2016药理封面大版

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盘羊
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1 1694 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Dec;32(12):1694~8 网络出版时间 : :14 网络出版地址 :htp:// dalbinol 通过 ROS/Dvl/GSK 3β/β catenin 信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制研究李飞龙 1, 巫鑫 2, 廖红波 2, 仇双利 1, 朱晓辉 2, 崔燎 2 1, 吴华 (1. 广东医科大学附属医院肿瘤中心,2. 广东天然药物研究与开发重点实验室, 广东湛江 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 中国图书分类号 :R284.1;R329.24;R329.25;R 摘要 : 目的探讨天然产物 dalbinol 对人结肠癌 HCT116 细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制方法采用 MTT 法检测 dalbinol 对人结肠癌 HCT116 细胞的增殖抑制作用 ; 利用 Hoechst33342 荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化 ; 应用流式细胞术检测细胞凋亡率和 ROS 水平 ; 通过 Western blot 法检测 Wnt/β catenin 信号通路及凋亡相关蛋白的表达情况结果 dalbinol 可抑制人结肠癌 HCT116 细胞的增殖, 且呈剂量和时间依赖性,24 48 和 72h 的 IC 50 分别为 (4 8±0 53) (2 5±0 43) 和 (0 6±0 22)μmol L -1 ;Ho echst33342 染色观察到细胞皱缩核固缩和染色质凝集等典型凋亡的形态学变化, 同时 dalbinol 可剂量依赖性地提高细胞凋亡率, 且能增加细胞内 ROS 水平 ;Westernblot 结果发现 dalbinol 通过下调抗凋亡蛋白 Bcl 2 和 Mcl 1 的表达水平, 上调促凋亡蛋白 Bax 和 Bim 的表达, 从而促进 cleavedcaspase 3 收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金青年基金资助项目 (No ); 广东省自然科学基金资助项目 (No2KZ16015G); 湛江市科技攻关计划项目基金资助项目 (No2014B01021) 作者简介 : 李飞龙 (1990-), 男, 硕士生, 研究方向 : 肿瘤的诊断治疗及预防学,E mail: @qq.com; 吴华 (1966-), 男, 硕士, 教授, 硕士生导师, 研究方向 : 肿瘤的诊断治疗及预防学, 通讯作者,E 和 cleavedparp 活化裂解, 进而诱导细胞凋亡 ; 此外,dalbi nol 通过抑制 Dvl 2 和 GSK3β(pS9) 的蛋白表达, 从而降低总的 β catenin 和胞核 β catenin 的表达, 但胞质 β catenin 无明显变化, 最终下调 Wnt/β catenin 通路下游靶蛋白 c Myc 和 Survivin 的表达水平结论 dalbinol 可抑制人结肠癌 HCT116 细胞增殖并诱导其凋亡, 其分子机制可能与提高细胞内 ROS 水平和抑制 Dvl/GSK 3β/β catenin 信号通路有关关键词 :dalbinol; 结肠癌 ;HCT116; 增殖 ; 凋亡 ;Wnt/β catenin 结肠癌是常见的恶性消化道肿瘤之一, 发病率和死亡率均位居恶性肿瘤前列, 使人类健康面临严重挑战 [1] 尽管结肠癌诊疗的技术和水平都有所提高, 但患者的 5 年生存率仍不理想 [2] 据统计, 1940~2014 年间, 超过 75% 的抗肿瘤药物直接来源于天然物质 [3] 因此, 从天然药物中寻找新型抗癌药物, 对改善结肠癌患者预后具有重要意义研究表明 [4], 结肠癌的发生发展与 Wnt/β catenin EG FR p53 MAPK Notch RhoA/ROCK 等多种信号通路有关, 其中 Wnt/β catenin 信号通路的异常激活被 [5] 认为是结肠癌的发生发展的关键事件 Tan 等研究发现, 通过抑制 Wnt/β catenin 信号通路的激活, 结肠癌细胞可发生增殖抑制和凋亡现象紫穗槐 (AmorphaFruticosa), 落叶灌木, 系豆科紫穗槐属, 其花和叶均可入药, 具有清热凉血止血和祛湿

