期 王曙逢 赵志浩 刘竹君 等 & 多不饱和脂肪酸对人胃腺癌细胞系 ' 的作用 % 多不饱和脂肪酸 /.!,2!-2"22, 59', 是指分子结构中含有两个或两个以上不饱和双键的直链脂肪酸 & 多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸 ' 和二十二碳六烯酸 ' 临床上它常被作为特殊的免疫营养素添加入营养

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'&!& 基础研究 多不饱和脂肪酸对人胃腺癌细胞系 的作用 王曙逢 赵志浩 刘竹君 王光辉 高 锟 李幼芬 西安交通大学 医学部第一附属医院普通外科 陕西西安 # 生命科学与技术学院 陕西西安 #$% 摘要 目的 探讨 & 多不饱和脂肪酸对人胃腺癌 ' 细胞生长增殖的作用和可能的机制 方法 以不同浓度梯度的 '' 作用于体外培养的 ' 细胞和人微血管内皮细胞 ()& 采用四甲基偶氮唑蓝 (** 观察细胞增殖抑制率 使用流式细胞仪检测细胞周期变化 采用 +","-./ 分析细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体 表达变化 结果 ' 和 ' 对胃腺癌 ' 细胞增殖具有明显抑制作用 该抑制作用呈现明显的剂量时间依赖效应的特点 在相同的浓度梯度下 ' 的抑制作用强于 ' 倒置显微镜下 ' 作用后观察到 ' 细胞明显皱缩 细胞的贴壁能力明显减弱 流式细胞仪检测显示 '' 干预后 ' 细胞的 0' 合成前期 期 细胞分布比例明显增加 0' 合成期 期 细胞分布比例明显减少 +","-./ 分析可见 ' 干预 ' 细胞 $ 和 $1 后 与对照组比较 ' 线粒体呼吸链膜蛋白复合体 表达灰度值显著下降 而且随着作用时间延长 复合体表达灰度值下降愈明显 ' 对人微血管内皮细胞的生长增殖 细胞形态和线粒体呼吸链膜蛋白复合体无明显影响 结论 & 多不饱和脂肪酸可选择性有效地抑制人胃腺癌 ' 细胞的生长增殖 该作用可能是通过阻滞 ' 细胞于 期和抑制 ' 细胞能量代谢来实现的 关键词 & 多不饱和脂肪酸 人胃腺癌细胞系 ' 中图分类号 # 文献标志码 ' #%!"#!$#%# #&%"'$&$#&" '!#"#$&#"$&" +'0!&" '&2/ 345!&! +'0!2&! '6! 347/!&" "2-8"/""-2.!-"-"9-,'.2"/,2.:;2 2// 5 "-,"2."")""-:;2 #//./3""" 2*" /./:;2 2// 5 "-,:;2 #$%)2 #" #" ####($") #&*###($" ###*!+, -" -"##"#".##" /*"###" +0&)#-")! "# &1-# -""#####&.#" )#. "%-"- )&/*"+0#"" )($#"""##"" && ) #/*-+0"##"&& ###-##") #"-"&1-# -" ($#"-/*"+0-"(("($#(( #"#"-#-#$"#"# &&)-"-/*$"$1#"-#.#" )#. " -) "#"& #/*-.)#.&&/*"## #")#.*!+, && 01## )-"####($&# ) #"-###((") )($#& () * " #" 01####($ 收稿日期 $&&1 修回日期 $&&# 通讯作者 王曙逢 副教授 & !"! 优先出版 "8,"2.%%%8.&&!"!

