40 美加明 (mecamylamine) 为 nachr 拮抗剂, 能阻碍乙酰胆碱 (acetylcholine, ACh) 或胆碱受体激动剂与 nachr 的结合, 从而拮抗胆碱作用美加明作为神经节阻断剂的常用药之一, 在神经系统中的作用研究已有较多报道 [7,8] 本研究以表 [9] 达 n

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藏羡巧
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1 肿瘤 2011 年 1 月第 31 卷第 1 期 Tumor Vol. 31, January, DOI: /j.issn Basic Research 基础研究美加明对人肺腺癌 A549 细胞增殖和迁移的影响马晓丽 1,2,3, 孙海基 3, 赵云 1,2, 汪运山 1,2 3, 安利国 1. 山东大学附属济南市中心医院医学实验诊断中心, 济南 ;2. 山东省肿瘤防治靶向分子研究重点实验室, 济南 ; 3. 山东师范大学生命科学学院生理学教研室, 济南 [ 摘要 ] 目的 : 探讨烟碱型胆碱能受体 (nicotinic acetylcholine receptor, nachr) 拮抗剂美加明对人肺腺癌 A549 细胞增殖和迁移的影响方法 : 应用磺酰罗丹明 B(sulforhodamine B, SRB) 法和 FCM 法检测美加明对人肺腺癌 A549 细胞增殖细胞周期和细胞凋亡的影响 ; 划痕实验检测美加明对细胞迁移能力的影响 ; 激光共聚焦显微镜下观察美加明对 A549 细胞 E- 钙黏蛋白 (E-cadherin, E-cad) 表达的影响结果 : 美加明可抑制 A549 细胞的增殖, 与对照组比较差异有统计学意义 (P <0.05), 并且其抑制作用随着药物浓度的增加而增强 FCM 检测结果显示, 美加明作用后,G 0 /G 1 期细胞比率增多,S 期和 G 2 /M 期细胞比率下降, 而细胞凋亡未发生明显变化划痕实验结果显示, 美加明可降低 A549 细胞的迁移能力激光共聚焦显微镜下观察发现, 美加明可上调 A549 细胞 E-cad 的表达结论 : 美加明可能通过阻滞细胞周期于 G 0 /G 1 期而抑制 A549 细胞增殖, 并通过上调 E-cad 的表达而降低细胞迁移 [ 关键词 ] 肺肿瘤 ; 美加明 ; 细胞, 培养的 ; 细胞增殖 ; 细胞运动 ; 烟碱型胆碱能受体 ; 细胞,A549 [ 中图分类号 ] R734.2 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2011) Effects of mecamylamine on cell proliferation and migration of human lung adenocarcinoma A549 cells MA Xiao-li 1,2,3, SUN Hai-ji 3, ZHAO Yun 1,2, WANG Yun-shan 1,2, AN Li-guo 3 1. Medical Laboratory Diagnostic Center,Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan , China; 2. Shandong Key Laboratory of Tumor Target Molecule,Jinan , China; 3. Department of Physiology, College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan , China [ABSTRACT] Objective: To study the effects of nicotinic acetylcholine receptor(nachr)antagonist mecamylamine on cell proliferation and migration of human lung cancer A549 cells. Methods: Sulforhodamine B(SRB)and flow cytometry(fcm)were used to detect the proliferation, cell cycle and apoptosis of A549 cells after treatment with mecamylamine. Wound healing test was used to measure the migration ability of A549 cells. The expression of E-cadherin(E-cad)was observed under a laser scanning confocal microscope. Results: Compared with negative control cells, the proliferation of A549 cells was inhibited by mecamylamine treatment in a dose-dependent manner (P <0.05). The percentage of G 0 /G 1 phase cells increased while the S and G 2 /M phase cells decreased after treating with mecamylamine. There was no change observed in cell apoptosis. The migration capacity of mecamylamine-treated cells was decreased compared with that of the negative control cells. The expression of E-cad was up-regulated in A549 cells treated with mecamylamine. Conclusion: Mecamylamine inhibits the cell proliferation and decreases the migration ability of A549 cells. These effects are related with blocking A549 cells into G 0 /G 1 phase and up-regulating E-cad expression. [KEY WORDS] Lung neoplasms; Mecamylamine; Cells, cultured; Cell proliferation; Cell movement; Nicotinic acetylcholine-receptor; Cell, A549 [Tumor,2011,31(1):39-43] 烟碱型乙酰胆碱受体 (nicotinic acetylcholine receptor, nachr) 属于配体门控离子通道超家族成员之一, 主要在神经系统中发挥作用, 最近的研究证实其在非神经系统中也有表达并发挥作用 [1] 研 [ 基金项目 ] 1. 中国博士后科学基金资助项目 ( 编号 : ) 2. 济南留学人员创业计划资助项目 ( 编号 : ) Correspondence to:sun Hai-ji ( 孙海基 ) sunhj5018@126.com 究发现,nAChR 在正常肺组织和肺癌细胞中的表达模式不同, 可能与肺癌的发生密切相关 [2] 基因组关联研究 (genome-wide association study, GWAS) 分析表明, 遗传因素影响肺癌的发生, 其中位于 15 号染色体长臂的 nachr 基因簇变异与肺癌发生密切相关, 并将 nachr 基因形象地称为肺癌基因 [3-6]

2 40 美加明 (mecamylamine) 为 nachr 拮抗剂, 能阻碍乙酰胆碱 (acetylcholine, ACh) 或胆碱受体激动剂与 nachr 的结合, 从而拮抗胆碱作用美加明作为神经节阻断剂的常用药之一, 在神经系统中的作用研究已有较多报道 [7,8] 本研究以表 [9] 达 nachr 的肺腺癌 A549 细胞为研究对象, 探讨 nachr 拮抗剂美加明对肺腺癌 A549 细胞增殖和迁移能力的影响, 为美加明的进一步开发利用提供实验依据 1 材料与方法 1.1 材料人肺腺癌 A549 细胞购自美国典型培养物保藏中心 (America Type Culture Collection, ATCC);RPMI 1640 培养液和胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ; 美加明和磺酰罗丹明 B (sulforhodamine B, SRB) 购自美国 Sigma 公司 1.2 细胞培养 A549 细胞用含有 10% 胎牛血清 100 u/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养液, 置于 37 CO 2 体积分数为 5% 的细胞培养箱中常规培养,2~3 d 传代 1 次, 加 0.1% 胰蛋白酶消化传代, 待细胞生长至 80% 融合时进行各项实验 1. 3 S RB 法检测美加明对细胞增殖能力的影响将处于对数生长期的 A549 细胞经消化后制成细胞悬液, 接种于 96 孔板内,100 μl( 个细胞 )/ 孔细胞培养 24 h 后, 加入不同浓度的美加明 ( 和 μmol/l)100 μl/ 孔, 每个药物浓度设 6 个复孔, 以不加美加明作为对照组 (RPMI 1640 培养液 ), 细胞继续培养 24 和 48 h; 加入 50% 三氯醋酸溶液 50 μl/ 孔固定细胞, 置于 4 冰箱 1 h; 用三蒸水洗涤干燥后, 加入 0.4% SRB 溶液 100 μl/ 孔, 于室温下放置 30 min; 弃去上清液, 用 1% 乙酸溶液洗涤 5 次 ; 干燥后加 10 mmol/l 三羟甲基胺基甲烷溶液 (ph=10.5) 溶解, 于平板振荡器上振荡 5 min; 在酶联免疫检测仪上检测波长为 515 nm 处各孔的吸光度 (D ) 值, 用空白对照孔调零按以下公式计算美加明对细胞的生长抑制率 : 细胞生长抑制率 =( 对照组 D 值实验组 D 值 )/ 对照组 D 值 100% 1.4 FCM 法检测美加明对细胞周期和细胞凋亡的影响消化美加明未处理组和 μmol/l 美加明作用 24 和 48 h 后的 A549 细胞, 用 PBS 洗涤 2 次, 制成细胞密度为 (1~5) 10 6 个 /ml 的细胞悬液, 加入 20 预冷的 80% 乙醇溶液, 置于 20 冰箱中固定过夜离心弃去固定液, 用 PBS 洗涤 2 次, 加 RNase 处理 ; 加碘化丙啶 4 避光染色 30 min 后, 上 FACS-Calibur 型流式细胞仪检测 A549 细胞的细胞周期和细胞凋亡情况, 每个样本获得个细胞 1.5 体外划痕实验检测美加明对细胞迁移能力的影响将细胞接种于 6 孔板中, 个细胞 / 孔, 用含 0.5% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液培养 48 h, 用无菌 200 μl 加样枪头于细胞层中纵向划一直线, 形成宽度均匀一致的无细胞区域, 造成培养细胞伤口模型 ; 用 PBS 洗净刮掉的细胞, 加入 500 μmol/l 美加明, 以不加美加明作为对照, 分别在培育 0 和 48 h 时, 于光学显微镜 ( 40) 下观察划痕的宽度, 实验重复 3 次, 取其平均值 1.6 激光共聚焦显微镜下观察美加明对 A549 细胞 E- 钙黏蛋白 (E-cadherin, E-cad) 表达的影响取美加明未作用 ( 对照组 ) 和 500 μmol/l 美加明作用 48 h 后的 A549 细胞做细胞爬片, 用 PBS 洗涤 2 次 ; 加 1% 多聚甲醛溶液, 固定细胞 30 min,pbs 洗涤 3 次 ; 加 0.5% 小牛血清 100 μl 覆盖细胞 10 min, 去除内源性非特异性蛋白,PBS 洗涤 2 次 ; 加稀释的鼠抗人 E-cad 单克隆抗体 (Santa Cruz 公司产品 ) 置于湿盒中室温培育 60 min;pbs 洗涤 1 次, 加入稀释的 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 二抗 (Santa Cruz 公司产品 ), 室温下避光培育 30 min 用 ACAS ULTIMA312 型激光共聚焦显微镜 ( 美国 Meridian 公司产品 ) 观察, 激光波长为 488 nm, 发射波长为 633 nm 黄绿色荧光代表 E-cad 表达, 蓝色荧光代表细胞核 DNA, 用荧光强度定性分析 E-cad 的表达水平 1.7 统计学方法应用 SPSS 11.5 软件进行统计分析各实验分别重复 3 次, 计量数据以 x ±s 表示, 两样本的组间比较采用 t 检验 P <0.05 为差异有统计学意义 2 结果马晓丽, 等. 美加明对人肺腺癌 A549 细胞增殖和迁移的影响 2.1 美加明对肺腺癌 A549 细胞的增殖抑制作用与不加美加明的对照组比较,300~600 μmol/l 美加明作用 A549 细胞 24 h 后, 各组细胞的增殖抑制率无明显差异 (P >0.05);700~1 000 μmol/l 美加明作用 A549 细胞 24 h 后, 各组间细胞的增殖抑制率有明显差异 (P <0.05) 300~1 000 μmol/l 美加明作用 A549 细胞 48 h 后, 各组细胞的增殖抑制率与不加美加明的对照组比较, 差异均有统计学意义 (P <0.05), 且随着美加明浓度的增加其对 A549 细胞的增殖抑制作用增强见表 1

3 马晓丽, 等. 美加明对人肺腺癌 A549 细胞增殖和迁移的影响 41 Table 1 表 1 美加明对肺癌 A549 细胞增殖的抑制作用 Inhibitory effects of mecamylamine on proliferation of lung cancer A549 cells Mecamylamine 24 h 48 h c B /(μmol L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± P <0.05, P <0.01, vs 0 μmol/l mecamylamine group D value Inhibitory rate/% D value Inhibitory rate/% (x ±s, n =3) 2.2 美加明对肺癌 A549 细胞周期和细胞凋亡的影响 FCM 检测结果显示, 与未处理组比较, 500 和 800 μmol/l 美加明作用 A549 细胞 24 和 48 h 后, sub-g 1 期细胞比率无明显变化,G 0 /G 1 期细胞比率显著升高,S 期和 G 2 /M 期细胞比率显著降低结果提示, 美加明作用可使细胞阻滞于 G 0 /G 1 期, 进入 S 期和 G 2 期的细胞减少, 细胞增殖受到抑制, 但对细胞凋亡无明显影响 ( 图 1 和表 2) A-C: Treatment for 24 h; D-F: Treatment for 48 h; A and D: 0 μmol/l mecamylamine as untreated control;b and E:500 μmol/l mecamylamine; C and F:800 μmol/l mecamylamine 图 1 FCM 检测美加明对肺癌 A549 细胞周期和细胞凋亡的影响 Fig.1 Effects of mecamylamine on cell cycle and apoptosis of lung cancer A549 cells detected by flow cytometry 2.3 美加明抑制肺癌 A549 细胞的迁移细胞划痕愈合实验结果显示,500 μmol/l 美加明作用 A549 细胞 48 h 后的划痕宽度大于美加明未处理对照组的划痕宽度,2 者间差异有统计学意义 (P < 0.05, 图 2), 表明美加明能降低 A549 细胞的迁移能力 2.4 美加明上调肺癌 A549 细胞 E-cad 的表达激光共聚焦显微镜下观察发现, 与对照组比较, 500 μmol/l 美加明作用肺癌 A549 细胞 48 h 后, 细胞膜上 E-cad 的荧光强度升高, 细胞质中荧光颗粒增加 ( 图 3) 结果提示, 美加明可以使肺癌 A549 细胞中 E-cad 的表达增加

42 马晓丽, 等. 美加明对人肺腺癌A549细胞增殖和迁移的影响 Table 2 Mecamylamine c B / μmol L 1 Sub-G1 0 0.23±0.13 500 0.41±0.06 800 0.51±0.

36 [(x ±s )/%, n =3)] 9.31±0.37 G2/M Sub-G1 G0/G1 25.37±1.02 0.30±0.10 61.42±1.98 15.44±0.47 0.67±0.02 78.81±1.71 20.07±0.88 0.38±0.08 S 14.37±0.77 G2/M 23.12±1.05 66.09±1.37 12.43±0.87 13.28±1.23 7.

4 42 马晓丽, 等. 美加明对人肺腺癌A549细胞增殖和迁移的影响 Table 2 Mecamylamine c B / μmol L 1 Sub-G ± ± ±0.07 表2 美加明对肺癌A549细胞周期和细胞凋亡的影响 Effects of mecamylamine on cell cycle and apoptosis of lung cancer A549 cells 24 h G0/G ± h S 15.56± ± ± ±1.36 [(x ±s )/%, n =3)] 9.31±0.37 G2/M Sub-G1 G0/G ± ± ± ± ± ± ± ±0.08 S 14.37±0.77 G2/M 23.12± ± ± ± ± ±1.07 P <0.05 vs 0 μmol/l mecamylamine group p <0.05, vs Untreated control group Fig.2 图2 美加明对肺癌A549细胞迁移能力的影响 40 Effects of mecamylamine on migration ability of lung cancer A549 cells 40 A: 0 μmol/l mecamylamine as untreated control; B: 500 μmol/l mecamylamine 激光共聚焦显微镜下观察美加明作用48 h 后对肺癌 A549细胞E-cad表达的影响( 400) Fig.3 Expression of E-cadherin protein in lung cancer A549 cells treated with mecamylamine for 48 h observed under a laser scanning confocal microscope( 400) 图3 3 讨论研究证实一些非神经细胞中有ACh及其相关分子的存在它们在多种肿瘤中通过自分泌和旁分泌通路参与细胞的生长调节与肿瘤的发生发展有关 [10-12] 近年来的分子流行病学研究表明 nachr 基因簇的变异与肺癌的发生密切相关 [3-6] 本研究应用不同浓度的nAChR拮抗剂美加明处理肺癌A549细胞后发现美加明能抑制A549 细胞的增殖这种抑制作用随着美加明浓度增加而增强其原因可能是美加明阻断了细胞自分泌的ACh与nAChR的结合导致肺癌细胞增殖受抑制本研究在预实验中发现较低浓度和200 μmol/l 的美加明对细胞增殖无明显的抑制作用而高浓度 300~ μmol/l 美加明作用48 h后 A549细胞的增殖受到明显抑制高浓度美加明是否可能由于药物毒性作用导致细胞凋亡而引起细胞数量的减少为探讨这一问题本研究进一步应用FCM 法检测发现 500和800 μmol/l美加明作用a549 后未引起细胞凋亡而是通过G 0 /G 1 期的细胞周期阻滞使进入S期和G 2 期的细胞减少从而使细胞增殖受到抑制已有研究表明 A549

