2015内镜杂志-WMD.FIT)

Size: px

Start display at page:

Download "2015内镜杂志-WMD.FIT)"

制柯
5 years ago
Views:

1 第 27 卷第 10 期中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 5 月 China Journal of Modern Medicine May 2017 DOI: /j.issn 文章编号 : (2017) 抑制 2 基因启动子甲基化促进乳腺癌细胞凋亡的研究樊艳 ( 河南省中医院乳腺科, 河南郑州 ) 摘要 : 目的研究抑癌基因 2 在乳腺癌的表达与甲基化状态之间的联系, 及其对乳腺癌细胞系 T-47D 细胞增殖和凋亡的影响方法体外培养 3 种乳腺癌细胞株 (T-47D MCF-7 MDA-MB-23) 和正常乳腺细胞株 (MCF-10), 检测 4 种细胞中 2 基因的表达及其启动子区甲基化状况 ;5-Aza-CdR 处理 T-47D 细胞后, 检测 5-Aza-CdR 对 T-47D 细胞 2 启动子甲基化状态和其表达的影响, 并通过 MTT 和 Annexin-V/PI 双染法分别检测处理前后 T-47D 细胞增殖和凋亡的变化结果 2 在 T-47D 细胞表达缺失, 乳腺癌细胞 2 启动子发生甲基化 ;5-Aza-CdR 成功逆转了 T-47D 细胞 2 的甲基化状态, 并使 2 mrna 表达恢复 ( <0.05); 不同浓度的 5-Aza-CdR 处理 T-47D 细胞后,T-47D 细胞增殖下降 ( < 0.05), 凋亡率增加 ( <0.05) 结论 2 启动子甲基化导致 T-47D 细胞 2 表达沉默, 激活 2 表达可抑制 T-47D 细胞增殖并促进其凋亡关键词 : 乳腺癌 ; 2; 甲基化 ;5-Aza-CdR 中图分类号 :R737.9 文献标识码 :A Expression of gene in breast cancer cells and its effect on cell proliferation and apoptosis Yan Fan (Department of Galactophore, Henan Provincial Hospital of TCM, Zhengzhou, Henan , China) Abstract: Objective To study the association between expression of gene and its promoter methylation, and the effect of on the proliferation and apoptosis of breast cancer T-47D cells. Methods Three breast cancer cell lines (T-47D, MCF-7 and MDA-MB-23) and normal breast cell line (MCF-10) were cultured, the expression and promoter methylation status of in the four cell lines were measured. T-47D cells were treated by 5-Aza-CdR, and the effect of 5-Aza-CdR on the mrna level and promoter methylation status were detected. T-47D cell proliferation and apoptosis were determined by MTT and Annexin-V/PI respectively. Results gene expression was not observed, whereas promoter methylation was found in T-47D cells. 5- Aza-CdR reversed the methylation of promoter and activated the expression of ( <0.05). The cell proliferation was significantly inhibited and the apoptosis was promoted in T-47D cells after treatment with 5-Aza- CdR ( < 0.05). Conclusions The methylation of promoter induces the silence of mrna. The activation of gene expression can inhibit the cell proliferation and promote apoptosis of T-47D cell. Keywords: breast cancer; ;methylation; 5-Aza-CdR 随着近年来对肿瘤分子生物学和表观遗传学的研究发现, 抑癌基因的失活是肿瘤发生早期的重要事件, 而抑癌基因启动子区高甲基化是抑癌基因失活的一种重要机制乳腺癌缺失基因 2 (deleted in 收稿日期 :

