708 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016May;32(5) 衍生物之一, 已在临床普遍应用于抗疟治疗, 其药理作用较为安全稳定 国内外报道青蒿琥酯对多种肿瘤细胞有抑制作用, 但对结肠癌细胞的抑制作用机制尚未明确 [1] 而阻断结肠癌细胞内 Wnt/

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1 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016May;32(5):707~ 网络出版时间 : :06 网络出版地址 :htp:// 青蒿琥酯诱导人结肠癌细胞凋亡与 Wnt/β catenin 信号通路的关系研究 郭颖 1, 田芝瑜 2, 符航 3, 孙黎 4, 刘芳 4, 罗强 4 4, 张林西 ( 河北北方学院 1. 病理学教研室 2. 临床医学专业 2013 级学生 3. 医学影像专业 2012 级学生 4. 生命科学研究中心, 河北张家口 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 中国图书分类号 :R 332;R322 11;R329 24;R542 22; R 摘要 : 目的研究青蒿琥酯 (ART) 对人结肠癌 Lovo 细胞增殖的影响和可能的分子机制 方法采用噻唑蓝实验 (MTT) 检测 ART 对 Lovo 细胞的增殖抑制作用, 用流式细胞术和电镜检测 ART 对细胞凋亡的影响, 荧光素酶报告质粒检测 ART 对 Wnt/β catenin 通路中 TCF4/LEF 转录活性的影响,Westernblot 检测 ART 对细胞内 β catenin GSK 3β c Myc 以及凋亡相关蛋白 caspase 3 表达的影响 结果与对照组相比,ART 能抑制 Lovo 细胞增殖,72h 320μmol L -1 收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 河北省高等学校科学技术研究青年基金项目 (NoQN ); 河北省高等学校科学技术研究重点项目 (No ZD ) 作者简介 : 郭颖 (1982-), 女, 硕士, 讲师, 研究方向 : 消化道肿瘤病理学,E mail:guoyingguo2008@163.com; 张林西 (1968-), 男, 博士, 教授, 研究方向 : 消化道肿瘤病理学,E mail:zlxwx1@163.com ART 的细胞抑制率高达 (78 99±1 95)%(F= ,P =0 000) ART 能诱导细胞凋亡,24h 160μmol L -1 ART 的细胞早期凋亡率达到 (19 00±0 05)%, 同时电镜观察到细胞凋亡的形态学表现 ART 能降低 TCF4/LEF 报告质粒的荧光素酶活性,24h 160μmol L -1 ART 可使 TCF4/LEF 报告质粒的荧光素酶活性降至 (0 36±0 30)% (F= ,P<0 01);ART 处理 48h 后,GSK 3β 和 caspase 3 呈浓度依赖性升高 (P<0 01), 而 β catenin 和 c Myc 蛋白水平呈药物浓度依赖性降低 (P<0 01) 结论青蒿琥酯能明显抑制结肠癌 Lovo 细胞增殖, 并促进其凋亡, 可能与抑制 Wnt/β catenin 信号通路活化有关 关键词 : 青蒿琥酯 ; 结肠癌细胞 ; 增殖 ; 凋亡 ;Wnt/β catenin 通路 ;TCF4/LEF 青蒿素作为抗疟药之一, 是从植物青蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物 我国著名科学家屠呦呦也因此获得诺贝尔生理学或医学奖, 并在颁奖礼上告诉全世界 青蒿素是传统中医给世界的礼物 而青蒿琥酯 (artesunate,art) 作为青蒿素的

2 708 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016May;32(5) 衍生物之一, 已在临床普遍应用于抗疟治疗, 其药理作用较为安全稳定 国内外报道青蒿琥酯对多种肿瘤细胞有抑制作用, 但对结肠癌细胞的抑制作用机制尚未明确 [1] 而阻断结肠癌细胞内 Wnt/β cate nin 信号通路的活化, 能抑制结肠癌细胞的增殖并诱导凋亡 [2] 对于青蒿琥酯诱导结肠癌细胞凋亡是否通过 Wnt/β catenin 信号通路, 目前尚不明确 本研究将针对细胞内 Wnt/β catenin 信号通路关键因子 β catenin GSK 3β TCF4/LEF 及靶基因 c Myc 为研究方向, 探索青蒿琥酯诱导结肠癌细胞凋亡的影响机制 1 材料与方法 1.1 试剂与细胞培养人结肠癌细胞 Lovo 购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞资源中心 青蒿琥酯购自桂林南药股份有限公司 ( 批号 H ) AnnexinV/PI 凋亡试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司, 蛋白提取和 BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所, 所有抗体和 ECL 发光试剂盒均购自 SantaCruzBio technology 公司, 荧光素酶报告基因试剂盒购自 New EnglandBiolabs(Beijing) 公司 Lovo 细胞培养于含 10% 胎牛血清的 F12K 培养基 ( 购自 SigmaAldrich 公司 ), 在 5% CO 2 37 温箱中培养 1.2 实验设计及分组分为对照组和实验组 实验组用 ART 处理, 设立 μmol L -1 6 个浓度梯度 ; 对照组的处理是相同体积的 DMSO 1.3 MTT 法评估细胞增殖将细胞按 密度种于 96 孔板, 用不同浓度 ART( μmol L -1 ) 处理, 每个浓度设 4 个复孔, 分别处理 h 后, 加入 MTT 染液,4h 后弃上清, 每孔加入二甲基亚砜 (DMSO)100μL, 温箱放置 15min, 用酶标仪检测 570nm 波长处的 OD 值 细胞增殖抑制率 /% =(1- 实验孔 OD 值 / 对照孔 OD 值 ) 100% 1.4 流式细胞术检测细胞凋亡处于对数生长期的细胞待贴壁后, 按实验设计加入不同浓度 ART ( μmol L -1 ),24h 后收集细胞, 先用预冷 PBS 清洗 2 遍, 然后分别滴加 Annexin VFITC 和 PI 处理细胞 ( 按试剂盒说明进行 ), 最后通过流式细胞仪进行凋亡检测 1.5 透射电镜观察细胞形态及凋亡情况将不同浓度药物作用细胞 48h,PBS 冲洗后, 用 2 5% 戊二醛 1% 锇酸固定细胞, 常规制作透射电镜样本, 观察各组细胞器的超微结构变化 1.6 荧光素酶报告质粒检测 Wnt 通路信号转导的变化将处于对数生长状态的细胞铺于 T25 培养瓶中, 待细胞贴壁后, 用 Lipofectamine 转染 LEF/TCF4 报告质粒 (ptop Luc)3μg,4h 后换液 12h 后将细胞消化并重新种于 24 孔板中, 待细胞贴壁后, 按实验设计加入不同浓度 ART( μmol L -1 ) 进行处理 24h 后, 裂解细胞, 收集裂解液, 并按试剂盒操作说明进行荧光素酶活性测定 用 BCA 法测定总蛋白浓度, 每组实验重复 3 次, 结果取平均值 1.7 Westernblot 法检测凋亡相关蛋白及 Wnt 通路关键蛋白的表达将对数生长期的细胞按实验设计加入不同浓度 ART( μmol L -1 ) 进行处理, 药物作用 48h 后, 提取各组蛋白 采用 8% 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳, 转膜 封闭 孵育一抗 二抗 洗膜 显影 定影 成像, 上机检测, 每组实验重复 3 次 1.8 统计学方法结果以 x±s 珋表示, 运用 SPSS 13 0 统计软件进行组间多因素比较, 采用重复测量设计的方差分析, 组间两两比较采用 Bonferoni 法 ; 同时采用单因素非参数检验 2 结果 2.1 ART 对 Lovo 细胞增殖的影响经 μmol L -1 青蒿琥酯处理 Lovo 细胞 h 后增殖抑制率比较, 不同浓度间存在差别 (F= ,P=0 000), 两两比较采用 Bon feroni 法, μmol L -1 组差异没有统计学意义 (P=0 191), 其余任两组比较差异均有统计学意义 (P<0 05); 不同时相的抑制率也存在差别 (F= ,P=0 000); 不同浓度与不同时间的抑制率差异有统计学意义 (F=10 675,P=0 000), 说明在不同浓度下不同时间变化的趋势不同, 提示 ART 能抑制 Lovo 细胞增殖, 并在一定范围内呈时间和剂量依赖性 (Fig1) 2.2 ART 对 Lovo 细胞凋亡的影响用 ART 按不同浓度 ( μmol L -1 ) 处理 Lovo 细胞 24h 后, 流式细胞分析结果显示, 细胞早期凋亡率随药物浓度增加而增加 (Fig2A); 电镜结果显示, 药物处理组 Lovo 细胞染色质浓缩于核膜下, 呈新月形 胞质空泡化, 甚至出现凋亡小体等凋亡特征, 提示 ART 能促进 Lovo 细胞凋亡 (Fig2B) 2.3 ART 对 Lovo 细胞 TCF4/LEF 报告质粒转录活性的影响与阴性对照组 (1 00±0 00) 比较, μmol L -1 青蒿琥酯组 TCF4/LEF 活性 (0 75 ±0 26)% (0 53 ±0 15)% (0 36 ± 0 30)%, 呈逐渐降低的趋势, 且差异有统计学意义

3 中国药理学通报 Ch Ph m g Bu 2 1 6M 3 2 5 79 通路有关 3 讨论 结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一 2 12 年全球约有 14万结肠癌新发病例 占所有恶性肿瘤 3 死亡率占世界恶性肿瘤第 4位 4 虽然 的1 目前对结肠癌的诊断和治疗技术有了较大提高 但 结肠癌的预后仍不容乐观 而传统植物来源的药物 在治疗各种肿瘤中发挥着重要作用 5 青 蒿 素 m 是 我 国 科 学 家 屠 呦 呦 在 1971年 首 次 从 菊 科 植 物 黄 花 蒿 A m u L 提取的新型结构的倍半萜内酯化合物 它不 F g1 P h b u L 仅是一种高效 低毒的抗疟药物 同时也具有抗肿 瘤 抗病毒和免疫调节等应用价值 6 ART是青蒿 F 4795 4 P 1 青 蒿 琥 酯 可 明 显 抑 制 素的衍生物之一 已有报道 ART等青蒿素衍生物能 TCF4 LEF报告质粒的转录活性 且随药物浓度升 对7 余种肿瘤细胞有抑制作用 7 8 结合 ART毒 高 其抑制作用也依赖性增加 表明青蒿琥酯可明显 副作用低 不产生交叉耐药等特点 与其他化疗药物 抑制 W 通路的信号转导 β 联合应用 有 望 在 肿 瘤 治 疗 中 提 高 化 疗 药 物 的 疗 2 4 ART对凋亡关键蛋白 3及通路相关 效 9 本研究表明 ART对人 L 细胞的增殖有明 蛋白表达的影响 显抑制作用 且能诱导 L 细胞早期凋亡 电镜结 W b 结果显示 ART 2 1 8 1 6μm L 作用 48h后 与阴性对照组比 果显示经 ART处理 48h后的 L 细胞呈现细胞凋 较 3由 63± 7 上调至 1 7± 4 亡典型变化 而诱导凋亡可能与抑制 W β 4 P 1 GS K 3β 72± 2 上 F 17888 调至 129± 2 F 6 7 4 5 68 P 1 而 β 信号通路有关 由 9± 6 下调至 44± 4 F 8 9 6 19 P 1 M 由 64± 1 2 下 调 至 35± 2 F 57 24 P 1 F g3 提 示 ART诱导细胞凋亡可能与抑制 L 细胞 W β W 信号通路关键的正性调控因子 β β 在生理状态下主要在细胞膜上 是 β 表达 介导同型细胞之间的黏连 磷酸化肌醇 3激 酶 β g g h 3k β GSK3β 是 W 信号通路的重要负性调控因子 与胞质内 Ax APC F g2 E u L L w dw hd ART 2 4h w db w m m w m u B E m u 5 A F

4 710 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016May;32(5) Fig3 Efectsofartesunateondiferent kindsofproteinsinlovocelsafter48h 转录活性 Westernblot 研究发现, 随着 ART 浓度的升高,GSK 3β 表达上调, 而 β cat 和 c Myc 表达下调, 这可能是通过 GSK 3β 催化活性增强, 诱导破坏复合体 Axin APC GSK 3β 形成, 促进 β cat 降解, 减少向胞核内转移, 抑制 TCF4/LEF 报告质粒的转录活性, 一方面使下游靶基因 c Myc 的表达减弱 ; 另一方面能促进凋亡关键蛋白 caspase 3 表达, 诱导结肠癌细胞凋亡 总之, 本实验研究发现, 青蒿琥酯能够抑制结肠癌细胞的增殖 诱导其凋亡, 可能通过上调 GSK 3β, 下调 β catenin 和 c Myc, 抑制 Wnt/β catenin 信号通路有关 通过体外研究我们还发现,ART 能抑制结肠癌细胞侵袭和转移 [21], 下一步我们将进行体内实验, 建立结肠癌动物模型, 进一步研究 ART 抑制结肠癌细胞增殖 凋亡和侵袭转移的分子机制 等结合成 破坏复合体 (destructioncomplex), 与 β cat 结合, 并促进其磷酸化, 使 β cat 很快被蛋白酶体降解, 维持细胞内 β cat 的低水平状态 肿瘤细胞内 Wnt 信号通路被异常激活, 致 β cat 不能及时降解, 而由胞膜向胞质 胞核转移, 激活下游靶基因 c Myc Cyclin D1 MMP 7 等, 促进肿瘤的发生发展 [10-11] 有研究发现, 双氢青蒿素可通过 Wnt 