第 37 卷第 19 期 2015 年 10 月 15 日第三军医大学学报 J Third Mil Med Univ Vol.37,No.19 Oct DOI: /j 论著 MicroRNA 193b 对 K562 细

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1 1955 DOI: /j 论著 MicroRNA 193b 对 K562 细胞 bcr/abl 表达的影响舒燕, 齐杰玉, 王灿蔚, 于淑静, 陶? ( 重庆, 重庆医科大学基础医学院免疫学教研室, 分子医学与肿瘤研究中心 ) [ 摘要 ] 目的用 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒感染 K562 细胞, 探讨 mir 193b 在细胞中过表达对 bcr/abl 表达的影响方法将前期构建的 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒感染 K562 细胞后, 采用荧光定量 PCR(qRT PCR) 检测 mir 193b 的表达 ;qrt PCR 检测 bcr/abl 融合基因的表达 ;Westernblot 检测 BCR/ABL 融合蛋白的表达 ;CCK 8 检测 K562 细胞的增殖情况, 流式细胞术 (FCM) 检测 K562 细胞凋亡率结果与对照比较,K562 细胞感染 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒后,miR 193b 表达明显升高 ;bcr/abl 融合基因及 BCR/ABL 融合蛋白表达明显下调 ;K562 细胞增殖能力明显降低 (P<0.05), 凋亡水平明显升高 (P<0.05) 结论 mir 193b 可下调 bcr/abl 表达, 抑制 K562 细胞的生物学效应, 过表达 mir 193b 能作为治疗 CML 的有效手段 [ 关键词 ] mir 193b;K562 细胞 ;bcr/abl [ 中图法分类号 ] R394.3;R730.23;R [ 文献标志码 ] A MicroRNA 193bdown regulatesbcr/ablink562cels ShuYan,QiJieyu,WangCanwei,YuShujing,TaoKun(DepartmentofImmunology,ResearchCenterofMolecular MedicineandCancer,ColegeofBasicMedicalSciences,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400016,China) [Abstract] Objective TodeterminetheefectofmiR 193bover expresionontheexpresionofbcr/ ablinchronicmyelocyticleukemiak562celsbytransfectionofrecombinantadenovirusofad pre microrna 193b.Methods AfterK562celswereinfectedbyAd pre microrna 193bvirus,theexpresionofmiR 193bwasdetectedbyreal timepcr.theexpresionofbcr/ablatmrnaandproteinlevelswasdetectedby qrt PCRandWesternbloting.CelproliferationwasmeasuredbyCCK 8asay,andcelapoptosiswas testedby flow cytometry. Results Compared with controlcels, the levelofmicrorna 193b was significantlyup regulatedink562celsafterad pre microrna 193binfection.Theexpresionofbcr/ablwas significantlydecreased,andbcr/ablfusionproteinwasdecreasedtoo.thevirusinfectionresultedin significantinhibitionincelproliferationandobviousimprovementinapoptoticrate(bothp<0.05). Conclusion mir 193bdown regulatestheexpresionofbcr/ablandinhibitsthebiologicalefectsofk562 cels.theover expresionofmir 193bmaybeanefectivetargetinthetreatmentofchronicmyelogenous leukemia. [Keywords] microrna 193b;K562cels;bcr/abl SupportedbytheNaturalScienceFoundationofChongqing(CSTC2010BB5369S).Corespondingauthor:TaoKun,E mail:taokun68@126.com 慢性粒细胞白血病 (chronicmyelogenousleukemia, CML) 是一种起源于造血干细胞的恶性血液系统疾病, [ 基金项目 ] 重庆市自然科学基金 (CSTC2010BB5369S) [ 通信作者 ] 陶?,E mail:taokun68@126.com [ 优先出版 ] htp:// html( ) 其发生是由于 t(9;22)(q34;ql1) 所致的 bcr/abl 融合基因并编码产生具有强烈酪氨酸激酶活性的 BCR/ ABL 融合蛋白 (P210), 后者使造血干细胞发生异常转化而导致 CML 形成在 CML 的治疗中, 传统的放化疗副作用比较大, 最有效的方法慢性期异基因造血干细胞移植受供体来源的影响, 目前, 主要是针对 BCR/