2 第 10 期樊艳 : 抑制 2 基因启动子甲基化促进乳腺癌细胞凋亡的研究 breast cancer 2, 2), 又称 2(rho-related BTB domain-containing 2), 是位于人类染色体 8p21 上的一种抑癌基因, 该基因在约 60% 的乳腺癌患者体内表达缺失, 与散发性乳腺癌的发生发展有着密 [1] 切的关系研究发现 2 常在肿瘤组织中表达缺失, 而 2 基因的重新表达可抑制肿瘤细胞的生 [2-3] 长, 迁移和侵袭因此 2 在乳腺癌的发生和发展过程中具有十分重要的作用目前国内外关于 2 基因甲基化与乳腺癌的研究不多, 本研究旨在研究乳腺癌中的甲基化状态及其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响通过体外培养 3 种不同的乳腺癌细胞株 (T-47D MCF-7 MDA-MB-23) 和正常乳腺细胞株 (MCF-10), 研究乳腺癌 2 基因甲基化状态与其表达水平的关系, 并初步探索甲基化抑制剂 5- 氮杂 -2 - 脱氧胞苷对 2 基因表达与甲基化状态及 T-47D 细胞增殖和凋亡的影响, 以期为乳腺癌的发病机制提供新的理论基础 1 材料与方法 1.1 材料及主要试剂 RPMI1640(Gibco), 胎牛血清 (Gibco),5-Aza- CdR(Sigma 公司 ),RNA 提取试剂盒 ( 美国 Invitrogen 公司 ), 逆转录试剂盒 (TaKaRa),DNA 提取试剂盒 (Axygen),DNA 甲基化试剂盒 (ZymoResearch), DNA 纯化试剂盒 (Promega), 细胞凋亡检测试剂盒 (KeyGEN) 1.2 方法细胞培养及处理将 T-47D MCF-7 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系及人类正常乳腺细胞系 (MCF-10)( ATTC)4 种细胞分别接种于含 10% 胎牛血清的 RPM 1640 培养液中, 于 37 5% 二氧化碳 CO 2 的饱和湿度培养箱中培养, 待细胞长满培养瓶壁 85% 左右后, 按 1 4 传代, 取对数生长期细胞用于下一步实验取 T-47D 细胞进行培养,24 h 后用 5-Aza-CdR 进行处理,5-Aza-CdR 浓度分为 3 组 :0 mol/l ( 对照组 ) 5mol/L 组和 10 mol/l 组, 每组设 3 孔, 分别采用含不同浓度 5-Aza-CdR 的 RPM1640 培养液培养细胞,24 h 后换新的含相同药物浓度培养液, 药物作用 3d 后, 收集细胞 RT-PCR 检测 2 mrna 表达水平用总 RNA 提取试剂盒提取细胞中总 RNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测和酶标仪检测 RNA 的完整性和浓度后, 用逆转录试剂盒对提取的 RNA 进行逆转录, 酶标仪测定 cdna 浓度, 保存于 -20 待测 Primer5 软件设计 DBC2 mrna (GenBank 登录号 :AY009093) 引物序列, 正向引物 : 5'-ACCATGTG GTACCCAGAAATC-3'; 反向引物 :5'-GTGGGACTTC CAGAACTGCA-3' 产物片段长度 303 bp 内参 GAPDH 正向引物序列 :5'-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3'; 反向引物 :5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3' 产物片段长度 452 bp RT-PCR 反应体系为 10μl 主要反应条件为 94 预热 5min;94 变性 45 s,60 45 s,72 1min 共 35 个循环后,72 延伸 10 min 扩增产物用 1.5% 琼脂糖进行电泳鉴定甲基化特异性 PCR(MSP) 分析 2 基因启动子甲基化状态提取的 DNA 经质检后进行亚硫酸氢盐处理取 2μg DNA 溶于 50μl 水中, 加入 5μl 氢氧化钠溶液 (3 mol/l) 孵育 15 min, 然后加入 30μl 对苯二酚 (10 mmol/l) 和 520μl 亚硫酸氢钠 (3mol/L), 混匀后 50 水浴 16 h, 脱盐脱硫乙醇沉淀纯化回收 DNA, 回收的 DNA 溶于 20μl TE 缓冲液中,-20 储存备用根据 2 基因序列 (GenBank 登录号 : AF315385) 用 Methyl Primier Express v1.0 进行引物设计, 甲基化正向引物序列 :5'-GCGAGTTGGTATGT TATGTC-3'; 反向引物序列 :5'-TAATCTTACCCAC GACGTTA-3' 非甲基化正向引物序列 :5'-GGTGAG TTGGTATGTTATGTT-3'; 反向引物序列 :5'-CTAA TCTTACCCACAACATTA-3' 修饰的 DNA 用甲基化特异性 PCR (MSP) 试剂盒按照使用说明书进行操作反应条件 :94 预热 5min,94 45 s,56 45 s, 72 1min 共 35 个循环,72 延伸 10 min 扩增产物于 2.5% 的凝胶电泳检测 MTT 法检测 5-Aza-CdR 处理后 T-47D 细胞增殖取对数期细胞接种于 96 孔板, 用分别含 0 5 和 10 mol/l 5-Aza-CdR 的 RPM 1640 培养液培养细胞,24 h 后换新的含相同药物浓度培养液, 药物作用 72 h 后, 每孔加入 20μl 5mg/ml MTT 后继续培养 4h, 弃上清液并在每孔加入 200μl DMSO, 振荡 10 min 使其充分溶解后, 酶标仪上测定在 570 nm 处各孔的吸光值流式细胞仪检测 5-Aza-CdR 处理后 T-47D 细胞凋亡细胞凋亡的检测参照细胞凋亡试剂盒说明书进行收集 ~ 个细胞, 加入 500μl 结合缓冲液悬浮细胞, 分别加 5μlAn nexin Ⅴ-FITC 和 5μl PI, 混匀后室温避光反应 31

