第 期 韩剑翠等 新型 7 2 抑制剂联合 %8 #A 溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究 1 长和促使肿瘤细胞的凋亡 8 #A 基因在治疗人 ;% 结肠癌方面具有很好的抗肿瘤效果 然而 %8 #A 又有一定的局限性 因为要达到一定的治疗效果就需要增加病毒的使用剂量 但是由于腺病毒它本身会对细

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1 浙江理工大学学报 自然科学版 第 卷 第 期 年 月! "#$!%&$'!! #$! $ ( (#) ( 文章编号 %%% 新型 ", 抑制剂联合 "7 8" 溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究 韩剑翠 马步云 吴程雨 王毅刚 王世兵 = 浙江理工大学 ( 新元医学与生物技术研究所 =( 生命科学学院科研实验中心 杭州 1 摘 要 探究携带 8 #A 的溶瘤腺病毒 0%, 20%8 #A %8 #A 联合小分子药物新型 7 2 抑制剂 # #% 对人结肠癌细胞株 #937&3&% 生长的体外抑制效果 通过溶瘤病毒与药物联合 以期寻求较好的抗癌作用 实验采用 8&& 法检测 8A> 的 %8 #A 与不同剂量的 # #%*1 " - 联合处理人结肠癌细胞株 发现病毒与药物联合处理有促进肿瘤细胞凋亡的作用 %8 #A 8A> 与 # #%1 "- 联合处理 #93&% 细胞 发现联合作用具有很大程度上的时间依赖性 3$ * 染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡也显示 %8 #A 与 # #% 联合处理组的细胞凋亡现象比二者单独使用均具有显著差异 该研究初步证实了 %8 #A 与 # #% 联合具有互补作用 能有效地在体外抑制人结肠癌细胞的增殖 关键词 溶瘤腺病毒 # #% 结肠癌 抗癌作用 中图分类号 ;1 文献标志码 引 言 病毒是肿瘤特异性增殖型病毒 溶瘤病毒它缺少在正常细胞中复制所必需的基因 因此它可以特异性地在肿瘤细胞中复制 然而在正常细胞中却不复制 由此达到抑制肿瘤细胞增殖的作用 目前 关于溶瘤腺病毒的研究迅速发展 可以通过改造启动子或者删除非必须基因来达到较好的靶向效果 也有人用溶瘤腺病毒作为载体携带抗体或 % 治疗癌症 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士在 年首次正式提出了癌症的靶向基因 + 病毒治疗 & "! " % %*! ) 的概念 基于此概念 本实验采用 溶瘤腺病毒 因为它能够满足肿瘤基因 + 病毒治疗的两个需要元素 具有靶向性和有可插入外源 基因的位点 这为我们进一步开展肿瘤的靶向基因 + 病毒治疗提供了一个理想的平台 本实验采用的是锰超氧化物歧化酶基因 - " ).!0 0! - 8 #A 它是一种新型肿瘤抑制基因 属于超氧化物歧化酶 ).!00! - #A 家族 #A 家族是将超氧阴离子转化为过氧化氢的抗氧化酶 可以保护细胞免受过氧化氢损伤 是机体内的一系列抗氧化防御系统 8 #A 它作为细胞内重要的抗氧化酶 不但可以清除细胞内的活性氧 $!. " )$! A# 从而减少失衡或高浓度的 A# 的产生对细胞产生一系列的损伤 对蛋白和核酸的损伤所导致的细胞的变异包 括细胞的癌变和细胞的死亡 进而防止细胞癌变 实验证实 8 #A 基因具有防止正常细胞转化为肿瘤细胞的功能 并且可以抑制肿瘤细胞的快速生 收稿日期 *++ 基金项目 国家自然科学基金项目 1;1; 浙江省自然科学基金项目 :31 3* 浙江省科技计划项目 *7; 浙江理工大学科研启动基金项目 *1;%: 作者简介 韩剑翠 11+ 女 黑龙江林口人 硕士研究生 主要从事肿瘤的靶向基因 % 病毒治疗方面的研究 通信作者 王世兵,%-! < =/ (0($