2 期 王曙逢 赵志浩 刘竹君 等 & 多不饱和脂肪酸对人胃腺癌细胞系 ' 的作用 % 多不饱和脂肪酸 /.!,2!-2"22, 59', 是指分子结构中含有两个或两个以上不饱和双键的直链脂肪酸 & 多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸 ' 和二十二碳六烯酸 ' 临床上它常被作为特殊的免疫营养素添加入营养支持配方中 用以提供热量 调控机体的免疫功能和炎性反 & 应 但是 近年来多不饱和脂肪酸代谢与恶性肿瘤发生发展的关系引人瞩目 有证据显示 & 多不饱和 $& &# 脂肪酸可抑制结肠癌 乳腺癌的发生发展 然 1&% 而 & 多不饱和脂肪酸与胃癌的关系研究较少 本研究以人胃癌细胞系 ' 作为研究对象 观察 & 多不饱和脂肪酸对其增殖和能量代谢的影响 并探讨可能的作用机制 为临床应用提供理论依据 + 材料与方法 ++ 实验材料 人胃腺癌细胞株 ' 由西安交通大学生命科学与技术学院提供 人微血管内皮细胞 ()& 由西安交通大学医学院病理系提供 新生胎牛血清 杭州四季青生物公司 (4$(( 培养基 赛默飞世尔生物化学制品有限公司 & 多不饱和脂肪酸 二十碳五烯酸 ' 分子式为 ) 分子量为 纯度 %% 二十二碳六烯酸 ' 分子式为 ) 分子量为 1 纯度为 %% 均购自美国 82 公司 线粒体呼吸链膜蛋白复合体 抗体 美国 4-/" 公司 (** 染色液 北京赛驰生物科技有限公司 9')) 2.!- 型流式细胞仪 美国 公司 ()&1'4) 型 ) 培养箱 日本三洋电机株式会社 +, 细胞培养 ' 常规培养于含有 833 胎牛血清并添加 4583 青霉素和 4583 链霉素的 (4$ 培养基中 ()& 培养于含有 833 胎牛血清 4583 青霉素和 4583 链霉素 (( 培养基中 置于 833) 和 # 的培养箱中贴壁培养 待细胞铺满瓶底后 用适量 3 胰酶消化细胞传代培养 取对数生长期的细胞进行实验 +-. 法检测细胞生长抑制率 收集对数生长期的 ' 和 ()& 细胞 用 3 胰酶消化后制成单细胞悬液 调整细胞密度为 < $ 83 接种于 % 孔培养板上 3 孔 置于 # 833 ) 的培养箱中贴壁培养 加入培养基 3 实验组细胞分别加入终浓度为 ##$ 83 的 ' 和 ' 每个浓度设置 个重复孔 对照组细胞加入等体积培养液 以无血清培养液作空白调零 平行培养 $$1# 后 各孔加入 3 的 (**3 继续培养 $ 后 吸尽孔内液体 各孔加入 3 ( 震荡 8 后 酶联免疫检测仪测 # 8 波长处每孔吸光度 ' 值 并计算细胞增殖抑制率 抑制率 => 实验组平均 ' 值 对照组平均 ' 值 < 实验重复 次 结果取平均值 +/ 细胞形态学观察 收集实验组经不同浓度梯度 ' 和 ' 干预处理的细胞和对照组细胞 于不同培养时间段 $$1# 倒置相差显微镜下观察细胞形态 +0 流式细胞仪细胞周期分析 培养细胞 待细胞贴壁 左右按实验不同分组加干预措施 收集细胞 制备单细胞悬液 -8 离心 8 洗涤细胞 重复 次 用 3 重悬细胞至 83 的试管中 以边滴加边振荡的方式缓慢加入 83#833 无水乙醇 细胞至少在 $ 固定 以 -8 或稍高的转速用 洗涤 次 加入 3 的碘化丙啶染液 含 02," 避光染色 8 后 加 83 振荡混匀后以 目尼龙网滤过 流式细胞仪 9'))2.!- 型 进行细胞周期分析 每份标本累计分析 个细胞 所得数据流式细胞仪自备软件处理 +-1 细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体 *$" 检测 收集实验不同分组 经干预处理不同时间段的 ' 细胞和 ()& 细胞 提取线粒体呼吸链膜蛋白复合体 &' 凝胶电泳分离蛋白后转膜 封闭 一抗分别为? 稀释的线粒体复合体蛋白 抗体 二抗为抗线粒体复合体抗体 4? 稀释 按操作说明染色 使用扫描仪扫描并保存图像 "$ 软件测得线粒体复合体蛋白条带的灰度值 进行统计学分析 + 统计学分析 所测得的数据用均数 A 标准差表示 应用 % 统计软件进行分析 多组均数比较采用单因素方差分析 以 为显著性检验水准 两两比较采用秩后检验 /,/*",, 以 为显著性检验水准, 结 果,-+ 和 对细胞生长增殖的影响 (** 法检测结果显示 以不同浓度梯度的 ' 和 ' 分别与胃癌 ' 细胞系共培养 $ 后与对照组细胞比较 ' 和 ' 对胃癌 ' 细胞增殖具有明显抑制作用 该抑制作用呈现剂量依赖效应的特点 在相同的浓度梯度下 ' 的抑制作用强于 ' 图!"!

3 % 西安交通大学学报 医学版 第 卷 相对于胃癌细胞 ' 而言 ' 对人微血管内皮细胞的增殖无明显影响 说明 ' 具有选择性抑制胃癌细胞生长的作用,-, 细胞形态学的变化 在无 ' 干预情况下 ' 在 (4&$ 培养基中生长形态饱满 异型性明显 贴壁良好 图 ' 而在 ' 干预处理后 倒置显微镜下观察 ' 细胞明显皱缩 部分细胞的贴壁能力明显减弱 细胞膜保持完整并可见突起出泡现象 细胞周围有数个圆形小体 凋亡小体 围绕 图 图 + 对 细胞的作用 9",/'2'/ '"., 相同浓度的 ' 与 ' 比较 不同浓度梯度的 ' 作用胃癌 ' 细胞 $ $1# 后与对照组细胞比较 随着作用时间延长 其增殖抑制作用逐渐增强 呈现明显的剂量时间依赖效应关系 图 ' 对人微血管内皮细胞的生长形态无明显影响 图 ), 细胞周期的变化 以 83 的 '' 分别作用于 ' 细胞 $1 后 用流式细胞仪对细胞周期再分布进行检测 结果显示与对照组比较 '' 可以使 ' 细胞的 0' 合成前期 期 细胞分布比例明显增加 0' 合成期 期 细胞分布比例明显减少 表 说明 '' 可 阻滞 ' 细胞于 期 且随着作用时间的延 长 细胞周期阻滞作用越明显 而 '' 对于 ()& 的细胞周期无明显影响 图 $ 表 + 干预后 的细胞周期分布 *2*""..",-!/ /'".,-"2" '2' 组别 & 期 & 期 ' 对照组 $A$ #%#A$ ' 干预 $ 组 %A1 $#1A 图, 不同浓度 对 细胞的生长活力的影响 9 ",/"-"/"-2/,/' / " -/."-2/ /'"., 与 $ 比较 ' 干预 $1 组 %A$ $%A ' 干预 $ 组 $1#$A A ' 干预 $1 组 1A$ $$#A1$ 与对照组比较 图 细胞形态学的改变 9*"8/-/./2.2",/"., ' 未加干预的 ' 细胞 ' 干预后的 ' 细胞 ) 未加干预的 ()& 细胞 ' 干预后的 ()& 细胞,/ 细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达的变化 ' 干预 ' 细胞 $ 和 $1 后 与对照组比较 ' 线粒体呼吸链膜蛋白复合体 表达灰度值显著下降 而且随着作用时间延长 复合体表达灰度值下降愈明显 而 ' 对 ()& 细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体 表达无明显影响 表 图 讨 论多不饱和脂肪酸是一类机体必需脂肪酸 人体内不能合成 主要依靠食物外源性摄入 除作为底物提供能量之外 它还具有广泛的生理活性 例如在维持!"!

4 期 王曙逢 赵志浩 刘竹君 等 & 多不饱和脂肪酸对人胃腺癌细胞系 ' 的作用 % 表, 干预后 细胞和.+ 细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达的灰度值 *2*""-",,/,/8//-2.-",-2/-8"8-2"-/" /8." 2 /'".,-"2"' 组 别 线粒体复合体蛋白 线粒体复合体蛋白 线粒体复合体蛋白 ' 对照组 1A %A% $%A$ ' 干预 $ 组 1%$1A# $$A## 1%1A%$ ' 干预 $1 组 #A1% A1 A$ ()& 对照组 11A 11A1 $1A1# ' 干预 $ 组 1%A#1 #1$#A1 A#$$ 与 ' 对照组比较 与 ()& 对照组比较 的种类和数量与恶性肿瘤的发生与发展密切相 & 关 研究发现 & 多不饱和脂肪酸对多种肿瘤有 明显的抑制作用 然而 & 多不饱和脂肪酸对于 人胃腺癌细胞系有何影响 相关的研究较少 本实验结果显示 ' 和 ' 分别对 ' 细 胞的生长增殖均有明显抑制作用 在相同的作用时 间下 随着 ' 和 ' 浓度梯度的增加 其增殖抑 制作用逐渐增强 即呈现明显剂量效应依赖关系 在 相同的浓度梯度下 ' 的抑制作用强于 ' 图 / 干预后.+ 细胞周期分布 9$*""..",-!/ /()&".,-"2" '2' 与对照组比较 图 0 干预后 细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体表达的变化 9 *""-",,/,/8//-2.-",-2/- 8"8& -2"-/" /8." 2 /'".,-"2" ' 细胞膜形态和调节细胞内信号通路方面发挥重要作 用 细胞膜中的多不饱和脂肪酸的含量直接决定细胞膜的结构 流动性和通透性 影响膜上磷脂双 分子中功能蛋白的构象和功能发挥 & 多不饱和脂肪酸主要来源于鱼油 是参与细胞膜磷脂构成的 & 重要结构脂肪酸 流行病学证据显示脂肪摄入 在相同的浓度梯度作用下 随着 ' 和 ' 作用时间延长 其增殖抑制作用越强 即呈现明显时间效应依赖关系 相比于 ' 细胞 ' 和 ' 对人微血管内皮细胞的增殖无明显影响 说明 ' 和 ' 具有选择性抑制胃癌细胞生长的作用 这就为临床应用 &59', 杀伤肿瘤细胞 同时又尽可能少地干扰机体正常的生理功能提供了理论依据 选用终质量浓度为 83 的 '' 分别作用于 ' 细胞 细胞形态学观察发现 ' 细胞体积缩小 部分细胞的贴壁能力明显减弱 细胞膜保持完整但形态不规则 细胞周围有数个圆形小体 凋亡小体 围绕 而对照组细胞生长形态饱满异型性明显 贴壁良好 ' 和 ' 对人微血管内皮细胞的生长形态无明显影响 流式细胞仪细胞周期分析结果显示 '' 分别干预 ' 之后 与对照组比较 ' 细胞周期分布发生明显改变 表现 期细胞分布比例明显增多 而 期细胞分布比例明显减少 说明 '' 可阻滞 ' 细胞于 期 且随着作用时间的延长 细胞周期阻滞作用越明显 而 '' 对于 ()& 的细胞周期无明显影响 由此可见 &59', 选择性抑制胃癌 ' 细胞生长增殖作用可能与其对细胞周期阻滞作用相关 线粒体作为细胞器 是细胞内的动力工厂 是进 $ 行氧化磷酸化能量代谢等生理过程的重要场所 线粒体内膜上存在 个重要的呼吸链膜蛋白功能复!"!