中国现代医学杂志第 27 卷 15 min 后, 上流式细胞仪进行检测 1.3 统计学方法采用 SPSS 13.0 统计软件进行数据分析, 结果采用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 以 <0.

1 乳腺癌细胞中 2 mrna 表达水平 2 mrna 在 T-47D 细胞中未检测到, 而在 MCF-7 MDA-MB-231 乳腺癌细胞和正常乳腺细胞均有表达 ( 图 1A), 在检测到 2 表达的 MCF-7 与 MDA-MB-231 乳腺癌细胞, 其 mrna

062 MCF-7 0.42±0.04 SKBR3 0.35±0.051 T-47D - 值 143.606 2.

甲基化引物扩增出特异性条带 ( 见图 2), 表明仅乳腺癌细胞 2 基因启动子发生了甲基化, 而正常乳腺细胞 2 基因未发生甲基化 2.

说明乳腺癌细胞株 T-47D 在 5-Aza-CdR 的作用下 2 发生了去甲基化见图 3 2.

3 中国现代医学杂志第 27 卷 15 min 后, 上流式细胞仪进行检测 1.3 统计学方法采用 SPSS 13.0 统计软件进行数据分析, 结果采用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 以 <0.05 表示差异有统计学意义 2 结果 2.1 乳腺癌细胞中 2 mrna 表达水平 2 mrna 在 T-47D 细胞中未检测到, 而在 MCF-7 MDA-MB-231 乳腺癌细胞和正常乳腺细胞均有表达 ( 图 1A), 在检测到 2 表达的 MCF-7 与 MDA-MB-231 乳腺癌细胞, 其 mrna 表达水平均低于正常乳腺细胞组 ( 表 1 图 1B) 表明乳腺癌细胞中 2 mrna 的表达受到了抑制, 且在 T-47D 细胞系中表达缺失表 1 RT-qPCR 检测 2mRNA 表达量 (x±s) 组别相对表达量 MCF ±0.062 MCF ±0.04 SKBR3 0.35±0.051 T-47D - 值乳腺癌细胞中 2 基因启动子甲基化状态对 2 启动子 CpG 岛甲基化状况的检测结果显示, 乳腺癌细胞 T-47D 仅甲基化引物扩增出特异性条带,MCF-7,MDA-MB-231 组甲基化与非甲基化引物均扩增出特异性条带, 而 MCF-10 组仅非甲基化引物扩增出特异性条带 ( 见图 2), 表明仅乳腺癌细胞 2 基因启动子发生了甲基化, 而正常乳腺细胞 2 基因未发生甲基化 2.3 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后 2 基因启动子甲基化状态的比较 T-47D 细胞经不同浓度的去甲基化药物 5-Aza-CdR 处理后非甲基化引物扩增出特异性条带, 且随浓度的增加, 非甲基化引物条带变宽, 而对照组仅甲基化引物扩增出特异性条带, 说明乳腺癌细胞株 T-47D 在 5-Aza-CdR 的作用下 2 发生了去甲基化见图 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后 2 mrna 表达水平的比较 0mol/L 5-Aza-CdR 2mRNA 表达缺失, 而在 5mol/L 组和 10 mol/l 组均检测到了不同表达水 Marker U M U M U M U M 值注 : 与 MCF-10 比较, <0.05 2(303 bp) 图 2 乳腺癌细胞株和正常乳腺细胞 2 启动子区甲基化分析 GAPDH(452 bp) 0mol/L 5mol/L 10 mol/l Marker U M U M U M A 图 3 不同浓度 5-Aza-CdR 处理后 T-47D 细胞 2 基因启动子甲基化状态 0.2 Marker 0mol/L 5mol/L 10 mol/l 与 MCF-10 比较, <0.05 A: 琼脂糖凝胶电泳检测 2mRNA 表达 ;B:RT-qPCR 检测 2mRNA 表达图 B 2 在乳腺癌细胞株和正常乳腺细胞中的表达 bp 400 bp 300 bp 200 bp 图 4 DBC2 GAPDH 不同浓度 5-Aza-CdR 处理 T-47D 细胞后 2 的表达

053 值 21.338 值 0.002 图 5 5-Aza-CdR 浓度 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后细胞相对增殖率细胞凋亡率 /(%,x±s) 0/(mol/L) 2.32±0.931 5/(mol/L) 10/(mol/L) 10.53±1.173 16.90±0.815 值 166.802 值 0.000 图 6 表 3 1.5 1.0 0.5 0.

4 第 10 期樊艳 : 抑制 2 基因启动子甲基化促进乳腺癌细胞凋亡的研究平的 2 mrna( 见图 4) 表明在去甲基化药物的作用下, 乳腺癌细胞株 T-47D 达水平也提高了 2 mrna 的表 2.5 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后细胞增殖的比较表 2 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后,5 mol/l 组 5-Aza-CdR 浓度注 : 与 0mol/L 5-Aza-CdR 组比较, <0.05 相对增殖率 /(%,x±s) 0/(mol/L) 1.00± /(mol/L) 10/(mol/L) 0.71± ±0.053 值值图 5 5-Aza-CdR 浓度 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后细胞相对增殖率细胞凋亡率 /(%,x±s) 0/(mol/L) 2.32± /(mol/L) 10/(mol/L) 10.53± ±0.815 值值图 6 表与 0mol/L 5-Aza-CdR 组比较, <0.05 不同浓度 5-Aza-CdR 对 T-47D 细胞增殖的影响不同浓度 5-Aza-CdR 处理后细胞凋亡率注 : 与 0mol/L 5-Aza-CdR 组比较, < Aza-CdR/(mol/L) 与 0mol/L 5-Aza-CdR 组比较, < Aza-CdR/(mol/L) 不同浓度 5-Aza-CdR 对 T-47D 细胞凋亡的影响 33 和 10 mol/l 组细胞增殖率低于对照组 (71% vs 85%; 58% vs 85%), 且随 5-Aza-CdR 浓度增加,T-47D 细胞增殖呈下降趋势 ( 见表 2 图 5) 2.6 T-47D 细胞经 5-Aza-CdR 处理后细胞凋亡率的比较经流式细胞仪检测发现,5 和 10 mol/l 5-Aza- CdR 均可提高乳腺癌细胞株 T-47D 的细胞凋亡率 ( <0.05)( 见表 3 图 6 ) 3 讨论抑癌基因在乳腺癌中的表达是研究者们对乳腺癌诊断和治疗研究的主要方向 HAN 等 [4] 在研究中发现乳腺癌肺癌 [5], 骨肉瘤 [6] 以及甲状腺癌 [3] 等肿瘤中均存在 2 基因表达降低或缺失的现象由 2 基因编码的 RhoBTB2 蛋白一种非典型的 Rho GTP 酶, 可通过招募蛋白到 Cul3 泛素连接酶复合物来使肿瘤变性 [7], 因此 DBC2 蛋白的失活可能是细胞癌化过程中至关重要的一步 MAO [1] 等体外研究发现, 2 基因在卵巢癌宫颈癌胃癌以及乳腺癌细胞株 MCF-7 和 SKBR3 中均有表达, 而在乳腺癌细胞株 T-47D 中表达缺失, 这与本研究结果类似表明 2 作为乳腺癌的抑癌因子, 其表达的失活可能也是乳腺癌发生的原因之一另一方面, 2 基因的表达也具有细胞特异性越来越多的研究表明, 抑癌基因启动子区甲基化对乳腺癌的发病机制具有十分重要的作用 [8-9] MIRZAEI 等 [10] 对 50 例乳腺癌患者的临床试验发现乳腺癌患者 DBC2 启动子区高甲基化频率高于正常乳腺组织在本实验中, 胞也检测出了示着 2 表达沉默的 T-47D 细 2 启动子区的高甲基化状态, 预 2 基因的表达与其启动子区甲基化状态之间具有一定的联系 HAN [4] 对 87 例乳腺癌组织的研究中发现, 有 49 例 2 mrna 缺失, 并进一步分析发现, 乳腺癌组织 2 表达水平低于正常组织, 且乳腺癌组织高于对照组, 表明 2 启动子区发生甲基化的频率也 2 表达沉默可能是其启动子区甲基化的结果 SHI 等 [11] 在膀胱癌的研究也发现癌症组织中正常组织, 并且 2 启动子区甲基化的频率显著高于 2 启动子区的高甲基化状态与其基因的失活具有一定的相关性王红岩等 [12] 在胃癌中亚发现 2 表达水平在癌组织中的表达下调, 伴随着其启动子区的高甲基化为进一步加强这个结论, 本研究利用 5-Aza-CdR 成功逆转 2 基