2 第 期 韩剑翠等 新型 7 2 抑制剂联合 %8 #A 溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究 1 长和促使肿瘤细胞的凋亡 8 #A 基因在治疗人 ;% 结肠癌方面具有很好的抗肿瘤效果 然而 %8 #A 又有一定的局限性 因为要达到一定的治疗效果就需要增加病毒的使用剂量 但是由于腺病毒它本身会对细胞产生一定的伤害 所以高的病毒剂量会增加治疗的风险 要实现使用很少的病毒剂量又要达到很好的治疗效果 笔者认为可否将病毒与新型小分子药物进行联合治疗 研究发现其与某些抗肿瘤药物的机制很不相同 二者有可能存在协同性 将二者进行联合作用有可能进一步有助于肿瘤方面的研究 # #% 也称为 8#%1; 是一种新型 7 2 抑制剂 它可以有效地选择性抑制 ;7 2 %; 对于 # #% 的研究已有很多报道 它的抗肿瘤效果在多种细胞中都有很好的作 1 用 如结肠癌 乳腺癌 肺癌 该药已进入 临床一期实验阶段 无论是作用于实体瘤还是恶性胶质瘤细胞 甚至是肿瘤干细胞都都显示出很 好的抗肿瘤效果 并且与一般的抗肿瘤药物相比 其具有更高的选择性 并且作用于实体瘤时毒性很弱 较低的药物剂量便可达到很好的抗肿瘤效 * 果 然而此药物与病毒联合治疗的效果尚不清楚 本实验研究溶瘤腺病毒 %8 #A 与小分子药物 # #% 联合抑制人结肠癌细胞的抗癌作用 材料与方法 ( 材料 (( 药物及试剂腺病毒 %8 #A 由本实验室构建完成 # #% 购自 #,,72 公司 细胞培养用 8,8 及胎牛血清购自 > 7A 公司 (( 人结肠癌细胞株及培养人结肠癌细胞株 37&3&%#9 均为本实验室保存 细胞培养在含 4 # 的 8,8 培养基中 ; 7A 条件下恒温培养 每 0 传代 次 ( 方法 ((8&& 法检测细胞存活率将对数期生长的肿瘤细胞按每孔 个细胞植入 孔培养板中培养 每孔加入培养液的体积为 待细胞贴壁后 加入相应的病毒与药物 体积为 ; 7A 恒温培养箱中培养至指定的时间 每孔加入 -" - 的 8&&; 7A 培养 * 后 每孔加入 8#A 剧烈 震荡 -! 在酶标仪上测定 * - 波长处的吸光值 实验中设不加细胞的空白对照孔 按以下公式计算肿瘤细胞的存活率 肿瘤细胞存活率 E 处理组 A 值 空白组 A 值 对照组 A 值 空白组 A 值 ((9 = 检测溶瘤腺病毒 %8 #A 目的基因的表达 将 个肿瘤细胞铺于 孔板 每孔加入培养液的体积为 (- 待细胞贴壁后 按照要求分别加入 8A> 的病毒 终浓度为 1 " - 的 # #% 及加入 8A> 的病毒联合 1 " - 的 # #% 各 * 以不加病毒的细胞作为对照 在 ; 7A 恒温培养箱中培养 *1 后 用 * 预冷的 # 洗板两次 每孔加入 裂解液 冰上充分裂解 -! 后 收入离心管 变性 -! -! -! 将上清分装于 + 备用 用时直接溶解上样 将定量蛋白以每孔加入 " 总蛋白样加入 # #%, 电泳 电泳结束后按半干转膜法转膜 4 膜 的脱脂奶粉中封闭 一抗孵育 稀释 室温下于摇床孵育 & #& 洗膜 次 每次 -! 稀释 室温下摇床孵育 * -! & #& 洗膜 次 每次 -! 用 >%7A 扫膜仪扫膜 红外激光成像系统对待测蛋白进行分析 ((3$ * 染色检测细胞的凋亡将对数期的肿瘤细胞按 个 孔植入 孔培养板 每孔加入培养液的体积为 在 ; 7A 恒温培养箱中培养 待细胞贴壁后 用不同浓度的药物处理 37& 细胞 后 用 # 洗细胞两次 加入浓度为 -" - 的 3$ * 体积为 使 3$ * 的终浓度在 ( " - 之间 继续在 ; 7A 恒温培养箱中孵育 -! 然后在荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照 ((* 流式细胞仪检测细胞的凋亡接种 个肿瘤细胞铺于 孔板 每孔加入培养液的体积为 (- 待细胞贴壁后 按照要求分别加入 8A> 的病毒 终浓度为 1 " - 的 # #% 及加入 8A> 的病毒联合 1 " - 的 # #% 各 * 以不加病毒的细胞作为对照 在 ; 7A 恒温培养箱中培养 *1 后 用 # 洗细胞两次 收集细胞 参照.! > 双染细胞凋亡检测试剂盒操作说明 于流式细胞仪上

3 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 检测 ( 统计学分析使用,.$ 分析数据 用 ) 0( 作图 结果采用 0 检验 # 表示差异不显著 : ( 表示差异显著 用 表示 : ( 表示差异极显著 用 表示 结 果 ( 单独使用 # #% 对结肠癌细胞的存活率的影响 通过 8&& 法检测不同剂量的 # #% 对不同结肠癌细胞在不同时间的杀伤作用 结果如图 所示 图 显示 # #% 对人结肠癌细胞的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性 较低剂量的 # #% 就可以达到很好的抑制肿瘤细胞增殖的作用 同时 可以看出不同的结肠癌细胞对药物的敏感度不同 如图 所示 在 * 时 药物剂量为 " - # #% 对 37& 细胞和 #9 细胞作用效果稍差于 1 " - 的药物剂量 说明在短期内 细胞对较高的药物剂量具有一定的耐药性 因此 笔者进一步做了将病毒与不同的药物剂量联合处理不同的结肠癌细胞 毒联合分别感染 37&3&%#9 细胞 在 ; 后 检测其对人结肠癌细胞的存活率的影响 结果如图 所示 图 可见 # #% 与 % 8 #A 联合作用时 对三种结肠癌细胞的增殖均有明显的抑制作用 并且随着 # #% 药物浓度增加 对人结肠癌细胞的抗癌效果越好 在剂量为 " - 的 # #% 与 %8 #A 联合作用于 3&% 时 3&% 细胞存活率大约只有 左右 图 %8 #A 与 # #% 联合对人结肠癌细胞株的抑制率 ( 用 8A> 的溶瘤腺病毒与 1 " - 的 # #% 药物联合 在不同时间对 3&% 和 #9 细胞的抗癌作用 用 8A> 的溶瘤腺病毒与 1 " - 的 # #% 药物处理 3&% 细胞和 #9 细胞 **1; 和 后 8&& 检测不同时间联合处理对肿瘤细胞增殖的影响 结果如图 # #% 与 % 8 #A 联合作用 3&% 细胞 时 对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于单独使用病毒或药物 # #% 图 8&& 法检测 # #% 在不同时间不同剂量单独作用对人结肠癌细胞的抑制率 ( 不同剂量的 # #% 与 8A> 的 %8 #A 病毒联合作用于三种不同的结肠癌细胞 37& 3&%#9 的抗癌效果 以不同剂量的 # #% 与 8A> 的溶瘤腺病 图 %8 #A 与 # #% 联合作用不同时间对人结肠癌细胞增殖的影响