2 1956 ABL 进行靶向治疗的酪氨酸激酶抑制剂 STI571 [1], 但易产生耐药因此, 探索其他治疗方法具有重要的实际意义微小 RNA(MicroRNA,miRNA) 是一种长度为 19~26nt 的非编码单链小分子核苷酸, 在转录后通过抑制蛋白质的翻译或导致 mirna 的降解来抑制基因的表达 [2-3] 近年来, 研究发现 mirna 的表达失控与肿瘤发生密切相关, 在肿瘤发生过程中可以起到癌基因或抑癌基因作用 [4] 人微小 RNA 193b (microrna 193b,miR 193b) 位于 16 号染色体上, 在 CML 细胞株 K562 细胞中表达明显下调, 同时它可抑制急性粒细胞白血病细胞生长及促进其凋亡 [13] 鉴于此, 本研究拟将前期构建的 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒感染 K562 细胞, 实现 mir 193b 在其中高效表达, 探索 mir 193b 对 K562 细胞 bcr/abl 表达的影响, 旨在为寻找治疗 CML 的有效靶点奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒由重庆医科大学基础医学院免疫学教研室构建并鉴定 ;K562 细胞重庆医科大学基础医学院免疫学教研室保存 ;qrt PCR 试剂盒和 miscript 逆转录试剂盒均购自 TaKaRa 公司 ; 引物由上海生工生物公司合成 ;CCK 8 试剂盒购自 Beyo time 生物有限公司 ; 兔抗人 c ablpab 购自 celsignal 公司, 兔抗人 β actinpab HRP 标记的羊抗兔 IgG 均购自北京四正柏公司 RPMI1640 培养液小牛血清均购自 HyClone 公司 1.2 方法重组腺病毒感染 K562 细胞将生长良好的 K562 细胞以 / 孔接种于 6 孔板中实验设 3 组,Ad pre mirna 193b 组和空载腺病毒组采用 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒和空载病毒 Ad 以最适感染复数 (MOI=10) 分别感染 K562 细胞 ; 以未感染的 K562 细胞作为空白对照组每组细胞培养 48h 后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况, 提取总 RNA 及总蛋白, 检测 mir 193b bcr/abl 融合基因及其融合蛋白的表达 qrt PCR 检测 mir 193b 在 K562 细胞中的表达分别用 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒和空载病毒 Ad 感染 K562 细胞, 每组细胞培养 48h 后, TRIzol 提取每组总 RNA 设计合成 mir 193b 茎环结构的特异性逆转录引物, 序列为 :5 GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT 3, 按照 miscript 逆转录试剂盒说明书逆转录总 RNA 得到 cdna 以 U6 为内参基因, 采用实时荧光定量 PCR 检测 3 组基因表达水平,miR 193b 引物序列 : 正义链 5 GCGGCGGCGGGGTTTTGAGGGC 3, 反义链 5 ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG 3 ;U6 引物序列 : 正义链 5 CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 3, 反义链 5 ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC 3,PCR 条件为 :95 30s,95 10s,56 20s,72 30s,40 个循环溶解曲线 :65 ~95, 每 5s 增加 0.5 用 2 ΔΔCt 值计算目的基因的相对表达量 qrt PCR 检测感染 K562 细胞中的 bcr/abl 融合基因的表达分别用 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒和空载病毒 Ad 感染 K562 细胞, 每组细胞培养 48h 后,TRIzol 提取每组总 RNA 设计合成 bcr/abl 和 β actin 引物序列按照 miscript 逆转录试剂盒说明书将总 RNA 进行逆转录, 得到 cdna 采用 qrt PCR 法检测每组 bcr/abl 融合基因的表达水平,bcr/ abl 引物序列 : 正义链 5 GCAAGCTTACCATGGACAT CCGTGG 3, 反义链 5 GTCGACCTTGCCATCAGAAGC 3, β actin 引物序列 : 正义链 5 ACACTGTGCCCATCTAC GAG 3, 反义链 5 CACAGGATTCCATACCCAAG 3, 反应条件都为 95 30s,95 10s,55 20s,72 30s, 40 个循环熔解曲线 :65~95, 每 5s 增加 0.5 用 2 ΔΔCt 值计算目的基因的相对表达量 Westernblot 检测感染 K562 细胞中 BCR/ABL 融合蛋白的表达分别用 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒和空载病毒 Ad 感染 K562 细胞, 收集细胞用 RIPA 蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白,BCA 检测各组蛋白浓度经 SDS PAGE 电泳后电转移至 PVDF 膜上后, 用 5% 脱脂奶粉封闭 2h; 分别加入兔抗人 c abl 抗体 ( 稀释 ) 兔抗人 β actin 抗体 ( 稀释 ),4 孵育过夜 ; 加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG ( 稀释 ),37 孵育 1h 后经 ECL 发光显色系统显色 CCK 8 检测感染 K562 细胞的增殖能力将生长良好的 K562 细胞接种于 96 孔板中, 感染 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒培养 48h 后为第 1 天, 设置 5 个时间点 ( d), 分别在各个时间点时加入 CCK 8 试剂, 继续培养 4h 后在酶标仪 450nm 波长处检测各组的光密度值 [D(450)] 分别设置未感染 K562 细胞及感染空载体 K562 细胞组为对照组, 并设置试剂对照组, 每组设 5 个复孔流式细胞仪检测 K562 细胞凋亡率将生长良好的 K562 细胞接种于 6 孔板中, 分别用 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒和空载病毒 Ad 感染 K562 细胞作为 Ad pre mir 193b 组和空载腺病毒组 ; 以未感染的 K562 细胞作为空白对照组, 每组设 3 个复孔

