西安交通大学学报 医学版 第 卷 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 严重危害女性健康 低氧微环境是实体肿瘤的常见特征 乳腺癌作为一种实体肿瘤 低氧下可显示出较强的恶性特征 而传统治疗方法疗效不理想的原因可能与忽视 ' 了低氧微环境的存在有关 因此 探讨低氧微环境下乳腺癌实体肿瘤恶性进程的调控对乳腺癌

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 中医药研究 竹叶提取物通过调控 通路抑制低氧条件下人乳腺癌 细胞的恶性生长 徐其锋 温晓琼 河南省中医院乳腺科 河南郑州 "# 摘要 目的 探究竹叶提取物对低氧条件下人乳腺癌 $%&' 细胞恶性生长的影响及分子机制 方法 将培养的人乳腺癌 $%&' 细胞随机分为正常组 低氧组以及 " 竹叶提取物组和 竹叶提取物组 (&' 组 %%)' 法检测各组细胞的增殖活性变化 *+',%* 和 -./!01 检测细胞增殖标记蛋白,%)' 和 $%$ 表达 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化 -./!01 检测凋亡相关蛋白 0'..' 和./22! 表达 并探讨 34&' 通路在竹叶提取物抑制癌细胞生长中的作用 结果 竹叶提取物处理后 低氧下 $%&' 细胞的增殖活性和,%)' 和 $%$ 的表达显著性降低并呈现剂量依赖性 而细胞 ($ 期比例增加 此外 竹叶提取物处理后细胞凋亡率明显增加 同时 和..' 表达上调 0' 和./22! 表达下调 此外 竹叶提取物组 34&' 通路中 '3 和 4&' 的表达下调 34&' 通路激动剂 (&' 可逆转竹叶提取物对低氧下 $%&' 恶性生长的抑制作用 结论 竹叶提取物可通过下调 3 4&' 信号通路抑制低氧条件下人乳腺癌 $%&' 细胞恶性生长 关键词 竹叶提取物 $%&' 增殖 凋亡 低氧 34&' 通路 0'..' 中图分类号 * 文献标志码 #!"#"$%&'''"!'% #%"&&"% &"!(%"!'")(*"%()$'&'&%"+'%" 56 7'8!-9 51':1! ;/!18/.//4!!,/12! %$!1"#%!,-.-## ##!()*#" +# #" # #&(" ##!()*#","+#+ ++ & - #+ &" -#+ & -#+"& -#+"./)*&#+# #+"" ##0* ((0* &++1('0*"((0*!(!!()*#"#" *("&)#",### "#++&++#*#+*"" & )#1.)*+ "#*""### +"&##+# " +('0*"!(!" + ""*"+" &&++!()*#+ + /! +### #" #&&++!()*##" ###+"#"+"#+*""#"+ #*" &&!#"*"++*1".)*!()*#" +&./)* 1.)*+ "# #!()*#" +& # ##!()*# ++1.)*+ " +##& /01., #!()* )*+ #*#+* 收稿日期 '' 修回日期 ''" 通信作者 徐其锋 主治医师 9'0:8!:81 优先出版 3!.!3!3.0*##0''#!