5 %$ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 合体 0'& 泛醌氧化还原酶 复合体 琥珀酸 & 泛醌氧化还原酶 复合体 泛醌 & 细胞色素 ) 还原酶 复合体 细胞色素 ) 氧化酶 复合体 '* 合成酶 复合体 目前 认为氧化呼吸链分为两条途径 一条是 0' 复合体 )/@ 复合体 复合体 复合体 '* 另一条是 琥珀酸 复合体 )/@ 复合体 复合体 复合体 '* 细胞通过此两条氧化呼吸链生成 '* 正常细胞能量的获取是使用葡萄糖在线粒体内进行有氧氧化磷酸化 然而肿瘤细胞能量代谢的特点表现在活跃地摄取葡萄糖 即使在氧供应充足的条件下 仍在胞质以低效率的糖酵解方式获取能量 称之为有 氧糖酵解 即 +'5 效应 研究发现有氧糖酵解对肿瘤细胞总 '* 的贡献一般不超过 # 因此 线粒体的氧化磷酸化仍然对肿瘤细 1&% 胞的能量需求有相当的贡献 本实验结果显示 ' 干预 ' 细胞 $ 和 $1 后 与对照组比较 ' 线粒体呼吸链膜蛋白复合体 表达灰度值显著下降 而且随着作用时间延长 膜蛋白复合体表达灰度值下降愈明显 这就提示 &59', 能抑制 ' 细胞线粒体呼吸链膜蛋白复合体 的表达 即分别抑制了氧化呼吸链两条入口途径和出口途径 进而影响 ' 细胞线粒体氧化磷酸化的功能 从而抑制 ' 细胞能量代谢 起到抑制肿瘤的作用 综上所述 & 多不饱和脂肪酸可选择性有效地抑制人胃腺癌 ' 细胞的生长增殖 该作用可能是通过阻滞 ' 细胞于 期和抑制 ' 细胞能量代谢来实现的 参考文献 '(! &2" #" "##&##!",1 ##& *!&2 " #"&3 0#4,($$#$& 韩东景 赵楠 薛永飞 等 & 多不饱和脂肪酸和谷氨酰胺对具有营养风险的晚期肺癌化疗患者的影响 & 郑州大学学报 医学版 $1$%& $(+$2!'2(,24$+20,!0&2 #"#"#### ) "-#"" )#&!,# ##& 王磊 & 多不饱和脂肪酸对结肠癌治疗作用机制的研究 /& 扬州大学 & /+ 24(+4!$+' 0&*-" )##"""# &3!,!"$$%& #,*+$ %244+$!+ (3+$$5,& "0" #"" )##!.#-#) &,#+"30%& 1! &1 #" ##6### &0+'0+'$ $11$%& % 尹勇 詹文华 彭俊生 等 & 多不饱和脂肪酸诱导人胃癌细胞凋亡的实验研究 & 中华胃肠外科杂志 ## #& *$*!22!&2 #""#&' 4$#$$1& $,*!7 (+,+4&#" #"&0"41$#$#& 3+48'!+/4/$,*+' 58&!" ##) #"&,# 1%##& (42$$2 ((%'2 1!4%+''2$&2 #"""##"#") # #&2."!", $$ #& $ 刘宗文 冯付明 王亚莉 等 & 食管鳞状细胞癌 + 细胞线料体 /' 及细胞凋亡检测 & 郑州大学学报 医学版 $# 11& $0+',+4!'',!+,1+!&# 1"# &+,#%$##1& 434( 2&2###&$## %%%$& #7 (005!&,#)# " #&3#34,$$% $& 1!24+'2$',*+7 442/4(+7+'48+7$! 4'*+4''/+7&+ )# &1+3$##$%$1& %1+44+4!&,#) )# " &+.!01%#1& 编辑 韩维栋!"!

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