信号通路抑制骨肉瘤细胞系体外增殖和迁移 [12], 青蒿琥酯可通过 Wnt 信号通路抑制卵巢癌细胞的侵袭 [13], 也能抑制结肠癌细胞的生长 [14], 但影响机制尚需探讨 目前 β cat 成为治疗结肠癌药物的重要靶点之一 [15], 对 Wnt 信号通路的研究也多集中于 β cat 的积累和入核, 对下游转录因子 TCF/LEF 知之甚少 而 TCF/LEF 在 Wnt/β cat 信号通路中起着分子开关的作用,β cat 进入细胞核后, 与 TCF/LEF 结合形成复合物, 调节下游靶基因的表达 许多肿瘤的发生发展与 TCF/LEF 家族密切相关 [16-18] 研究发现, 在核内转录因子 TCF/LEF 未激活的情况下, APC 基因可以激活半胱氨酸家族成员, 如 caspase 3, 然后清除多聚合酶, 使得细胞发生破碎, 从而引起 [19] 细胞凋亡 Jeong 等研究发现,TCF4 在人多种大肠癌细胞中高表达, 而正常细胞表达很低, 通过药物诱导 TCF4 低表达, 可以抑制 β cat/tcf4 转录活性, [20] 促进大肠癌细胞的凋亡 周密等用荧光素酶报告质粒法, 研究 Lovo 细胞中 TCF4/LEF 与靶基因 c Myc/Max 的转录活性降低来说明药物美洛昔康能明显下调细胞 Wnt/β cat 通路的信号转导 本实验结果显示,ART 能明显抑制 TCF4/LEF 报告质粒的 参考文献 : [1] KrishnaS,GanapathiS,SterIC,etal.A randomised,double blind,placebo controledpilotstudyoforalartesunatetherapyfor colorectalcancer[j].ebiomedicine,2014,2(1): [2] TanBL,EsaNM,RahmanHS,etal.Brewers riceinducesapop tosisinazoxymethane inducedcoloncarcinogenesisinratsviasup presionofcelproliferationandthewntsignalingpathway[j]. BMCComplementAlternMed,2014,14:304. [3] IrvingAA,YoshimiK,HartML,etal.TheutilityofApc mutant ratsinmodelinghumancoloncancer[j].dismodelmech,2014, 7(11): [4] BochisOV,IrimieA,PichlerM,etal.TheroleofSkp2andits substratecdkn1b(p27)incolorectalcancer[j].jgastrointestin LiverDis,2015,24(2): [5] 杨秋臖, 周龙洋, 刘映孜, 等. 小檗碱抑制 HCT116 细胞生长与 Wnt/β catenin 信号的关系研究 [J]. 中国药理学通报, 2012,28(9): [5] YangQJ,ZhouLY,LiuYZ,etal.Studyonthecorelationbe tweentheanti-proliferationefectofberberineonhct116cels andwnt/β cateninsignaling[j].chinpharmacolbul,2012, 28(9): [6] SoomroS,LangenbergT,MahringerA,etal.Designofnovelarte misinin likederivativeswithcytotoxicandanti angiogenicproper ties[j].jcelmolmed,2011,15(5): [7] ZhangP,LuoHS,LiM,etal.Artesunateinhibitsthegrowthand inducesapoptosisofhumangastriccancercelsbydownregulating COX 2[J].OncoTargetsTher,2015,8: [8] 陈献珊, 韩坤元, 陈锋夏, 等. 青蒿琥酯对肺癌 A549 细胞侵袭能力及 ICAM 1 MMP 9 表达的影响 [J]. 中国肺癌杂志, 2013,16(11): [8] ChenXS,HanKY,ChenFX,etal.Efectsofartesunateonthe invasionoflungadenocarcinomaa549 celsandexpresionof ICAM 1andMMP 9[J].ChinJLungCancer,2013,16(11): [9] BachmeierB,FichtnerI,KilianPH,etal.Developmentofre

