱液加入 5% 体积的 1.0 mol L -1 Tris-HCl(pH 8.0) 调节 ph 值 ;(6) 洗脱液用紫外分光光度计测定其蛋白含量, 再用 SDS-PAGE 变性电泳进行纯度测定

2 2.2 抗体的效价及 I g 亚类鉴定 (1) 效价测定 : 用纯化的 NRP-1 b1b2 融合蛋白以 5 μg. ml -1 的浓度包被 96 孔板, 用间接 ELISA 进行测定 (2 ) 亚类的鉴定 : 采用鼠亚类 ELISA 检测试剂盒进行鉴定 2.3 细胞免疫荧光分析 NRP-1 在 LOVO 上的表达将对数生长期 LOVO 细胞于盖玻片贴壁生长,12 h 后,4 预冷的 PBS 冲洗 3 次 ; 加入 Hoechst 染色试剂盒的固定液 0.5 ml,4 静置 30 min; 弃掉固定液,PBS 洗 3 遍, 每次 3 min; 在培养板加入稀释的 MAb 或等体积的 PBS,37 孵育 2 h; 弃掉一抗溶液, 用 PBS 洗 3 遍, 每次 3 min; 在培养板加 1 50 稀释的羊抗鼠 TRITC-IgG 二抗,37 避光孵育 1 h, 弃掉荧光二抗, 用 PBS 洗 3 遍, 每次 3 min; 加入 0.5 ml Hoechst 染色液, 室温染色 5 min, 摇床晃动 ; 弃掉染色液, 用 PBS 洗涤 3 遍 ; 滴 1 滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上, 盖上贴有细胞的盖玻片, 尽量避免气泡 ; 荧光显微镜下观察, 其中 Hoechst 激发波长在 350 nm 左右, 发射波长在 460 nm 左右 ; 而 TRITC 最大吸引光波长为 550 nm, 最大发射光波长为 620 nm, 拍摄图片 2.4 MTT 法检测 NRP-1 MAb 对 LOVO 的细胞毒性效应取对数生长期的 LOVO 细胞, 用 0.25% 胰酶消化, 制成单细胞悬液加入 96 孔培养板,100 l/ 孔, 细胞终浓度为个 / 孔分为实验组与对照组, 每组 4 个复孔, 置 37 o C,5% CO2 培养 24h 倒掉培养液, 实验组分别加入终浓度 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg. ml -1 NRP-1 MAb 200 ml; 对照组加入鼠 IgG 培养 24 h 加入 MTT 溶液 20 l / 孔, 继续避光培养 4 h 弃上清, 每孔加入 200 l DMSO 振荡, 用酶标仪测 490 nm 吸收值, 测量重复 3 次计算细胞抑制率 (% ): 抑制率 =( 对照组值 - 实验组值 )/ 对照组值 100% 2.5 DAPI 荧光显微镜法观察细胞凋亡形态取对数生长期的 LOVO 细胞, 用 0.25% 胰酶消化, 制成单细胞悬液加入 6 孔培养板, 2 ml/ 孔, 细胞终浓度为个 / 孔, 置 37 o C, 5% CO2 培养 24 h 去除培养基, 实验组加 NRP-1 MAb, 终浓度为 0.2 mg. ml -1 2 ml, 阴性对照孔用 DMEM 培养液, 置 37 o C, 5%CO2 培养 24 h 去除上清, 用 PBS 洗涤 1 次, 每空加 500 l 标记液, 加 DAPI 荧光染液, 避光室温放置 15 min, 荧光显微镜观察凋亡细胞染色情况 2.6 ANNEXIN V-FITC/PI 流式细胞仪法检测 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞凋亡率取对数生长期的 LOVO 细胞, 用 0.25% 胰酶消化, 制成单细胞悬液加入 6 孔培养板,2 ml/ 孔, 细胞终浓度为个 / 孔, 置 37 o C, 5% CO2 培养 24 h 实验孔加入 NRP-1 MAb 溶液, 终浓度分别 0.2, 0.4 mg. ml -1, 2 ml, 对照孔加 DMEM 培养液, 置 37 o C, 5%CO2 培养 24 h 收集细胞于 Ep 管中, 4 o C,1 000 g 离心 5 min, 用 PBS 洗涤 1 次再次离心, 将细胞悬浮于 500 ml Binding Buffer 中, 加 ANNEXIN V 染液及 PI 染液各 5 l, 避光混匀后, 室温放置 15 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率,WinMDI2.9 软件分析所得数据 2.7 DNA Ladder 方法检测 NRP-1 MAB 诱导 LOVO 的凋亡作用取对数生长期的 LOVO 细胞, 用 0.25% 胰酶消化, 制成单细胞悬液加入 6 孔培养板,2 ml/ 孔, 细胞终浓度为个 / 孔, 置 37 o C, 5% CO2 培养 24 h 倒掉培养液, 实验组加 NRP-1 MAb, 终浓度为 0.2 mg. ml -1 2 ml, 对照组用 DMEM 培养液, 置 37 o C, 5% CO2 培养 24 h 用 0.25% 胰酶消化, 4 o C, g 离心 5 min, PBS 洗涤 3 min 后, 弃去上清, 离心收集细胞用 DNA Ladder 试剂盒抽提 DNA, 然后进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 2.8 Western blotting 检测 Caspase-3 蛋白的表达取对数生长期的 LOVO 细胞, 用 0.25% 胰酶消化, 制成单细胞悬液加入 6 孔培养板,2 ml/ 孔, 细胞终浓度为个 / 孔, 置 37 o C, 5%CO2 培养 24 h 倒掉培养液, 实验组加 NRP-1 MAb, 终浓度为 0.2 mg. ml -1, 对照组用 DMEM 培养液, 作用 24 h 冰上用 RAPI 裂解液裂解细胞提取总蛋白,12% SDS-PAGE 分离蛋白, 将胶置于转膜液中 90 V, 45 min, 蛋白电转到 PVDF 膜上加入一抗, 反应 1 h, 洗涤液洗涤 3 次 ; 加入 HRP 标记的二抗, 反应 1 h, 洗涤 ECL 显色 3 结果 3.1 抗体的制备和纯化腹水经 rprotein A 亲和层析纯化,SDS-PAGE 凝胶电泳扫描鉴定其纯度为 95% 以上抗体在相对分子质量为和处呈现 2 条带, 分别相当于抗体的重链和轻链的相对分子质量, 表明通过纯化, 得到较高纯度的抗体 3.2 抗体的效价及亚类鉴定间接 ELISA 结果如图 2 所示, 随着抗体浓度的下降, 在 490 nm 波长处的吸光度值都逐渐降低, 表明这抗体能与包被在板上的 NRP1/b1b2 融合蛋白进行特异性结合, 抗体的效价达 ( 图 1) 抗体亚类用鼠亚类 ELISA 检测试剂盒鉴定为 IgG1

3 图 1 间接 ELISA 法测定抗体的效价 3.3 细胞免疫荧光分析 NRP-1 在 LOVO 上的表达免疫荧光共聚焦显微镜检测结果如图 2 所示, 当使用 350 nm 做激发光检测 Hoechst 的荧光时, 可见 LOVO 细胞的细胞核带有蓝色荧光, 且未对细胞核的形态造成损伤 ; 当使用 550 nm 作激发光, 检测 TRITC 的荧光时, 未加 NRP-1 MAb 的对照组检测不到红色荧光信号, 而加入 NRP-1 MAb 组可以看到清晰的红色荧光经两种荧光叠加, 融合图像显示未加 NRP-1 MAb 的对照组的细胞膜未出现红色荧光, 而加入 NRP-1 MAb 组可见红色荧光, 且主要呈现在细胞膜上图 2 细胞免疫荧光分析 NRP-1 在 LOVO 上的表达 3.4 MTT 法检测 NRP-1 MAb 对 LOVO 的生长抑制作用 NRP-1 MAb 对 LOVO 细胞有生长抑制作用, 并随着 NRP-1 MAb 剂量的增加, LOVO 细胞生长抑制率也随之增加, 呈明显的剂量相关性 ( 图 3) 图 3 MTT 法检测不同剂量 NRP-1 MAb 对 LOVO 细胞的生长抑制率注 :**, 与对照组相比 P< DAPI 荧光显微镜法观察细胞凋亡形态荧光显微镜观察结果表明, 经过 NRP-1 MAb 处理过的 LOVO 细胞,DAPI 染色产生亮蓝色核酸凝聚, 说明 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞发生凋

亡 ( 图 4) 图 4 荧光显微镜法观察细胞凋亡形态 A. 0 mg. ml -1 NRP-1 MAb; B. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb; C. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb 3.6 ANNEXIN V-FITC/PI 流式细胞仪法检测 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞凋亡率流式细胞仪检测结果表明终浓度 0.2 mg. ml -1 的 NRP-1 MAb 作用 LOVO 细胞 24 h, LOVO 细胞凋亡率为 32.