5 中国现代医学杂志第 27 卷因启动子区的甲基化状态, 并通过 RT-PCR 实验发现启动子区处于甲基化的对照组 2 基因表达缺失, 而实验组 2 基因得到了表达由此推测高甲基化导致的 2 失活可能是乳腺细胞癌变进程中至关重要的一步 2 参与各种各样的细胞功能如蛋白的运 [2] 输细胞骨架的调节细胞凋亡和细胞周期的调节本研究发现通过逆转 2 基因启动子区甲基化状态, 抑制了 T-47D 细胞的增殖这种抑制作用主要 [13] 是通过将细胞周期阻滞在 G 1 期来实现的, 其分子机制可能有以下 2 个方面 :1 2 通过对细胞周 [14] 期蛋白 D1 的负调控, 下调 cyclind1mrna 的表达 ; 2 2 是 E2F1 转录因子的靶基因, 而转录因子 E2F1 家族主要负责激活基因翻译和细胞周期过程 [15] 中必需的 DNA 复制在 cyclind1 和 E2F1 转录因子的双重作用下, 使乳腺癌细胞无法从 G 1 期进入 S 期, 从而表现为 G 1 期滞留的现象, 进而抑制乳腺癌细胞的增殖本研究中 5-Aza-CdR 处理使 2 基因表达被激活后, 乳腺癌细胞 T-47D 细胞凋亡率也 [3] 提高了 WANG 等指出 2 通过线粒体凋亡信号通路诱导甲状腺癌细胞凋亡另一方面, 2 不仅是 E2F1 作用于有丝分裂的靶基因, 同时也是 [15] E2F1 作用于细胞凋亡的靶基因, 因此, 2 mr- NA 表达增加而促进乳腺癌细胞凋亡的机制可能是一种依赖 E2F1 并作用于线粒体凋亡途径的机制综上所述, 本研究表明乳腺癌细胞株 T-47D 存在 2 基因甲基化异常以及表达缺失现象, 并且 2 基因在乳腺癌的表达对乳腺癌细胞的增殖和凋亡均具有一定的作用总之, 肿瘤抑制基因 2 的失活是乳腺癌的发生发展进程中一个重要的事件, 而 2 的表达与其启动子区的甲基化状态密切相关但本研究对于 2 影响乳腺癌细胞增殖和凋亡的机制尚未进行研究, 下一步应着重对 2 影响乳腺癌细胞增殖和凋亡的具体机制进行深层次的研究本研究将有助于更清楚地阐明乳腺癌的病理学机制, 为乳腺癌的临床诊断和治疗提供新的思路和方向参考文献 : [1] MAO H, QU X, YANG Y, et al. A novel tumor suppressor gene RhoBTB2 (DBC2): frequent loss of expression in sporadic breast cancer[j]. Mol Carcinog, 2010, 49(3): [2] MAO H, ZHANGL, YANGY, et al. RhoBTB2(DBC2) functions as tumor suppressor via inhibiting proliferation, preventing colony formation and inducing apoptosis in breast cancer cells [J]. Gene, 2011, 486 (1/2): [3] WANG C J, YANG D, LUO YW, et al. RhoBTB2 (DBC2) functions as a multifunctional tumor suppressor in thyroid cancer cells via mitochondrial apoptotic pathway[j]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(4): [4] HAN L, HOU L, SONG J, et al. Decreased expression of the DBC2 gene and its clinicopathological significance in breast cancer: correlation with aberrant DNA methylation[j]. Biotechnol Lett, 2013, 35(8): [5] DONG W, MENG L, SHEN H C, et al. Loss of DBC2 expression is an early and progressive event in the development of lung adenocarcinoma[j]. Asian Pac JCancer Prev, 2012, 