2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Dec;32(12) 1695 消肿等药理作用, 中医主要用于湿疹痈肿和烧烫伤等病症 [6] dalbinol 是从紫穗槐中分离纯化的一种鱼藤酮类化合物 ( 结构见 Fig1A), 本课题组的前期研究发现, 该化合物在体外对 HCT116 细胞表现出显著的细胞毒性, 但其作用机制尚不明确因此, 本研究进一步观察 dalbinol 对人结肠癌 HCT116 细胞周期及凋亡的影响, 并分析 dalbinol 对 Wnt/β cate nin 信号通路的影响, 探讨 dalbinol 调控 Wnt/β cate nin 信号通路的可能机制, 为其后续开发与利用提供科学依据 1 材料与方法 1.1 材料细胞株人结肠癌 HCT116 细胞由本实验室保存主要试剂 dalbinol 由本课题组提取纯化并鉴定所得 [7] 胰蛋白酶 DMEM 培养基 ( 高糖型 ) 胎牛血清均购于美国 Hyclone 公司 ; 青霉素链霉素购自广州威佳科技有限公司 ;Hoechst33342 染色液活性氧检测试剂盒全蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ECL 化学发光液细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒均购于碧云天生物技术研究所 ;β actin 抗体购自北京义翘神州生物技术有限公司 ;β catenin 抗体购自英国 ABC 公司 ;PARP 抗体购自美国 Biolegend 公司 ; caspase 3 抗体购自美国 Proteintech 公司 ;Dvl 2 购于美国 SantaCruzBiotechnology 公司 GSK 3β 和 c Myc 抗体均购于美国 BD 公司 ;GSK 3β(pS9) Sur vivin Bcl 2 Bax Bim Mcl 1 和 Histone3 抗体均购于美国 CST 公司 ; 羊抗兔 IgG HRP 和羊抗鼠 IgG HRP 均购于北京中杉金桥生物技术有限公司 1.2 方法细胞培养用含 10% 胎牛血清和 1%(V/ V) 青 - 链霉素的高糖型 DMEM 培养基, 于 37 5% CO 2 条件下培养 HCT116 细胞, 按 1 4 隔天传代, 取对数生长期细胞进行实验 MTT 法检测细胞增殖抑制作用取对数生长期细胞接种于 96 孔板, 不同浓度的 dalbinol( μmol L -1 ) 分别作用 h 后, 每组设置 3 个复孔, 每孔加入 5g L -1 MTT10μL, 置孵箱继续培养 4h, 弃上清, 加入 200μLDMSO 溶液, 使用酶标仪在 570nm 波长处检测各孔吸光度值, 计算细胞存活率 Hoechst33342 荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化取对数生长期细胞接种于 6 孔板, 将 dalbinol 稀释成不同终浓度 ( μmol L -1 ) 进行加药, 每组设置 3 个复孔, 同时设置阴性对照组孵育 24h 后,PBS 洗 3 遍后每孔各加入 2 5mg L -1 Hoechst33342 染色液, 在 37 条件下孵育染色 5min, 用 PBS 洗 3 次倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化 AnnexinV FITC/PI 双染法测定细胞凋亡率取对数生长期细胞接种于 6 孔板, 质量浓度加药方式同项, 加药 24h 后收集细胞,PBS 洗涤 2 次, 将细胞重悬于 195μL 的 AnnexinV FITC 结合液中, 室温避光孵育 15min 后加入 5μLAnnexinV FITC 和 5μLPI, 混匀流式细胞仪检测细胞凋亡率细胞内 ROS 含量的检测取对数生长期细胞接种于 6 孔板, 质量浓度加药方式同项,dalbinol 处理 12h 后收集细胞, 将 DCFH DA 荧光探针按用无血清培养液稀释, 置 10 μmol L -1 DCFH DA 于培养箱中孵育 30min, 用无血清培养液洗涤细胞 3 次流式细胞仪测定细胞内活性氧含量 Westernblot 