5 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016May;32(5) 711 sistancetowardsartesunateinmda MB 231humanbreastcancer cels[j].plosone,2011,6(5):e [10] 郭颖, 郝青, 刘玉利, 等.β 连环蛋白和 E 钙依赖性黏附素蛋白在大肠腺癌中的表达及意义 [J]. 中国老年学杂志, 2015,35(12): [10] GuoY,HaoQ,LiuYL,etal.Thesignificanceaofβ catenin ande cadherinexpresionincolorectaladenocarcinoma[j].chin JGerontol,2015,35(12): [11] LinYU,WuT,YaoQ,etal.LGR5promotestheproliferationof colorectalcancercelsviathewnt/β cateninsignalingpathway [J].OncolLet,2015,9(6): [12] 王文娟, 赵丹, 徐静, 等. 双氢青蒿素通过阻断 Wnt/β catenin 信号抑制骨肉瘤细胞系体外增殖和侵袭 [J]. 基础医学与临床,2014,34(8): [12] WangW J,ZhaoD,XuJ,etal.Dihydroartemisinin(DHA)in hibitsproliferationandinvasionofosteosarcomacellineinvitroby suppresingwnt/β cateninsignaling[j].basicclinmed,2014, 34(8): [13]MarchionDC,XiongY,ChonHS,etal.Geneexpresiondatare vealcommonpathwaysthatcharacterizetheunifocalnatureofovar iancancer[j].amjobstetgynecol,2013,209(6):576. [14] CuiC,FengH,ShiX,etal.Artesunatedown regulatesimmuno suppresionfromcolorectalcancercolon26andrkocelsinvitro bydecreasingtransforminggrowthfactorβ1andinterleukin 10 [J].IntImmunopharmacol,2015,27(1): [15] 袁霜雪, 王东旭, 伍秋香, 等. 白藜芦醇抑制 HCT116 结肠癌细胞增殖与 Wnt/β catenin 的关系研究 [J]. 中国药理学通报, 2015,31(4): [15] YuanSX,WangDX,WuQX,etal.Studyontherelationship betweenanti-proliferationefectofresveratrolonhct116colon cancercelsandwnt/β catenin[j].chinpharmacolbul,2015, 31(4): [16]Brown ClayJD,ShenoyDN,TimofeevaO,etal.PBK/TOPKen hancesaggresivephenotypeinprostatecancerviaβ catenin TCF/ LEF mediatedmatrixmetaloproteinasesproductionandinvasion [J].Oncotarget,2015,6(17): [17]WangY,QiuZ,ZhouB,etal.Invitroantiproliferativeandantiox idantefectsofurolithina,thecolonicmetaboliteofelagicacid, onhepatocelularcarcinomashepg2cels[j].toxicolinvitro, 2015,29(5): [18] ZhangD,WangY,DaiY,etal.CIZ1promotedthegrowthand migrationofgalbladdercancercels[j].tumourbiol,2015,36 (4): [19]JeongJB,LeeJ,LeeSH.TCF4isamoleculartargetofresvera trolinthepreventionofcolorectalcancer[j].intjmolsci,2015, 16(5): [20] 周密, 何百成, 央茂盛. 