2018 年 3 月第 20 卷第 3 期 ModChinMed Mar 2018 Vol 20 No 3 南五味子 (SchisandraeSphenantheraeFructus) 为木兰科多年生藤本植物华中五味子 Schisandra sphenantherarehd etwils 的干燥成熟

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1 年 月 第 卷 第 期 M C M M V N 基础研究 基于 HPLC指纹图谱及多元功效成分定量分析的 南五味子药材质量标准提升研究 马新飞 郭盛 朱邵晴 朱振华 曹雅琦 王雪华 段金廒! 南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室 中药资源产业化与方剂 创新药物国家地方联合工程研究中心 江苏 南京 摘要 目的 建立不同产地南五味子药材 HPLC指纹图谱及多元功效成分定量分析方法 为南五味子药材质 甲酸水为流动相 梯度洗脱 建立南五味子药材指纹图 量标准提升提供支撑 方法 采用 HPLC 以乙腈 谱 并以 个木脂素类成分为测定指标建立南五味子药材含量测定方法 结果 建立了南五味子药材 HPLC指纹图 谱 标定了 个共有峰 并鉴定了其中 个峰 各样品图谱与对照图谱相似度均大于 所测定的 个成分在 测定浓度范围内线性关系良好 平均加样回收率为 R D均小于 结论 南五味子药材的指 纹图谱特征性和专属性强 结合木脂素类成分的测定 可为全面控制南五味子药材的质量提供科学方法 关键词 南五味子 HPLC 指纹图谱 定量分析 质量标准 Q F B HPLC F m M I D m MAX GUO ZHU q ZHUZ CAOY q WANGX DUANJ J C I C C M R I A m T C M K L C M R R U N L C E C C M R I F m I M N U C M N C A O T HPLC m m m m F F m m q M HPLCm w m F m w m w A m m m m m w w m R HPLC Fw w mm m T m m m m m w w T m m x m w w R D C T m m T HPLC m m q F K w F HPLC F Q Q 基金项目 国家公益性行业科研专项 江苏省产学研合作前瞻性联合研究项目 BY 江苏省 高校中药学优势学科 I I期建设项目 x 通信作者 段金廒 教授 博士生导师 中国自然资源学会中药及天然药物资源研究专业委员会主任委员 中国中药协 会中 药 资 源 循 环 利 用 专 业 委 员 会 主 任 委 员 研 究 方 向 中 药 资 源 化 学 与 资 源 循 环 利 用 T E m m

2 2018 年 3 月第 20 卷第 3 期 ModChinMed Mar 2018 Vol 20 No 3 南五味子 (SchisandraeSphenantheraeFructus) 为木兰科多年生藤本植物华中五味子 Schisandra sphenantherarehd etwils 的干燥成熟果实, 具有收敛固涩 益气生津 补肾宁心之功效, 主要用于久嗽虚喘 遗梦滑精 遗尿尿频 久泻不止 自汗 盗汗 津伤口渴 内热消渴及心悸失眠等症的治疗 [1] 现代研究表明, 南五味子中含有木脂素类 黄酮类 有机酸类 核苷类 氨基酸等多种类型化学成分 [2 4], 其中木脂素类成分具有调节中枢神经系统功能 降低谷丙转氨酶 抗炎 抗氧化 抗肿瘤等多重药理作用, 目前认为是南五味子传统功效发挥的主要效应成分之一 [5] 有关南五味子药材质量标准, 中华人民共和国药典 2015 年版仅以五味子酯甲作为质量控制指标 [1], 这种传统的单一指标质量控制模式, 难以反映药材的真实质量 HPLC 指纹图谱因其蕴含各色谱峰的出峰顺序 保留时间 峰高 峰面积等综合信息, 已成为中药整体性化学特征表征的有效方法, 具有较好的专属性和适用性 [6 7] 本研究在参考相关文献的基础上, 