检测相关蛋白的表达将对数生长期细胞接种于 6 孔板中, 质量浓度加药方式同项, 加药 24h 后收集细胞, 提取各实验组细胞总蛋白核蛋白 BCA 法蛋白定量, 用 SDS PAGE 凝胶电泳分离蛋白质, 将分离后的蛋白质转移至 NC 膜上, 用 5% 脱脂奶粉室温封闭 2h,TBST 洗涤 10 min, 一抗 4 摇床过夜,TBST 洗涤 3 次, 每次 15 min,hrp 标记二抗室温孵育 2h,TBST 洗涤 3 次, 每次 15min, 最后在暗室进行化学发光显色和曝光 1.3 统计学分析所有实验结果均源自 3 次独立实验, 数据采用 x±s 珋表示, 采用 GraphPadPrism5 0 软件进行数据处理和分析 ; 应用 SPSS19 0 软件中的 ANOVA 分析进行统计分析 2 结果 2.1 dalbinol 对 HCT116 细胞增殖的影响 MTT 结果显示 (Fig1B), 与对照组相比, 作用和 72 h 时,dalbinol 可抑制 HCT116 细胞的增殖, 呈剂量和时间依赖性 (P<0 05),IC 50 分别为 (4 8±0 53) (2 5±0 43) 和 (0 6±0 22)μmol L dalbinol 对 HCT116 细胞凋亡的影响将 dal binol 按不同终浓度 ( μmol L -1 ) 处理 HCT116 细胞 24h 后,Hoechst33342 染色后可观察到部分细胞出现细胞皱缩核固缩核破碎等典型凋亡的形态学变化 (Fig2) 同时 AnnexinV FITC/PI 双染结果表明 (Fig3), 与阴性对照组相比,dalbinol 可

3 ６９６中国药理学通报ＣｈＰｈｍｇＢ２６Ｄ３２２浓度依赖性地增加ＨＣＴ６细胞凋亡率Ｐ５３ｄ对细胞内ＲＯＳ水平的影响ＤＣＦＨＤＡ检测结果表明Ｆｇ４ｄ按不同终浓度５２ μｍＬ作用２ｈ时与对照组相比ｄ可使ＨＣＴ６细胞内ＲＯＳ水平升高２ μｍＬｄ作用时细胞内ＲＯＳ水平最高达５５３并呈浓度依赖性Ｆｇ３ＥｄＨＣＴ６ＡＦｗｍＢＴｈｗｍｄｗｍｇｗｈｐｉＰ５ＦｇＳｄｄｄＨＣＴ６ＡＴｈＳｄＢＡｄＨＣＴ６Ｐ５Ｆｇ２ＭｈｇｈｇＦｇ４ＩＲＯＳｇｄＨＣＴ６ＨＣＴ６ｄｗｈｄＡ μｍＬＢ５μｍＬＣ μｍＬＤ２Ｌ μｍ４ｄ对ＨＣＴ６细胞中凋亡相关蛋白表达

4 中国药理学通报的影响ＣｈＰｈｍｇＢ２６Ｄ３２２６９７初步的作用机制表明Ｆｇ５不同终浓度５和２ μｍＬ的ｄ处理ＨＣＴ６细胞２４ｈ后促凋亡蛋白Ｂｘ和Ｂｍ的表达升高抗２和Ｍ的表达水平下降导致凋亡蛋白Ｂｄ３和ｄｐａｒｐ同时过度活化而总的３和ＰＡＲＰ变化趋势不明显Ｆｇ６ＥｘｄＷｈｗｄＨＣＴ６ β 关系更是密不可分据报道９的结肠癌都存在Ｗ信号通路中一个关键调控基因的突 β Ｆｇ５ＥｘｄｄＨＣＴ６变８因此抑制Ｗ信号是抑制结肠癌 β 细胞生长的重要靶点之一９开发针对Ｗ β 信号通路的抗癌药物已成为研究的热点大５ｄ对ＨＣＴ６细胞中Ｗ β 量研究表明经典模式下Ｗ信号通路中 β 信号通路相关蛋白表达的影响进一步的作用机制ＬＲＰ５６ＡＰＣＤＧＳＫ３β Ａｘ或者 β 等基研究表明Ｆｇ６ｄ可降低ＨＣＴ６细胞内总ＡＰＣＧＳＫ３β 的因的突变会抑制降解复合体Ａｘ的和胞核 β 蛋白表达尤以胞核 β 生成使 β 无法降解并在胞质内堆积后转入的下降为甚但对胞质 β 的表达无明显影细胞核引起核的 β 与转录因子ＴＣＦＬＥＦ形可降低Ｄ２ＧＳＫ９响此外ｄ成复合物从而激活相应的下游靶基因ＭＣＭ和Ｓ的蛋白表达总的ＧＳＫ３β蛋白表达Ｄ和Ｓ等最终导致结肠癌的发生和发展４无明显变化３讨论随着社会经济的发展尤其是饮食结构的改变目前结肠癌已上升为全球发病率最高的恶性肿瘤之一在过去几十年外科手术一直是结肠癌的主本实验Ｗ结果发现ｄ作用２４ｈ后ＨＣＴ６细胞中总的和胞核 β 的表达均下降尤以胞核 β 下降最为明显但胞质水平无明显变化这结果表明ｄ可 β 调控关键蛋白 β 的表达因此我们推测要治疗手段之一但在原发肿瘤出现明显症状之前ｄ可能通过下调Ｗ信号通路来抑 β 患者可能己经发生播散或远处转移另外约５病制ＨＣＴ６细胞的增殖另外Ｗ通路 β 例术后２年会出现复发和转移因此大多数结肠癌Ｍ和Ｓ表达均降低这结的下游靶蛋白患者都需要接受化疗由于外科手术治疗的局限调控果也进一步证实我们的推测为明确ｄ性放射治疗的剂量限制化疗药物的毒副作用以及Ｗ通路的具体机制我们还检测了影响 β 耐药性等因素影响结肠癌患者的预后仍不理２ＧＳＫ３β和ＧＳＫ降解复合体生成的相关蛋白Ｄ想２从天然药物资源中寻找具有抗肿瘤活性的９结果发现Ｄ２和ＧＳＫ９的表达药物是近年来抗结肠癌药物研究的热点之一３下降明显而ＧＳＫ３β的蛋白水平未见明显变化Ｗ信号通路的异常激活与许多癌 β 症的发生发展有着不可分割的联系其与结肠癌的上述结果表明ｄ可能通过抑制Ｄ２的表９的表达下降 β 达从而使失活型ＧＳＫ