1957 72h 后收集每孔细胞于离心管中,10000r/min, 离心 5min, 弃上清,PBS 洗涤 2 次, 再用 1mLPBS 重悬细胞转入 EP 管中, 采用 AnnexinV PE 细胞凋亡检测试剂盒, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平 1.3 统计学分析应用 SPSS17.0 统计软件分析, 数据以 x±s 珋表示, 两组数据资料的比较采用独立样本 t 检验 2 结果 2.

05±0.21)vs(0.23±0.07),P< 0 01] 2.4 Westernblot 检测 BCR/ABL 融合蛋白的表达水平 Westernblot 检测结果显示 : 感染 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒组与两对照组相比,BCR/ABL 融合蛋白表达水平明显降低 (P<0.05), 空载腺病毒组和空白对照组之间差异无统计学意义 (P>0.05, 图 3)!

2 qrt PCR 检测 mir 193b 的表达量 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒感染 K562 细胞 48h 后,miR 193b 的表达水平较空载腺病毒组空白对照组显著升高 (P<0.

3 h 后收集每孔细胞于离心管中,10000r/min, 离心 5min, 弃上清,PBS 洗涤 2 次, 再用 1mLPBS 重悬细胞转入 EP 管中, 采用 AnnexinV PE 细胞凋亡检测试剂盒, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平 1.3 统计学分析应用 SPSS17.0 统计软件分析, 数据以 x±s 珋表示, 两组数据资料的比较采用独立样本 t 检验 2 结果 2.1 重组腺病毒感染 K562 细胞后绿色荧光的表达重组腺病毒感染 K562 细胞 48h 后,GFP 达到 80% 以上, 重组腺病毒在体外可高效感染 K562 细胞 ( 图 1) 2.3 qrt PCR 检测 bcr/abl 融合基因的表达量 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒感染 K562 细胞 48h 后,bcr/abl 融合基因的表达水平较空载腺病毒组显著降低 [(1.05±0.21)vs(0.23±0.07),P< 0 01] 2.4 Westernblot 检测 BCR/ABL 融合蛋白的表达水平 Westernblot 检测结果显示 : 感染 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒组与两对照组相比,BCR/ABL 融合蛋白表达水平明显降低 (P<0.05), 空载腺病毒组和空白对照组之间差异无统计学意义 (P>0.05, 图 3)! " A B:Ad pre mirna 193b 组 ;C D: 空载腺病毒组 ;A C: 光镜观察 ;B D: 荧光显微镜下观察图 1 荧光显微镜观察重组腺病毒感染 K562 细胞 48h 后的效率 ( 100) 2.2 qrt PCR 检测 mir 193b 的表达量 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒感染 K562 细胞 48h 后,miR 193b 的表达水平较空载腺病毒组空白对照组显著升高 (P<0.01, 图 2) a:p<0 01, 与 Ad pre mirna 193b 组比较 1: 空白对照组 ;2: 空载腺病毒组 ;3:Ad pre mirna 193b 组图 2 qrt PCR 检测各组 K562 细胞 mir 193b 的表达 1:Ad pre mirna 193b 组 ;2: 空载腺病毒组 ;3: 空白对照组 A:Westernblot 检测结果 ;B: 半定量分析结果 0 05, 与 Ad pre mirna 193b 组比较 a:p< 图 3 Westernblot 检测各组 BCR/ABL 融合蛋白的表达 2.5 CCK 8 检测细胞的增殖能力与两对照组相比,Ad pre mirna 193b 组 K562 细胞增殖明显受到抑制 (P<0.05), 空载腺病毒组和空白对照组之间差异无统计学意义 (P>0.05, 图 4)! "# a:p<0.05, 与 Ad pre mirna 193b 组比较图 4 CCK 8 检测各组 K562 细胞增殖能力