2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 严重危害女性健康 低氧微环境是实体肿瘤的常见特征 乳腺癌作为一种实体肿瘤 低氧下可显示出较强的恶性特征 而传统治疗方法疗效不理想的原因可能与忽视 ' 了低氧微环境的存在有关 因此 探讨低氧微环境下乳腺癌实体肿瘤恶性进程的调控对乳腺癌的防治具有重要意义 竹子是禾本科竹亚科多年常绿植物 含有大量黄酮 活性多糖 茶多酚等具有抗癌活性 的有效成分 目前已有广泛研究 已有文献证实 竹叶提取物对肝癌 黑色素瘤等疾病具有显著的疗 "'# 效 而有关竹叶提取物应用于乳腺癌的研究较少 本研究观察了不同浓度的竹叶提取物对低氧环境下乳腺癌 $%&' 细胞恶性生长的影响 并进一步探讨其可能的作用机制 期望为乳腺癌的临床治疗提供科学合理的实验依据 材料与方法 试剂和仪器 竹叶提取物购自西安康尔美生物科技有限公司 人乳腺癌细胞系 $%&' 购自中科院上海细胞所 *,$'" 培养基 胎牛血清均购自美国 (%* 公司 %%)' 试剂盒购自美国 公司 *0',%**+',%* 试剂盒购于!2/1'! 公司!!! '&+% 检测试剂盒购自 +*9' (9! -./! 01 所用抗体均购自美国!%/ 公司..' 活性检测试剂盒购于美国 公司 $%'% 型细胞培养箱购自日本三洋公司 型,%* 仪购自美国 公司 $0.3! &% 型酶标仪购自美国 +/1 公司 &%%0/ +$ 流式细胞仪购自美国 ; 公司 #" 小型台式冷冻离心机购自德国 9!1/8 公司 化学发光仪购自美国 )13 公司 细胞培养 $%&' 细胞置于含 胎牛血清 # 6 青霉素和 链霉素的 *,$ " 培养基中 在 <#% 的培养箱中贴壁生长 更换培养基 用 # 胰酶消化传代 取对数期细胞进行实验 / 法检测 细胞增殖活性 将细胞按照 " 个 孔接种至 孔板中 后换液 进行 " 无血清培养 加入终质量浓度为 " 竹叶提取物的培养基 < 条件下培养 " 后 加入 #%%) 液培养 "/! 离心 #! 弃上清 加入 ;$ 溶解后 于酶标仪测定 "! 处的吸光度值 实验分组及.-2. 检测 细胞增殖标 记蛋白的表达 分为正常组 低氧组 及 " 竹叶提取物组和 竹叶提取物 (&' 组 先予以 10(&' 作用! 后 放入低氧环境培养 低氧环境为 " 和 #% 组成的三气培养箱 通过控制 或 输入量实现对 的精确控制 维持培养箱内持续的低氧环境 竹叶提取物用 生理盐水配成相应浓度 将细胞按照 " # 个 孔接种到 孔板 后无血清培养 " 按以上分组添加相应处理的培养基 培养 " 后收集细胞 +/10 法提取总 * 紫外分光光度计测定 * 的纯度及浓度 逆转录成 ; 后 再利用 =*,/9 进行 *+',%* 扩增,%)' 和 $%$ 引物序列见表 表 基因的引物序列 +,//.:!.18!. 基因名称,% )' $%$ (,;4 引物序列 #>?> +(+(((+%%++((+( ((+((+%(++(+%+++% %++(%%+%%++%(%% ++%+%+%+(%%%+( %%(%+++(%+%%+(+( +(++(+%+(%((%%++ +((((((+(((+%( ++%+%%++((((%%+(+( 3 流式细胞仪检测 细胞凋亡及细胞周期 分组处理同 " 乙醇固定过夜 离心取沉淀物 加入 * 酶 溶液 < 消化! 用 碘化丙啶染色液和!!!"< 染色! 流式细胞仪于 "! 激发波长处进行分析 4""%! 检测增殖标记蛋白 凋亡相关蛋白和 通路蛋白的表达 分组处理同 " 提取全蛋白 经 % 定量 上样 ;',(9 凝胶电泳 转膜 " 脱脂奶粉封闭 后 < 封闭过夜 加入 4*, 孵育 9% 显影后 检测细胞蛋白表达 &)" 试剂盒检测 &)" 活性 将细胞按照 个 孔接种到 孔板中 后换无血清培养 " 加入终质量浓度为 竹叶提取物的培养基或者预先加入 (&' 及竹叶提取物的培养基 按照..' 活性检测试剂盒说明书操作 比色法测定..' 活性 分光光度计于 "#! 处检测底物裂解产生的荧光强度 统计学方法 数据均采用, 统计软件进行统计学分析 计量资料以均数 A 标准差 A 表!

3 期 徐其锋 温晓琼 竹叶提取物通过调控 34&' 通路抑制低氧条件下人乳腺癌 $%&' 细胞的恶性生长 示 多组计量资料的比较采用方差分析 后两两比较通过 ;' 检验 以 # 为差异有统计学意义 结 果 竹叶提取物对 细胞增殖的影响 %%)' 法检测结果显示 药物作用 后 " 竹叶提取物组均不同程度地抑制低氧下 $%&' 细胞增殖 且随着浓度的升高而增强 值依次分别为 "# 图 *+',%* 结果显示 各浓度竹叶提取物组的肿瘤 增殖标志蛋白,%)' 和 $%$ 的 * 表达均较低氧组降低 并随着竹叶提取物浓度的升高而抑制作用更显著 *+',%* 结果 值依次分别为,% 和 #)' 及 $%$"# 及 #-.' /!01 结果显示各肿瘤增殖标志蛋白表达变化趋势与 * 表达变化一致 值依次分别为,%' # 和 #)' 及 $%$ 及 图 ; 图 不同浓度竹叶提取物对低氧下 细胞增殖的影响 &98.188/! 1!!/1! /.1! $%&' 0.B/108/1!!/1 %%)' 法检测 $%&' 细胞活性 ;-./!01 检测结果与统计学分析 %*+',%* 法检测结果的统计学分析 与低氧组相比 # 竹叶提取物对 细胞周期的诱导阻滞 流式细胞仪检测结果显示 与低氧组相比 " 竹叶提取物组均促使低氧下 $%&' 细胞 ( 和 期比例减少 ($ 期比例增多 并随着浓度的升高而增加 图 竹叶提取物对 细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示 与低氧组相比 " 和 竹叶提取物均能显著诱导低氧下 $%&' 细胞凋亡 且呈现浓度依赖性趋势 值依次分别为 及 # 图 -./!01 结果显示 与低氧组相比 不同浓度的竹叶提取物作用下 低氧细胞中 和..' 表达均升高 0' 和./22! 表达均降低 且都随着浓度的升高而增强 值依次分别为..' 及 " 及 0'"" 及 ##./22! 及 # 图 %;!