采用 HPLC 对不同产地 12 批次南五味子药材进行研究, 初步建立了南五味子药材的 HPLC 指纹图谱, 并在此基础上建立同时测定五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五味子酯乙 五味子酚 安五脂素 五味子甲素含量的 HPLC 方法, 以期为南五味子药材质量标准的提升提供参考 1 仪器与试剂 1 1 仪器 Waters2695Aliance 高效液相色谱系统 Waters 2998PDA 检测器 EmpowerTM 色谱工作站软件 (Waters 公司 );BT125 型电子天平 ( 赛多利斯科学仪器有限公司 );Microfuge16 型台式微量离心机 ( 美国 BeckmanCoulter 公司 );KQ 500DE 型数控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ) 1 2 试剂与样品乙腈 ( 色谱纯, 美国 Tedia 公司 ), 甲酸 ( 色谱纯, 德国 Merck 公司 ), 去离子水为经 Milipore 超纯水制备系统自制 ; 其他化学试剂均为分析纯 对照品五味子甲素 五味子乙素 五味子丙素 五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五味子酯乙 五味子酚 安五脂素 ( 四川省维克奇生物科技有限公司 ), 经 HPLC 分析, 纯度 98% 12 批南五味子药 294 材收集于陕西 湖北 河南 山西, 经南京中医药大学段金廒教授鉴定为华中五味子 Schisandra sphenantherarehd etwils 的干燥成熟果实, 样品信息见表 1 表 1 南五味子药材样品信息 样品编号 产地 S01 陕西省商洛市丹凤县 S02 陕西省商洛市山阳县板岩真北沟寺村 S03 陕西省商洛市柞水县营盘镇药王堂村 S04 陕西省商洛市柞水县 S05 湖北省十堰市勋阳开发区二道坡村 S06 湖北省襄阳市 S07 河南省洛阳市洛宁县 S08 河南省洛阳市栾川县 S09 河南省南阳市内乡县 S10 河南省南阳市西峡县 S11 山西西省晋城市城阳县 S12 山西省运城市 2 方法与结果 2 1 色谱条件色谱柱为 Altima TM C 18 (250 mm 4 6 mm, 5μm); 柱温 :25 ; 进样体积 :10μL; 流动相 : 乙腈 -0 1% 甲酸水, 按表 2 所示梯度程序洗脱 ; 检测波长 :254nm 对照品色谱图见图 1 表 2 南五味子中 7 个木脂素类成分含量测定的流动相梯度洗脱程序 t/min 流量 /ml min -1 乙腈 (%) 0 1% 甲酸水 (%) 溶液制备 对照品溶液的制备精密称取各对照品适量, 置于 10mL 量瓶中, 加甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 制成分别含五味子甲素 mg ml -1 五味子酯甲 mg ml -1 五味子酯乙 mg ml -1

3 年 月 第 卷 第 期 五 味 子 醇 甲 m ml 五 味 子 醇 乙 m ml 安五脂素 m ml 五 味子酚 m ml 的混合对照品溶液 M C M M V N 指纹图谱相似度评价系统 A 进行数据分析 处理 剪切 m 前的溶剂峰以及 m 后的杂质 峰 以 为参照图谱 设定时间漂移值 采用 中位数法谱峰自动匹配 生成南五味子药材指纹图 谱共有模式 即对照图谱 见图 将该对照图谱 R 的相似度值定为 计算 批次不同产地南五 味子药材样品指纹图谱的相似度 结果显示其相似 度均大于 见表 说明相似度良好 见图 注 五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五味 五味子酚 安五脂素 五味子甲素 子酯乙 图 木脂素类混合对照品溶液 HPLC图 供试品溶液的制备 取南五味 子 药 材 适 量 粉碎 过三 号 筛 取 粉 末 约 精 密 称 定 置 ml具塞锥形瓶中 精密加入甲醇 