5 1698 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Dec;32(12) catenin 磷酸化降解增多, 最终导致 Wnt/β catenin 通路的下游靶蛋白 c Myc 和 Survivin 表达下降总之,dalbinol 能明显抑制人结肠癌 HCT116 细胞增殖, 并诱导其凋亡, 其作用机制可能与细胞内 ROS 水平提高和抑制 Dvl/GSK 3β/β catenin 信号通路有关本实验仅探讨 dalbinol 对 HCT116 细胞的作用, 尚未在其它结肠癌细胞系中予以证实, 下一步本课题组将继续研究 dalbinol 对多种结肠癌细胞系中 Wnt/β catenin 通路的影响, 为其进一步开发提供科学依据 ( 致谢 : 本实验在广东医科大学广东天然药物研究与开发重点实验室完成, 感谢吴华教授和巫鑫博士以及各位老师的指导和帮助 ) 参考文献 [1] FavoritiP,CarboneG,GrecoM,etal.Worldwideburdenof colorectalcancer:areview[j].updatessurg,2016,68(1):7-11. [2] MerlaA,GoelS.Noveldrugstargetingtheepidermalgrowthfactor receptoranditsdownstreampathwaysinthetreatmentofcolorectal cancer:asystematicreview[j].chemotherrespract,2012, 2012: [3] NewmanDJ,CraggGM.Naturalproductsassourcesofnewdrugs from1981to2014[j].jnatprod,2016,79(3): [4] PerkinsG,Laurent PuigP.Colorectalcancerbiology[J].Rev Prat,2015,65(6): [5] TanBL,EsaNM,RahmanHS,etal.Brewers riceinduces apoptosisinazoxymethane inducedcoloncarcinogenesisinratsvia suppresionofcelproliferationandthewntsignalingpathway [J].BMCComplementAlternMed,2014,14:304. [6] 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草 [M]: 第 10 卷. 上海 : 上海科学技术出版社,2004:328. [6] ChineseherbalismeditorialboardofstateadministrationofTCM, Chineseherbalism[M]:Volume10.Shanghai:ShanghaiScientific andtechnicalpublishers,2004:328. [7] WuX,LiaoH B,LiGQ,etal.Cytotoxicrotenoidglycosides fromtheseedsofamorphafruticosa[j].fitoterapia,2015,100: [8] WengW,FengJ,QinH,etal.Moleculartherapyofcolorectal cancer:progresandfuturedirections[j].intjcancer,2015, 136(3): [9] 袁霜雪, 王东旭, 伍秋香, 等. 白藜芦醇抑制 HCT116 结肠癌细胞增殖与 Wnt/β catenin 的关系研究 [J]. 