美洛昔康抑制人结肠癌细胞增殖与 Wnt/β catenin 信号的关系研究 [J]. 中国药理学通报,2015, 31(3): [20]ZhouM,HeBC,YangM S.Anti proliferativeefectofmeloxi camandwnt/β cateninsignalincoloncancercels[j].chin PharmacolBul,2015,31(3): [21] 郭颖, 郭建华, 符航, 等. 青蒿琥酯对人大肠癌 Lovo 细胞侵袭影响的初步研究 [J]. 中国药理学通报,2016,32(1): [21]GuoY,GuoJH,FuH,etal.Preliminaryofresearchofartesu nateoninvasionofhumancoloncancerlovocels[j].chinphar macolbul,2016,32(1):60-3. Studyontherelationshipbetweenpromotingapoptosisefect ofartesunateandwnt/β cateninpathwayincoloncancercels GUOYing 1,TIANZhi yu 2,FUHang 3,SUNLi 4,LIUFang 4,LUOQiang 4,ZHANGLin xi 4 (1.DeptofPathology,2.MajorofClinicalMedicine,Grade2013,3.MajorofMedicalImage,Grade2012, 4.LifeScienceResearchCenter,HebeiNorthUniversity,ZhangjiakouHebei ,China) Abstract:Aim Toinvestigatethepromotingapoptosis efectofartesunate(art)onhumancoloncancerlovo celsanditsmechanisms.methods MTTasaywas performedtodeterminetheanti proliferativeefectof artesunate.flowcytometryasayandelectronmicros copy(em)wereusedtoevaluatetheapoptoticefectof artesunate.luciferasereporterasaywasintroducedto measurethe activation ofwnt/β catenin pathway. Westernblotwasusedtodetectthepathway related proteinlevelsofβ catenin,gsk 3β,c Mycandapop tosis relatedproteinlevelofcasepase 3.Results Comparedwiththecontrolgroup,theinhibitoryrateof celproliferationat72hand320μmol L -1 ARTwas (78 99±1 95)% (F= ,P=0 000);the celapoptoticrateat24hand160μmol L -1 ART was(19 00±0 05)% andmorphologicalsignsofcel apoptosiswerefoundbyem;thetranscriptionalactivi tyoftcf4/lefat24hand160μmol L -1 ARTwas (0 36±0 30)%(F= ,P<0 01);theex presionsofcaspase 3andGSK 3βweresignificantly increased,whileβ cateninandc Mycweresignificant lydecreasedwhentreatedwithdiferentconcentrations ofartfor48h(p<0 01).Conclusion ARTmay significantlyinhibitproliferationandpromoteapoptosis oflovocelsprobablybyinactivatingwnt/β catenin pathway. Keywords:artesunate;coloncancercels;prolifera tion;apoptosis;wnt/β cateninpathway;tcf4/lef

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