4 第 期 韩剑翠等 新型 7 2 抑制剂联合 %8 #A 溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究 与 %8 #A 联合作用于 #9 细胞 时 联合作用的效果明显高于单独使用药物或病毒 并且对 3&% 和 #9 细胞均呈现出随着时间的增加 作用效果越明显 说明病毒与药物联合具有明显的时间依赖性 (*9 = 检测溶瘤腺病毒 %8 #A 目的基因的表达 %8 #A # #% %8 #A 与 # #% 联合处理 37& 细胞 剂量分别为 8A>1 " - 以及 8A>D1 " - 设立加等量的 # 作为对照组 在 ; 7A 恒温培养箱中培养 *1 后 9 = 检测目的基因 8 #A 的表达 结果如图 * 图 * 显示 3 为内参蛋白 单独使用 %8 #A 处理 37& 细胞表达的 8 #A 比对照组和单独使用 # #% 的量都明显提高 并且 %8 #A 与 # #% 联合处理的表达量比任何一种也都明显提高 说明 %8 #A 与 # #% 联合可以增加 8 #A 的表达量 图 3$ * 观察细胞凋亡现象 药物剂量的提高 早期和晚期凋亡现象越明显 在药物剂量为 " - 时 早晚期凋亡共达到 左右 图 = 为统计学分析对照组与加药组出现明显差异 讨 论 图 *9 = 检测目的基因 8 #A 的表达 (3$ * 染色观察细胞凋亡通过染色 检测病毒及药物处理后细胞核的形态学变化及凋亡情况 如图 所示 # 处理的对照孔细胞没有发生形态学的变化 细胞密度大 并且均匀铺散开 基本没有细胞凋亡 然而病毒与药物处理组的细胞生长受到明显的抑制并且出现明显的细胞凋亡状态 发生凋亡的的细胞其细胞核染色质会发生明显凝集 固缩 并伴有凋亡小体出现 并且 随着药物剂量的升高 凋亡增多 ( 流式细胞术检测细胞凋亡 %8 #A 与不同剂量的 # #% *1 " - 联合处理 37& 细胞 设立加等量 # 的对照组 在 ; 7A 恒温培养箱中培养 *1 后 用不含, & 的胰酶收集细胞.! > 双染参见流式试剂盒检测细胞凋亡 图 图 显示 病毒与不同浓度的药物联合 所用药物浓度越高 早期和晚期凋亡都有增加 随着 随着科技的不断发展 治疗癌症的药物大批涌现 但药物的副作用及其抗癌效果都还很难预测 找到一种科学合理的治疗方法势在必行 本实验采用 %8 #A 与不同剂量的 # #% 联合作用于人结肠癌细胞株 实验证明二者的联合作用比单独使用病毒或单独使用药物效果均要显著 可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡 8&& 结果表明 单独使用药物处理人结肠癌细胞时 在一定范围内随着药物剂量的增加 药物对肿瘤细胞的增殖有抑制作用 但较高的药物剂量时 会降低对肿瘤细胞的抑制能力 然而 用病毒与药物联合处理人结肠癌细胞 随着药物剂量的增加 对肿瘤细胞的杀伤能力越强 并且 二者的联合具有时间依赖性 3$ * 染色观察发现 单独 # #% 或 %8 #A 处理的细胞只有很少凋亡现象出现 而药物联合组有明显的凋亡小体出现 并且有大量细胞发生凋亡 应用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡 验证发现与 8&& 结果符合 发现二者联合

5 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷 图 流式细胞术检测病毒与药物联合处理对 37& 细胞凋亡率的影响作用时 能有效地促进人结肠癌细胞发生凋亡 并且下理论基础 对临床实验也具有一定的参考价值 凋亡多发生于凋亡早期阶段 在本实验中 为了降低过高的病毒剂量可能会增加治疗的风险 采用较参考文献 低的病毒剂量与药物联合 这样既能降低各自的剂 4 0/'> (!$ 量 又能达到很高的抗肿瘤效果 然而 % 0!!-- = $!$ 0! 8 #A 联合 # #% 时 最佳协同作用的剂量以 $!$ $ $!! (> 7 $ * 1%*( 及具体的引起它们联合作用的机制仍有待进一步研 7 6 "26! : (A $!$ 0! % 究 并且笔者所用的 # #% 并不是具有广谱性.) 0! $ A%- "! 的抗癌药物 因为有研究表明它对某些细胞具有一 - $!! - $! - $ 定的耐药性 由于具有耐药性 有可能需加大药物的 -/ -!0(A $ *1%( 使用剂量 因此 # #% 对其他肿瘤细胞的治疗效 2!!$ $% />3 0 (& 果还有待进一步验证 本实验为以后的体内实验打 - "! "! 0!$!0" ) 0! )

6 第 期 韩剑翠等 新型 7 2 抑制剂联合 %8 #A 溶瘤腺病毒体外抑制人结肠癌细胞增殖的研究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祁瑞哲 纪 庆 张丽艳 等 ( 细胞周期抑制剂 # #% 对小鼠造血干细胞生物活性的影响研究 ( 中国实验血液学杂志 ;*%;*( 7 # $C,9 C (# #%! ) 0 $! 7 2; 0!!=! 0! " -0!! )! -) (7 $ 7- - $ **;%;( 下转第 1 页

7 1 浙 江 理 工 大 学 学 报 年 第 卷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责任编辑 许惠儿 上接第 页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责任编辑 许惠儿

流式细胞术临床应用的建议 作者 : 中华医学会检验医学分会, 卫生部临床检验中心, 中华检验医学杂志编辑委员会 作者单位 : 刊名 : 中华检验医学杂志 英文刊名 : Chinese Journal of Laboratory Medicine 年, 卷 ( 期 ): 2013,36(12) 本文链接 :http://d.g.wanfangdata.com.cn/periodical_zhyxjy201312003.aspx

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