5 马晓丽, 等. 美加明对人肺腺癌 A549 细胞增殖和迁移的影响 43 H1299 和 H1975 细胞表达不同亚型的 nachr [9,13] 本研究在预实验中比较了不同浓度美加明对这 3 株细胞增殖的影响, 发现其对 3 株细胞的增殖抑制趋势基本一致由于此 3 株均为非小细胞肺癌细胞, 因此本研究以 A549 细胞作为研究对象探讨美加明对其增殖和迁移的影响已有研究表明, A549 细胞表达 nachrα3 α4 α5 α7 α9 α10 β2 β3 和 β4 亚型 [12] 美加明通过与何种亚型结合而抑制细胞增殖, 及其究竟是作用哪条细胞内信号通路, 这些问题还有待进一步研究 E-cad 是介导细胞间黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白, 存在于正常上皮细胞中, 以维持正常上皮细胞的极性和分化, 是细胞与基质间黏附反应的重要媒介, 维持上皮结构及组织完整性, 其正常功能丢失或破坏与肿瘤的形成及转移有关 [14] E-cad 在恶性肿瘤的发生发展过程中有抗肿瘤转移的功能, 为抑制转移分子本研究结果显示, 与对照组比较, 经 500 μmol/l 美加明作用后,E-cad 在 A549 细胞膜和细胞质内的荧光强度增加, 表明美加明对 E-cad 的合成和分布起一定的调节作用美加明可能通过增加 E-cad 的合成而增加细胞之间的黏附作用, 抑制肺癌细胞的迁移 ; 这一推测与划痕愈合实验的结果一致总之, 本研究结果表明, 美加明可以抑制肺癌 A549 细胞的增殖和迁移, 为美加明在临床上用于肺癌的治疗提供了一定的实验依据 [ 参考文献 ] [1] MILLAR N S, GOTTI C. Diversity of vertebrate n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r s [ J ]. Neuropharmacology, 2009, 56(1): [2] L A M D C, G I R A R D L, R A M I R E Z R, e t a l. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subunit genes in non-small-cell lung cancer reveals differences between smokers and nonsmokers [J]. Cancer Res, 2007, 67(10): [3] AMOS C I, WU X, BRODERICK P, et al. Genomewide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1 [J]. Nat Genet, 2008, 40(5): [4] HUNG R J, McKAY J D, GABORIEAU V, et al. A susceptibility locus for lung cancer maps to nicotinic acetylcholine receptor subunit genes on 15q25 [J]. Nature, 2008, 452(7187): [5] THORGEIRSSON T E, GELLER F, SULEM P, et al. A variant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease [J]. Nature, 2008, 452(7187): [6] 郑霞, 李雪, 王一, 等. 乙酰胆碱受体亚单位 α 5 基因启动子区 -10 位 T/A 多态和肺癌易感性的关联分析 [J]. 肿瘤,2010, 30(8): [7] B A C H E R I, W U B, S H Y T L E D R, e t a l. Mecamylamine a nicotinic acetylcholine receptor antagonist with potential for the treatment of neuropsychiatric disorders [J]. Expert Opin Pharmacother, 2009, 10(16): [8] McKEE S A, WEINBERGER A H, HARRISON E L, et al. Effects of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine on ad-lib smoking behavior, topography, and nicotine levels in smokers with and without schizophrenia: a preliminary study [J]. Schizophr Res, 2009, 115(2/3): [9] PALEARI L, CESARIO A, FINI M, et al. alpha7- Nicotinic receptor antagonists at the beginning of a clinical era for NSCLC and mesothelioma? [J]. Drug Discov Today, 2009, 14(17/18): [10] EGLETON R D, BROWN K C, DASGUPTA P. Nicotinic acetylcholine receptors in cancer: multiple roles in proliferation and inhibition of apoptosis [J]. Trends Pharmacol Sci, 2008, 29(3): [11] SONG P, SEKHO H S, JIA Y, et al. Acetylcholine is synthesized by and acts as an autocrine growth factor for small cell lung carcinoma [J]. Cancer Res, 2003, 63(1): [12] TROMBINO S, BISIO A, CATASSI A, et al. Role of the non-neuronal human cholinergic system in lung cancer and mesothelioma: possibility of new therapeutic strategies [J]. Curr Med Chem Anticancer Agents, 2004, 4(6): [13] L A M D C, G I R A R D L, R A M I R E Z R, e t a l. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subunit genes in non-small-cell lung cancer reveals differences between smokers and nonsmokers [J]. Cancer Res, 2007, 67(10): [14] SALON C, LANTUEJOUL S, EYMIN B, et al. The E-cadherin-beta-catenin complex and its simplication in lung cancer progression and prognosis [J]. Future Oncol, 2005, 1(5): [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 本文编辑 ] 张毅

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

40 美加明 (mecamylamine) 为 nachr 拮抗剂, 能阻碍乙酰胆碱 (acetylcholine, ACh) 或胆碱受体激动剂与 nachr 的结合, 从而拮抗胆碱作用 美加明作为神经节阻断剂的常用药之一, 在神经系统中的作用研究已有较多报道 [7,8] 本研究以表 [9] 达 n

40 美加明 (mecamylamine) 为 nachr 拮抗剂, 能阻碍乙酰胆碱 (acetylcholine, ACh) 或胆碱受体激动剂与 nachr 的结合, 从而拮抗胆碱作用美加明作为神经节阻断剂的常用药之一, 在神经系统中的作用研究已有较多报道 [7,8] 本研究以表 [9] 达 n