4 1958 A: 空白对照组 ;B: 空载腺病毒组 ;C:Ad pre mirna 193b 组图 5 流式细胞术检测 mirna 193b 对 K562 细胞凋亡的作用 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 Ad pre mirna 193b 组凋亡率 [(13.60±0 22)%] 与空载腺病毒组 [(2.69±0.10)%] 和空白对照组 [(2.04% ±0.13)%] 比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05, 图 5) 3 讨论 bcr/abl 融合基因由 9 号染色体长臂断端远侧的 c abl 原癌基因与 22 号染色体长臂断端近侧的 bcr 基因异位相互连接形成, 其存在于 90% 的 CML 患者中, 编码产生具有强烈酪氨酸酶活性的 BCR/ABL 蛋白使 CML 患者病情恶化因此, 针对 bcr/abl 融合基因及其蛋白的靶点治疗 CML 备受重视 : 如反义 RNA 反义 DNA 反义核酶 RNA 干涉技术和 BCR/ABL 蛋白激酶抑制剂 STI571 [5] 但由于 CML 通常会发生继发性遗传学改变, 导致临床上 CML 由慢性期发展为急变期, 即便是 STI571, 对急变期 CML 细胞的抑制作用也明显减弱 [6] 因此, 需要寻求新的机制调控 bcr/abl 融合基因近年研究表明,miRNA 参与白血病肺癌结肠癌等恶性肿瘤的发生发展过程 [7], 在转录后通过抑制蛋白质的翻译或导致 mrna 的降解来抑制基因的表达目前, 在人类肿瘤和肿瘤细胞株中, 已鉴定出不同的 mirna 表达谱根据 mirna 作用的靶基因不同, 其在不同癌组织中发挥的作用也不同, 其中 mirna 的抑癌作用成为 CML 治疗研究热点 mir 193b 是一种肿瘤抑制基因, 在乳腺癌恶性黑色素瘤白血病前列腺癌等肿瘤中表达下调, 具有调节肿瘤细胞的增殖侵袭转移凋亡以及对化疗药物敏感性都具有重要的作用 [8-17] 如 mir 193b 在乳腺癌中表达降低, 过表达的 mir 193b 通过抑制 α 型雌激素受体和尿激酶型纤溶酶原激活剂, 从而抑制乳腺癌细胞株的增殖和侵袭 [8-9] ; 研究发现, 在恶性黑色素瘤和肝癌中, 过表达的 mir 193b 可以靶向作用于 cyc lind 和 Mcl 1, 抑制癌细胞增殖转移侵袭, 促进癌细胞的凋亡 [10-12,16] [16] Mao 等研究证实在乙型肝炎性肝癌细胞中,miR 193b 通过靶向作用于 Mcl 1 降低肝癌细胞对化疗药物索拉菲尼的抵抗, 增强肝癌细胞对 [13] 其作用的敏感性, 促进癌细胞凋亡 Gao 等利用健康人骨髓标本急性髓细胞白血病 (acutemyelogenous leukemia,aml) 患者骨髓标本以及白血病细胞株 (Kasumi 1 HL 60 NB4 U937 KG 1 K562), 采用荧光定量 PCR 检测发现 mir 193b 在 AML 患者细胞中以及白血病细胞株中表达量明显降低, 并证实 mir 193b 可以直接靶向作用于 c Kit 原癌基因, 抑制 Kasumi 1 细胞生长, 为 AML 的治疗提供了新的治疗靶点鉴于此, 本研究利用前期构建的 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒转染 K562 细胞, 实现 mir 193b 的过表达, 探索 mir 193b 对 K562 细胞中 bcr/abl 的表达及增殖能力的影响, 从细胞水平探讨其抗白血病的效应本研究表明, 前期构建的 Ad pre mirna 193b 重组腺病毒可高效感染 K562 细胞, 实现 mir 193b 在 K562 细胞中的过表达 K562 细胞中过表达的 mir 193b 可抑制 bcr/abl 融合基因及 BCR/ABL 蛋白的表达同时, 本研究结果显示过表达的 mir 193b 可明显抑制 K562 细胞的增殖, 增加其凋亡, 提示 mir 193b 可能具有潜在的抗白血病效应, 但还有待于在更多白血病细胞株中加以验证总之, 本研究证实过表达 mir 193b 可抑制 bcr/abl 融合基因及 BCR/ABL 蛋白的表达, 抑制 K562 细胞增殖 K562 细胞的增殖抑制可能与过表达的 mir 193b 诱导的细胞凋亡有关, 具体

5 1959 机制尚待后续进一步研究本研究为后续进一步研究 mir 193b 的抗白血病效益提供了实验依据参考文献 : [1] FaderlS,KantarjianH M,TalpazM.Chronicmyelogenous leukemia:updateonbiologyandtreatment[j].oncology (WilistonPark),1999,13(2): [2] MauroM J,DeiningerM W.Chronicmyeloidleukemiain 2006:aperspective[J].Haematologica,2006,91(2): 152. [3] RoweJM.ClosingthegapinCML[J].Blood,2007,109 (6):2271. [4] MeltzerPS.Cancergenomics:smalRNAswithbigimpacts [J].Nature,2005,435(7043): [5] YamamotoM,KurosuT,KakihanaK,etal.Thetwomajor imatinibresistancemutationse255kandt315ienhancethe activityofbcr/ablfusionkinase[j].biochembiophysres Commun,2004,319(4): [6]HochhausA,KreilS,CorbinAS,etal.Molecularandchro mosomalmechanismsofresistancetoimatinib(sti571)ther apy[j].leukemia,2002,16(11): [7]CarmelM A,GirardA,van de KantH J,etal.MIWI2is esentialforspermatogenesisandrepresionoftransposonsin themousemalegermline[j].devcel,2007,12(4): [8]LeivonenSK,MakelaR,OstlingP,etal.Proteinlysatemi croarayanalysistoidentifymicrornasregulatingestrogenre ceptorsignalinginbreastcancercellines[j].oncogene, 2009,28(44): [9]LiXF,YanPJ,ShaoZM.DownregulationofmiR 193b contributestoenhanceurokinase typeplasminogenactivator (upa)expresionandtumorprogresionandinvasioninhu manbreastcancer[j].oncogene,2009,28(44): [10] ChenJ,FeiloterH E,PareGC,etal.MicroRNA 193b represescelproliferationandregulatescyclind1inmela noma[j].amjpathol,2010,176(5): [11]ChenJ,ZhangX,LentzC,etal.miR 193bRegulatesMcl 1inMelanoma[J].AmJPathol,2011,179(5): [12]XuC,LiuS,FuH,etal.MicroRNA 193bregulatesprolif eration,migrationandinvasioninhumanhepatocelularcar cinomacels[j].eurjcancer,2010,46(15): [13]GaoXN,LinJ,GaoL,etal.MicroRNA 193bregulatesc Kitproto oncogeneandrepresescelproliferationinacute myeloidleukemia[j].leukres,2011,35(9): [14]MetsE,Van der MeulenJ,Van PeerG,etal.MicroRNA 193b 3pactsasatumorsuppresorbytargetingtheMYB oncogeneint celacutelymphoblasticleukemia[j].leu keimia,2015,29(4): [15] XieC,JiangX H,ZhangJT,etal.CFTR suppreses tumorprogresion through mir 193b targeting urokinase plasminogenactivator(upa)inprostatecancer[j].onco gene,2013,32(18): [16]MaoK,ZhangJ,HeC,etal.RestorationofmiR 193bsen sitizeshepatitisbvirus asociatedhepatocelularcarcinoma tosorafenib[j].cancerlet,2014,352(2): [17]HuH,LiS,LiuJ,etal.MicroRNA 193bmodulatesprolif eration,migration,andinvasionofnon smalcellungcanc ercels[j].actabiochimbiophyssin(shanghai),2012, 44(5): ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑吴培红 )

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