13(5): [6] JIN Z, HAN Y X, HAN X R, et al. Downregulated RhoBTB2 expression contributes to poor outcome in osteosarcoma patients[j]. Cancer Biother Radiopharm, 2013, 28(10): [7] WILKINS A, CARPENTER C L. Regulation of RhoBTB2 by the Cul3 ubiquitin ligase complex[j]. Methods Enzymol, 2008(439): [8] AVRAHAM A, CHO S S, UHIMANN R, et al. Tissue specific DNA methylation in normal human breast epithelium and in breast cancer[j]. PLoS One, 2014, 9(3): e [9] MURRIA R, PALANCA S, JUAN ID, et al. Methylation of tumor suppressor genes is related with copy number aberrations in breast cancer [J]. American Journal of Cancer Research, 2015, 5 (1): 375. [10] MIRZAEI M H, NORUZINIA M, KARBASSIAN H, et al. E- valuation of methylation status in the 5'UTR promoter region of the DBC2 gene as a biomarker in sporadic breast cancer[j]. Cell J, 2012, 14(1): [11] SHI Y, CHEN J Y, YANG J, et al. DBC2 gene is silenced by promoter methylation in bladder cancer[j]. Urol Oncol, 2008, 26 (5): [12] 王红岩, 刘峥嵘, 赵丹凤, 等.DBC2 在胃癌中的甲基化 [J]. 中国医科大学学报,2015,44(2): [13] 张波, 王国斌, 陈道达, 等.DBC2 基因诱导乳腺癌细胞周期 G1 期阻滞的机制 [J]. 华中科技大学学报 ( 医学版 ), 2008, 37(1): [14] YOSHIHARA T, COLLADO D, HAMAGUCHI M, et al. Cyclin D1 down-regulation is essential for DBC2's tumor suppressor function [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 358 (4): [15] FREEMAN S, MA YW. RhoBTB2 (DBC2) is a mitotic E2F1 target gene with a novel role in apoptosis[j]. J Biol Chem, 2008, 283(4): ( 张西倩编辑 ) 34

中华乳腺病杂志 ( 电子版 )2007 年 8 月第 1 卷第 4 期 ChinJBreastDis(ElectronicVersion),August2007,Vol.1,No.4 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究

中华乳腺病杂志 ( 电子版 )2007 年 8 月第 1 卷第 4 期 ChinJBreastDis(ElectronicVersion),August2007,Vol.1,No.4 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究 5 氮 2 脱氧胞苷 (5 Aza CdR) 对乳腺癌 MDA MB 435S 细胞增殖及抑癌基因 Maspin 表达的影响方法用特异性甲基转移酶抑制剂 5 Aza CdR 处理乳腺癌细胞株 MDA MB 435S8d 后, 采用四唑盐 (MTT) 比色法观察细胞在药物处理前后的生长活性,