3%, 如图 C 所示结果说明 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞的凋亡呈剂量依赖相关 ( 图 5) 图 5 流式细胞仪法检测不同剂量 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞的凋亡率 A. 0 mg. ml -1 NRP-1 MAb; B. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb; C. 0.4 mg. ml -1 NRP-1 MAb 3.

4 亡 ( 图 4) 图 4 荧光显微镜法观察细胞凋亡形态 A. 0 mg. ml -1 NRP-1 MAb; B. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb; C. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb 3.6 ANNEXIN V-FITC/PI 流式细胞仪法检测 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞凋亡率流式细胞仪检测结果表明终浓度 0.2 mg. ml -1 的 NRP-1 MAb 作用 LOVO 细胞 24 h, LOVO 细胞凋亡率为 32.9%, 其中早期凋亡率 11.7%, 晚期凋亡率 21.2%, 如图 B 所示 ; 终浓度 0.4 mg. ml -1 的 NRP-1 MAb 作用时, 细胞凋亡率为 66%, 其中早期凋亡率为 23.7%, 晚期凋亡率为 42.3%, 如图 C 所示结果说明 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞的凋亡呈剂量依赖相关 ( 图 5) 图 5 流式细胞仪法检测不同剂量 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞的凋亡率 A. 0 mg. ml -1 NRP-1 MAb; B. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb; C. 0.4 mg. ml -1 NRP-1 MAb 3.7 NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞凋亡 DNA 断裂的定性检测终浓度 0.2 mg/mlnrp-1 MAb 作用 LOVO 细胞, 细胞 DNA 呈现明显的彗星尾梯状条带 ( 图 6), 提示 LOVO 细胞在 NRP-1 MAb 的诱导下发生凋亡图 6,NRP-1 MAb 诱导 LOVO 细胞凋亡 DNA 断裂的定性检测 A. 0 mg. ml -1 NRP-1 MAb; B. 0.2 mg. ml -1 NRP-1 MAb; C. 0.4 mg. ml -1 NRP-1 MAb 3.8 Western blotting 检测 Caspase-3 蛋白的表达以不加抗体的 DMEM 作为对照组, 终浓度分别为 0.2,0.4 mg. ml -1 的 NRP-1 MAb 溶液作为实验组, 作用 LOVO 细胞 24 h 后, 通过 Western blotting 检测 Caspase-3 的表达结果显示随着抗体浓度的增加,Caspase-3 的表达量增加, 呈现剂量依赖性 ( 图 7)

5 图 7 Western blot 分析不同剂量 NRP-1 MAb 对 LOVO 细胞 Caspase-3 表达的影响 1.0 mg. ml -1 NRP -1 MAb; mg. ml -1 NRP-1 MAb; mg. ml -1 NRP-1 MAb 4 讨论目前肿瘤靶向治疗是肿瘤生物治疗的热点之一, 本实验室成功地制备和纯化了具有较高纯度和效价的抗 NRP-1 单克隆抗体,NRP-1 MAb 可与细胞膜上 NRP-1 特异结合并发挥相应的功能细胞免疫荧光结果表明,NRP-1 主要分布在 LOVO 细胞膜上, 并且我们的 NRP-1 MAb 可以很好地与 LOVO 细胞表面的 NRP-1 结合对 NRP-1 MAb 作用后的细胞进行 DAPI 染色, 在荧光显微镜下观察发现, 存在大量早期凋亡细胞, 其具体表现为细胞核染色为发亮蓝色荧光 MTT 法检测显示,NRP-1 MAb 对 LOVO 细胞有生长抑制作用, 当 NRP-1 MAb 终浓度增加时, 细胞的生长抑制率也随之增加流式细胞术结果更进一步说明,NRP-1 MAb 可诱导肿瘤细胞 LOVO 的凋亡, 并呈剂量依赖性 DNA Ladder 结果说明, 在 NRP-1 MAb 的作用下,LOVO 细胞的 DNA 结构发生了断裂, 通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰地看到 NRP-1 MAb 作用后的 LOVO 细胞出现很亮的彗星梯状拖尾, 而未经 NRP-1 MAb 作用的细胞则未出现 DNA 断裂现象, 这一结果再次说明 NRP-1 MAb 可以诱导 LOVO 细胞凋亡 Western blotting 结果显示,NRP-1 MAb 作用 LOVO 细胞后, 细胞中 Caspase-3 蛋白的表达量发生变化, 随着 NRP-1 MAb 剂量的提高,Caspase-3 蛋白的表达量增加, 也证实了 NRP-1 MAb 对 LOVO 细胞的促凋亡作用综上所述, NRP-1 MAb 可以通过诱导肿瘤细胞 LOVO 凋亡发挥抗肿瘤作用

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人