4 " 西安交通大学学报 医学版 第 卷 图 流式细胞仪检测不同浓度竹叶提取物对低氧下 细胞周期分布的影响 &98.188/! 1!!/1! /.1! $%&' 0.B 0//.!/1.! 801C 1/ 低氧组 竹叶提取物组 %" 竹叶提取物组 ; 竹叶提取物组 图 不同浓度竹叶提取物对低氧条件下 细胞凋亡的影响 &98.188/! 1!!/1! /1! $%&' 0.B11..1!1 流式细胞仪检测 $%&' 细胞凋亡 %;-./!01 法检测凋亡相关蛋白表达 与低氧组相比 # 竹叶提取物抑制 信号通路转导 -./!01 结果显示 与正常组相比 低氧组 3 4&' 通路被显著激活 而 的竹叶提取物能下调低氧组 3 的磷酸化和 4&' 的表达 值依次分别为 '3" 及 4&'"" 及 " 图 " 同时 发现 (&' 不仅可逆转竹叶提取物对 34&' 通路的下调 也减小了竹叶提取物对 $%&' 细胞增殖 值为 # 和凋亡 值为 的影响 值分别为,%#)' $%$##..'## 图 "%&!

5 期 徐其锋 温晓琼 竹叶提取物通过调控 34&' 通路抑制低氧条件下人乳腺癌 $%&' 细胞的恶性生长 # 图 不同浓度竹叶提取物对 信号通路的影响 &"98.188/! 1!!/1! /.1!34&'.!0!C '3 和 4&' 蛋白的 -./!01 检测结果 %%%)' 法检测 $%&' 细胞活性 ; 流式细胞仪检测 $%&' 细胞凋亡 9,%)' 和 $%$ 的 *+',%* 检测结果 &..' 试剂盒检测..' 活性 与正常组相比 与低氧组相比 与 竹叶提取物组相比 讨 论乳腺癌作为困扰女性健康的一大难题 其发病率 ' 正在以 D D 的速度逐年攀升 临床应用的肿瘤化疗药物常伴有疼痛 呕吐 进食困难等严重的不良反应 因此 从传统中药中筛选具有良好抗乳腺癌活性的药物已成为近年来人们关注的热点 竹叶作为新开发的一类天然植物资源 已发现其具有抗癌活性 竹叶黄酮可显著抑制体内肝癌实体瘤的生长 " 延长荷瘤小鼠的寿命 而竹叶多糖对移植性肿瘤有间接抑制作用 抑制率高达 #D # 也有研究提示 竹叶提取物能通过刺激动物排泄和泌乳雌激素的分泌 促进免疫血清中超氧化物歧化酶活性 抑制乳 腺肿瘤生长 这提示竹叶提取物对乳腺癌具有一定的抑制作用 细胞增殖过度和凋亡阻遏是肿瘤的基本特征 而在癌细胞恶性生长过程中 低氧或缺氧也是实质性 肿瘤物理微环境的基本表现之一 有文献证实 在低氧环境下乳腺癌细胞表现出恶性增殖趋势 4&' 和..' 可作为判断乳腺癌恶性程度和预后 状况的重要指标 研究发现 4&' 在正常乳腺组织中少量或几乎不表达 而在乳腺癌组织中高表 达 本实验结果显示 竹叶提取物可浓度依赖性地抑制低氧条件下 $%&' 细胞的增殖 促进 $%&' 细胞凋亡 同时抑制 4&' 的上调 诱导..' 表达 均证实了竹叶提取物具有良好的抗乳腺癌活性 另外 从竹叶中获得的一种天然光敏感剂可显著增加鳞状癌细胞系 4% 和 4%($ 期细胞比 例 这提示竹叶提取物可能通过诱导乳腺癌细胞周期阻滞抑制其增殖 本实验结果显示不同浓度的竹叶提取物均可诱导低氧条件下 $%&' 细胞阻滞在 ($ 期 为竹叶提取物的抗乳腺癌作用提供了进一步的依据 近年来 发现实体肿瘤中普遍存在低氧现象 而 4&' 与低氧环境关系最为密切 其可在低氧状态下被激活并参与癌细胞增殖 凋亡等病理过程 因此 4&' 及其上游信号通路成为目前针对肿瘤治疗的一个新靶点 一方面 3 可促进下游靶蛋白 ()' 磷酸化 抑制 4&' 降解使 4&' 表达上调 另一方面 3 也可通过激活下游 +* 表达促!

6 西安交通大学学报 医学版 第 卷 " 进 4&' 基因转录 文献表明 在胃癌中,) 3 通路调控 4&' 表达 提示 4&' 介导的促 # 肿瘤作用可能是受上游,)3 通路调节 本实验发现 竹叶提取物可显著下调低氧条件下 $%&' 细胞中 3 的磷酸化和 4&' 的表达 且 3 激活剂 (&' 可逆转竹叶提取物对 $%&' 细胞的抑制作用 提示竹叶提取物可能是通过下调 34&' 信号通路来抑制低氧下 $%&' 细胞恶性生长 综上 本研究初步证实竹叶提取物可抑制低氧条件下 $%&' 细胞的恶性增殖 且这种作用可能是通过抑制异常的 34&' 信号通路而实现 初步肯定了竹叶提取物在乳腺癌中的重要作用 为竹叶在乳腺癌实体肿瘤中的应用提供了前期的理论依据和实验基础 但是其具体作用机制仍需进一步研究 参考文献 张华 &(2".)*%3/) 在乳腺导管癌中的表达及低氧对乳腺癌细胞株!!()* 生物学行为的影响 2& 苏州 苏州大学 *"& 张亚军 钱立庭 陈昌杰 & 黄连素对乳腺癌!()* 细胞增殖和凋亡的影响 & 安徽医科大学学报 ##*& 夏玉红 董晋文 钟耕 & 竹叶提取物的研究开发现状 & 中国食品添加剂 #*#& " 黄宇玫 罗文艳 & 竹叶黄酮对小鼠 肿瘤抑制作用的研究 & 实用中西医结合临床 #*& # 张永兵 & 竹叶提取物对酪氨酸酶和黑色素瘤细胞的影响 2& 北京 中国林业科学研究院 *& 葛嘉 祝青 余晓梅 等 & 乳腺造影和弹性成像在乳腺癌诊断中的意义 & 中国实验诊断学 #*& 李静 范金虎 庞轶 等 & 以医院为基础的全国多中心女性原发性乳腺癌临床流行病学调查 & 中国肿瘤 "#"* #& 郝培应 徐有明 皮忠来 & 竹类植物衍生物的生理活性及其疗效的研究进展 & 世界林业研究 "*"& 24'/ 5-.! -33!&(##+ * +"+"!&' 51$+ *& 马兆生 戴岳楚 谢伯剑 等 &.)* 与 #+* 在乳腺癌中的表达及临床病理意义 & 现代肿瘤医学 * & 闫哲 白立立 赵伟静 等 &.)*3*#" 在乳腺中的表达及意义 & 河北医学 #"*& -.!$-334$& ""+*,"+# ""#1###& ###*#& 余平 刘晓旺 钟丽菲 等 & 低氧微环境相关因子.)* 与癌症的研究 & 湖南生态科学学报 ##*#& " 郭花 朱金水 王龙 等 &.01 信号通路及.)* 在胃癌中的表达 & 现代肿瘤医学 *& #! /& +###* + &(#!"*#& 编辑 国 荣 上接第 # 页 ##"&2+ ""*& 23-( %!-./'$$$$&#*( 4' 4-'2.(- %-&"+* #+"!4*#'#* ##*(#+'++ #"++&3## ( #"++#+&'+# '##"*"& *& (3%3*'3$.-3! -0 &!4 $!.-35 )(033-3.$ (&"#" ++"# #&!#* /" " ##7# ""*"& 7"+""&( ' )'!-..'/ &!*#* *& "* " ""* "$40 ''.$.'.'0.'4$. &(# "&#/*& "+++# "+ -'/)63'/ 2$'/!)&# # "# /#+*""!4 +%' + + #"* -*+###&$# "+""&!( &!"/"& #$404-4$0.!3' 5$$3!'&/* 42%.$0'-.(&/2#+ #/.'"+#42(#"* "2' +#"++* +#" *# #+"+#,+&!#* #"""# +# &! # #& #*&!''483'24!$4' 0& 编辑 韩维栋 7"+"#+"**!

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