中国药理学通报,2015,31(4): [9] YuanSX,WangDX,WuQX,etal.Studyontherelationship betweenanti proliferationefectofresveratrolonhct116colon cancercelsand Wnt/β catenin[j]. Chin PharmacolBul, 2015,31(4): [10] ZhangX,HaoJ.Developmentofanticanceragentstargetingthe Wnt/beta cateninsignaling[j].amjcancerres,2015,5(8): dalbinolinducesapoptosisofhumancoloncancercels throughros/dvl/gsk 3β/β cateninpathway LIFei long 1,WUXin 2,LIAOHong bo 2,QIUShuang li 1,ZHUXiao hui 2,CUILiao 2,WUHua 1 (1.CancerCenter,theAfiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,ZhanjiangGuangdong ,China;2.Guangdong KeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs,GuangdongMedicalUniversity,ZhanjiangGuangdong ,China) Abstract:Aim Toinvestigatetheefectsofdalbinol onproliferationandapoptosisofhumancoloncancer HCT116celsanditsmechanisms.Methods Anti proliferativeefectofdalbinolwasevaluatedbymtt asay.themorphologicalchangesofapoptosiswere observedbyhoechst33342staining.apoptoticrateand ROSgenerationwereanalyzedbyflowcytometry.The relatedproteinsofwnt/β cateninpathwayandtheap optosis asociatedproteinsexpresionweremeasured bywesternblot.results ThegrowthofHCT116 treatedwithdalbinolwasinhibitedinadoseandtime dependentmannerwithic 50 (4 8±0 53),(2 5± 0 43)and(0 6±0 22)μmol L -1 at24,48and72 h,respectively.typicalmorphologicalchangesofap optosissuchascelshrinkage,karyopyknosisandnu clearcondensation were observed by Hoechst33342 staining.meanwhile,theapoptoticrateandintracelu larros generation ofdalbinolwereboth increased dose dependently.western blotresultsshowed that dalbinolcould activate the expresion ofcleaved Caspase 3andcleavedPARPbydecreasinganti apop toticproteinlevelssuchasbcl 2andMcl 1andin creasingpro apoptoticproteinlevelssuchasbaxand Bim,whichinducedfurtherapoptosis.Moreover,dal binolcanreducetheproteinexpresionofthetotaland nuclearβ catenin,butnotcytoplasmicβ cateninby suppresingtheproteinexpresionofdvl 2andGSK 3β(pS9),aswelasitstargetproteinsc MycandSur vivin.conclusion dalbinolcaninduceapoptosisin coloncancerhct116celsbyupregulatingtheintra celularrosgenerationandsuppresingdvl/gsk 3β/ β cateninpathway. Keywords:dalbinol;coloncancercels;HCT116; proliferation;apoptosis;wnt/β catenin

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot