90 学报 JChinaPharmUniv2015,46(1):89-93 第 46 卷 藤属植物中分离出的五环三萜类物质, 具有较强的抗炎 免疫抑制及抗肿瘤等药理活性 [2] 2006 年, 中科院武汉植物园与美国科学家联合证实了雷公藤红素的抗肿瘤机制 [3], 引发了对其抗肿瘤活性的研究热潮 有

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1 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2015,46(1): 雷公藤红素对白血病 HL 60 和 Jurkat 细胞增殖及凋亡的影响 张晓玲, 李爱萍, 环飞, 秦珩, 段金廒 ( 1 南京医科大学公共卫生学院, 南京 ; 2 南京医科大学江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心, 南京 ; 3 南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心, 南京 ) 摘要探讨雷公藤红素对人急性髓性白血病 HL 60 细胞 急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞增殖及凋亡的影响 采用 MTT 法 AnnexinV FITC/PI 双染法 PI 染色法 透射电镜观察不同浓度雷公藤红素作用于两种细胞后对其生长增殖 凋亡 周期及形态等方面的影响 结果表明雷公藤红素能显著抑制 HL 60 细胞 Jurkat 细胞的增殖, 降低其存活率 给药 24h 后, 半抑制浓度 (IC 50 ) 分别为 (0 46±1 05)μmol/L 和 (0 88±1 13)μmol/L 以剂量依赖方式诱导两种细胞凋亡, 细胞周期分布 G 1 期比例增加,S 期比例降低 (P<0 05), 且伴有典型的细胞凋亡形态学改变 雷公藤红素能显著抑制 HL 60 细胞 Jurkat 细胞的生长增殖, 并诱导细胞凋亡 关键词 雷公藤红素 ;HL 60 细胞 ;Jurkat 细胞 ; 凋亡 中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 (2015) doi: /j.isn Efectsofcelastrolontheproliferationandapoptosisofhumanleukemiacels HL 60andJurkat ZHANGXiaoling 1 牞 LIAiping 2 牞 HUANFei 3 牞 QINHeng 3 牞 DUANJin ao 4 1 SchoolofPublicHealth 牞 NanjingMedicalUniversity 牞 Nanjing 牷 2 SafetyAsesmentandResearchCenterforDrugs 牞 Pesticides andveterinarydrugsofjiangsuprovince 牞 NanjingMedicalUniversity 牞 Nanjing 牷 3 NationalandLocalColaborativeEnginer ingcenterofchinesemedicinalresourcesindustrializationandformulaeinnovativemedicine 牞 NanjingUniversityofChineseMedi cine 牞 Nanjing 牞 China Abstract TodeterminetheefectsofcelastrolontheproliferationandapoptosisofcellinesHL 60andJurkat inhumanleukemia Humanleukemiacellinesweretreatedwithcelastrolatdiferentconcentrations Theinhibi toryrateofcelproliferationwasdetectedbymttasay 牷 theapoptosisratewasdetectedbyannexinv FITC/PI doublestaining 牷 celcyclewasobservedbypistaining 牷 celmorphologywasobservedbytransmisionelectron microscope 牗 TEM 牘 Celproliferationwasinhibitedbycelastrol 牞 withic 50 of 牗 0 46±1 05 牘 μmol/land 牗 0 88± 1 13 牘 μmol/lat24h Celastrolinducedcelapoptosisinadose dependentmanner Thecelcycledistributionof G 1 phaserateincreased 牞 Sphaseratedecreased 牗 P<0 05 牘 withtypicalcelapoptosis inducedmorphological changes Resultsshowedthatcelastrolcouldsignificantlyinhibitcelproliferationandinduceapoptosisinhuman leukemiacellinesofhl 60andJurkat Keywords celastrol 牷 HL 60cel 牷 Jurkatcel 牷 apoptosis ThisstudywassupportedbythePriorityAcademicProgramDevelopmentofJiangsuHigherEducationInstitutions 雷公藤 (TripterygiumwilfordiHook f ) 系卫矛科雷公藤属木质藤本植物, 其味苦 有大毒, 具有活血通络 祛风除湿 消肿止痛等功效, 广泛应用于系 统性红斑狼疮 肾病综合征 类风湿性关节炎 器官移植排斥反应等疾病 [1] 雷公藤红素(celastrol, 结构式见图 1) 又名南蛇藤素, 是从雷公藤属及南蛇 收稿日期 通信作者 Tel: E mail:dja@njutcm edu cn 基金项目 江苏高校优势学科建设工程资助项目

2 90 学报 JChinaPharmUniv2015,46(1):89-93 第 46 卷 藤属植物中分离出的五环三萜类物质, 具有较强的抗炎 免疫抑制及抗肿瘤等药理活性 [2] 2006 年, 中科院武汉植物园与美国科学家联合证实了雷公藤红素的抗肿瘤机制 [3], 引发了对其抗肿瘤活性的研究热潮 有文献报道, 在体外较低剂量的雷公藤红素即可抑制多种肿瘤细胞的生长, 包括白血病 乳腺癌 肺癌 肝癌 胃癌 结肠癌 前列腺癌等相关肿瘤细胞 [4-6] 白血病是造血系统常见的恶性肿瘤, 目前治疗白血病的方法主要是化疗, 通过诱导白血病细胞凋亡, 是化疗药物作用的主要机制之一 本文以人急性髓性白血病 HL 60 细胞 急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞为研究对象, 采用 MTT 法 流式细胞术和透射电镜, 探讨雷公藤红素对两种白血病细胞的增殖和凋亡效应, 希望通过对雷公藤红素抗肿瘤机制的深入研究, 使雷公藤红素成为新的用于白血病治疗的有效药物 Figure1 Chemicalstructureofcelastrol 材料 1 1 药物与试剂雷公藤红素 ( 纯度大于 99%, 成都植标化纯技术有限公司 ), 使用前用 DMSO 配成母液, 临用前用细胞培养液配成所需浓度 ; 改良型 RPMI 1640 培养基 ( 美国 HyClone 公司 ); 胎牛血清 ( 浙江天杭生物科技有限公司 );AnnexinV FITC 细胞凋亡检测试剂盒,PI/RNase 染色液 ( 美国 BD 公司 );MTT 试剂盒 ( 美国 Sigma 公司 ); 柔红霉素 ( 美国 Phar macia&upjohn 公司 ) 1 2 仪器 TecnaiSpirit 透射电镜 ( 美国 FEI 公司 );FAC SCalibur 分析型流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 );Spec tramaxm2 酶标仪 ( 美国 MolecularDevices 公司 ); EclipseTS100 倒置荧光显微镜 ( 日本 Nikon 公司 ) 1 3 细胞系和培养条件两种白血病细胞系 (HL 60 Jurkat) 均购自中 国科学院上海生物化学与细胞生物学细胞库 细胞用含 10% 灭活胎牛血清的 RPMI 1640 培养基, 在 37,5%CO 2 及饱和湿度条件下培养 每 1~ 2 天传代 1 次, 培养至对数生长期, 供实验用 方法 2 1 MTT 法检测对细胞的生长抑制作用取对数生长期的 HL 60 Jurkat 两种细胞, 以每毫升 个细胞的密度分别接种于 96 孔板, 每孔加细胞悬液 100μL, 每组设 3 复孔 实验组分别加入不同浓度的雷公藤红素 (0 125,0 25,0 5, 1 0,2 0,4 0,8 0μmol/L) 对照组加入等体积 RPMI 1640 溶液, 另设空白组 ( 不加细胞 ) 作为凋零孔 药物分别作用 24,48h 后, 加入 5mg/mL MTT 试剂 20μL,37 继续孵育 4h,1000r/min 离心 10min, 弃上清液, 加入二甲基亚砜 (DMSO) 150μL, 低速振荡, 使甲瓒结晶完全溶解, 于酶标仪上测定 490nm 波长处的吸收度 计算细胞的生长抑制率及 IC 50 以上实验重复 3 次 2 2 AnnexinV FITC/PI 双标法检测细胞凋亡按试剂盒说明书进行操作, 设空白对照组 阳性对照组 (1 89μmol/L 柔红霉素 ) 和实验给药组 收集不同浓度雷公藤红素 (0 25,0 5,1 0μmol/L) 作用后的 HL 60 Jurkat 两种细胞及其对照组细胞, 用预冷的 PBS 洗涤, 将细胞混悬于 1 结合缓冲液 300μL 中, 依次加入 AnnexinV FITC PI 各 2 5μL, 混匀, 室温下避光反应 15min, 用流式细胞术检测细胞凋亡情况 2 3 PI 染色法检测细胞周期收集不同浓度雷公藤红素 (0 25,0 5,1 0 μmol/l) 处理后的 HL 60 Jurkat 两种细胞及其对照组细胞, 加预冷 75% 乙醇 -20 固定, 用 PBS 洗去固定液, 加入 PI/RNase 混合染料, 室温避光孵育 15min 混匀, 过 300 目筛网, 置流式管中检测细胞周期 2 4 透射电镜观察取 0 5μmol/L 雷公藤红素处理的 HL 60 细胞 1 0μmol/L 雷公藤红素处理的 Jurkat 细胞, 离心弃去上清, 沉淀用预冷的 PBS 洗涤 2 次,2 5% 戊二醛缓冲液 4 固定过夜, 常规后固定 脱水 包埋 聚合超薄切片 染色后用透射电子显微镜在观察其超微结构

3 第 46 卷第 1 期 张晓玲等 : 雷公藤红素对白血病 HL 60 和 Jurkat 细胞增殖及凋亡的影响 统计学分析所得结果均表示为 x±s, 珋应用 GraphPadPrism 5 统计软件进行分析, 指标比较采用 One wayano VA, 组间比较采用 Dunnet 检验,P<0 05 则认为差异具有统计学意义 结果 3 1 雷公藤红素对细胞增殖的影响由图 2 所示, 随着给药剂量和时间的增加, 雷 公藤红素对肿瘤细胞的生长抑制率显著上升, 呈一定的剂量 时间依赖关系 在给药 24h 后,HL 60 的 IC 50 为 (0 46±1 05)μmol/L,Jurkat 的 IC 50 为 (0 88±1 13)μmol/L; 给药 48h 后,HL 60 的 IC 50 为 (0 55±1 02)μmol/L,Jurkat 的 IC 50 为 (0 50± 1 12)μmol/L 由图可以看出, 随着给药剂量和时间的增加,24h 和 48h 对细胞的抑制率差异并不明显 因此, 后续实验均给药 24h 处理细胞 Figure2 InhibitoryefectsofvariousconcentrationsofcelastrolonHL 60cels(A)andJurkatcels(B)( 珋 x±s,n=6) 3 2 雷公藤红素对细胞凋亡的影响用 0 25,0 5,1 0μmol/L 雷公藤红素 1 89 μmol/l 柔红霉素分别处理 HL 60 和 Jurkat 细胞 24h 后, 收集细胞, 以 AnnexinV FITC/PI 染色, 采用流式细胞术检测细胞凋亡情况 结果如图 3 所示, 随着雷公藤红素浓度增加, 细胞凋亡率也随之增加,HL 60 细胞凋亡率 (%) 分别为 (10 20± 2 45) (43 53±1 88) 和 (98 77±0 44), 与空白对照组相比,0 5,1 0μmol/L 剂量组差异均有统计学意义 (P<0 0001);Jurkat 细胞凋亡率 (%) 分别为 (15 86±0 88) (26 26±4 16) 和 (44 87± 4 47), 与空白对照组相比,0 5,1 0μmol/L 剂量组差异均有统计学意义 (P<0 01,P<0 0001) 3 3 雷公藤红素对细胞周期的影响用 0 25,0 5,1 0μmol/L 雷公藤红素分别处理 HL 60 和 Jurkat 细胞 24h 后, 收集细胞,PI/RNase 混合染料染色, 流式细胞术检测细胞周期, 结果如图 4 所示 通过与对照组比较发现, 用 0 25,0 5,1 0 μmol/l 雷公藤红素分别处理的 HL 60 和 Jurkat 细胞,S 期细胞比率较对照组下降,G 1 期细胞比率较对照组增加, 两组比较, 有显著性差异 (P<0 01), 结果见表 1 上述数据表明雷公藤红素对 HL 60 和 Jurkat 细胞周期中的 G 1 期具有阻滞作用 3 4 细胞形态学观察结果正常 HL 60 Jurkat 细胞均呈较为均一的圆形或椭圆形, 细胞核 线粒体等细胞器清晰可见 用 0 5μmol/L 雷公藤红素处理 HL 60 细胞 1 0μmol/L 雷公藤红素处理 Jurkat 细胞, 1 89μmol/L 柔红霉素处理两种细胞,24h 后可见细胞体积变小, 细胞质浓缩 ; 凋亡的细胞核内染色质高度盘绕, 出现许多称为气穴现象的空泡结构 ; 细胞核的染色质高度凝聚 边缘化, 形成新月形等典型的细胞凋亡形态学改变, 部分细胞核内出现凋亡小体 ( 图 5) 讨论细胞增殖和 ( 或 ) 凋亡异常是导致肿瘤发生的最根本原因, 现已发现许多抗肿瘤药物能通过修复或改变细胞周期的检验点达到治疗作用 本实验以人急性髓性白血病 HL 60 细胞 急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞为实验材料, 研究雷公藤红素体外抗白血病的作用 经初步研究发现, 雷公藤红素能显著抑制人白血病细胞的生长增殖, 促进肿瘤细胞凋亡, 并阻滞细胞周期于 G 1 期 研究结果表明, 雷公藤红素通过诱导 HL 60 Jurkat 细胞凋亡发挥对肿瘤细胞的生长抑制作用, 具有浓

4 学报 JC P mu 第 卷 F A V PI HL A J B μm L 珋± P P F E HL A J B

5 第 卷第 期 张晓玲等 雷公藤红素对白血病 HL 和 J 细胞增殖及凋亡的影响 T Q w m 珋± G C C HL D μm L P J G S G S ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± P F M HL A J B 度和时间依赖性 同时透射电镜检测发现经雷公 m m w AKT m mm 藤红素处理的 HL J 细胞核固缩质凝聚 m w C R 边缘化核膜裂解出现凋亡小体 雷公藤红素抑 MYLYHY FL C w 制 HL J 细胞生长 诱导其凋亡的具体机制 P A C D HL 还不十分清楚 有待今后进一步研究 JE H m 中国实验血液学杂志 参考文献 MJ D MY H A mm mm m mt mw P m P AGYL SY H m A A M S K m DHS EKK m YH S mm q m m C E JC I Y HC DCQC C m C T G V m m w C R m P XYz Z J C S m AL MP m T C m T G V B mb R C mm L WPL SXT HZ R T C T H D 中 草 药 mw H R XQLJ M XL R m C JT C M P m 中 华中医药杂志 D HPLXPZ W R m C JP m T m 中国药理学与毒理学杂志 L RLS XYLX E m m C JE S 中华实验外科杂 志

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