ml 称定重 量 超声处理 m W H 放冷 称定 注 五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五 五味子酚 安五脂素 五味子甲素 味子酯乙 图 南五味子药材指纹图谱共有模式 重量 用甲醇补足减失的重量 摇匀 μm滤 膜滤过 取续滤液 即得 HPLC指纹图谱研究 精密度试验 精密吸取同一供试品 溶 液 按 项下色谱条件连续进样 次 记录色图 谱 以 号峰 五味子酚 为参照峰 计算 次进样 的各共有峰的相对保留时间的 RD 相对峰 面积的 R D 表明仪器精密度良好 重复性试验 取同一供试品 CD 药材粉末 份 精密称定 按 项下方法制备供试品溶 液 按 项下色谱条件分别进样测定 记录色谱 图 以 号峰 五味子酚 为参照峰 计算 份样品 图 不同产地南五味子药材指纹图谱 表 批不同产地南五味子药材指纹图谱相似度计算结果 图谱序号 相似度 储藏 按 项下色谱条件分别于 进样测定 记录色谱图 以 号峰 五味子酚 为参照 峰 计 算 各 共 有 峰 相 对 保 留 时 间 的 RD 相对峰面积的 RD 表明供试品溶 液在 内测定稳定 各共有峰相对保留时间的 R D 相对峰面积 的 R D 表明该实验方法重复性良好 稳定性试验 取同一供试品 溶液 室温 指纹图谱共有模式的建立 取不同来源的南 精密称定 按 项下方 五味子药材粉末 法制备供试品溶液 按 项下色谱条件测定 记 录 m 色谱图 采用国家药典委员会 中药色谱 注 图谱序号同表 样品编号

4 2018 年 3 月第 20 卷第 3 期 ModChinMed Mar 2018 Vol 20 No 共有指纹峰的标定以 12 批南五味子药材指纹图谱与生成的对照图谱进行色谱峰匹配, 以匹配数目达 12 者作为共有峰, 结合对照品图谱进行指纹峰的标定 ( 见图 1); 以 20 号峰 ( 五味子酚 ) 为参照峰, 计算共有峰的相对保留时间 相对峰面积 结果显示 :12 批南五味子药材共有峰数目为 28, 经计算, 所有共有峰面积之和占总峰面积的 80% 以上 ; 12 批样品色谱共有指纹峰相对保留时间的 值均小于 1 2%, 相对峰面积的 值差异较大, 表明样品之间各共有峰组成差异显著 经与对照品紫外光谱及保留时间比对, 鉴定出峰 分别为五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五味子酯乙 五味子酚 安五脂素 五味子甲素 个木脂素类成分的测定 线性关系考察取对照品加甲醇配制并稀释成系列不同浓度混合对照品溶液, 按 2 1 项下色谱条件, 分别进样 10μL, 记录各化合物峰面积 以各对照品质量浓度 (mg ml -1 ) 为横坐标 X, 峰面积为纵坐标 Y, 绘制标准曲线, 得线性回归方程, 见表 4 表 4 南五味子中 7 个木脂素类成分线性关系考察结果 化合物线性方程 r 五味子醇甲 Y = X 五味子醇乙 Y= X 线性范围 / mg ml ~ ~0 105 五味子酯甲 Y= X ~1 09 五味子酯乙 Y= X ~1 06 五味子酚 Y= X ~1 04 安五脂素 Y= X ~1 08 五味子甲素 Y = X ~ 精密度试验取同一混合对照品溶液, 按 2 1 项下色谱条件连续进样 6 次, 记录各化合物峰面积, 考察仪器精密度, 结果见表 5 各化合物峰面积 值均小于 2 0%, 表明仪器精密度良好 重复性试验取同一批次 (S01) 药材粉末 6 份, 按 项下方法制备供试品溶液, 按 2 1 项下色谱条件分别进样测定, 记录各化合物峰面积, 计算 6 份样品中 7 个成分含量的 值 结果见表 5 各待测成分含量的 值均小于 2 7%, 表明该方法重复性良好 稳定性试验 取 项下制备的供试品溶液 1 份, 室温储藏, 按 2 1 项下色谱条件分别于 h 进样测定, 记录峰面积, 计算峰面积的 值, 考察供试品溶液的稳定性, 结果见表 5, 化合物峰面积的 值均小于 3 0%, 表明供试品溶液稳定性良好 加样回收试验取 项下已知含量的样品 (S01) 粉末 9 份, 每份 0 5g, 精密称定, 分别精密加入对照品适量 ( 加入量分别为基础值的 80% 100% 120%), 按 项下方法制备供试品溶液, 按 2 1 项下色谱条件分别进样测定, 计算各待测成分含量, 计算加样回收率, 结果见表 5 表 5 木脂素类成分的精密度 重复性 稳定性及加样回收率试验结果 % 对照品 精密度 重复性 稳定性 加样回收率 平均值 五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五味子酯乙 五味子酚 安五脂素 五味子甲素 样品测定 取不同产地南五味子药材样品, 按 项下方法制备供试品溶液, 按 2 1 项下色谱条件进样测定, 记录峰面积, 以外标一点法计算样品中各待测成分的含量, 结果见表 6 南五味子药材样品中, 以五味子甲素含量最高, 平均质量分数可达 7 889mg g -1, 安五脂素 五味子酯甲含量其次, 平均质量分数分别为 mg g -1, 五味子醇甲 五味子醇乙含量相对较低 ;7 个木脂素类成分平均总质量分数达 22 09mg g -1 ; 不同产地样品间木脂素类成分差异较大, 其中五味子醇甲含量差异最大, 值达 86 41%; 不同产地南五味子药材中, 河南洛阳所产南五味子药材含木脂素类成分总量最高, 陕西商洛平均总量显著低较低, 山西运城所产者最低 3 讨论 本研究在建立南五味子药材指纹图谱过程中, 分别考察了样品提取溶剂 流动相等对色谱峰行为的影响, 结果显示以甲醇作为提取溶剂, 目标组分提取较为充分 因 20 号峰 ( 五味子酚 ) 峰面积较大, 分离度较好 含量较高 对照品容易获得, 且色谱峰位于色谱图中间位置, 故以其作为参照峰

5 年 月 第 卷 第 期 M C M M V N 表 不同产地南五味子药材中木脂素类成分的含量测定结果 m 样品编号 五味子醇甲 五味子醇乙 五味子酯甲 五味子酯乙 五味子酚 安五脂素 五味子甲素 总量 平均值 R D 注 表示未检测到 含量测定项分别选择目前报道的与南五味子发挥 传统功效密切相关的 个木脂素类成分作为指标性成 分 可较为全面地反映南五味子药材的内在质量 含量测定结果显示不同产地南五味子药材中 个木脂 D值均大于 含量差异较大 素类成分含量的 R 提示在生产过程中应作为重点指标加以控制 本研究所建立的南五味子药材指纹图谱相似度 京 中国医药科技出版社 杨文潮 杨洁 段金廒 等 南五味子中氨基酸类成分分 析评价 J 中药材 杨洁 段金廒 李国龙 等 南五味子中核苷类成分分析 评价 J 药物分析杂志 杨洁 段金廒 李国龙 等 不同产地南五味子中木脂素 中国中药杂志 分析研究 J 胡竟一 白筱璐 雷玲 等 南五味子总木脂素的催眠作 大于 所建立的同时测定 个指标的含量测定 用及对脑单胺类神经递质的影响 J 中药药理与临床 方法灵敏度高 专属性强 二者结合可有效杜绝为 达到某一质量标准而人为添加某一成分的现象 为 南五味子药材质量标准的提升提供了支撑 李强 杜思邈 张忠亮 等 中药指纹图谱技术进展及未 中草药 来发展方向展望 J 王领弟 臧亚茹 潘伟东 等 基于指纹图谱结合多元统 参考文献 国家药典委员会 中华人民共和国药典 一部 北 计分析 评 价 山 楂 叶 质 量 差 异 性 J 中 国 现 代 中 药 收稿日期 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿 上接第 页 尤静 朱广迎 食管癌放化疗相关进展 J 中国癌症防 治杂志 任维维 米登海 李征 等 非小细胞肺癌紫杉醇类联合 顺铂同步或序贯放化疗对比的 M 分析 J 中华肿瘤 防治杂志 王静 李峻岭 石远凯 等 吉西他滨联合顺铂在非小细 胞肺癌辅助化疗中的应用 J 中国全科医学 李晶 李娜 刘亚娴 等 启膈方对小鼠前胃癌转移相关 因子的影响 J 河北中医 李晶 李娜 刘亚娴 等 启膈方对人胃癌 MGC细胞增 殖 运动能力及分泌 MMP MMP 酶活性的影响 J 中国中医药信息杂志 李晶 刘 亚 娴 邢 彦 霞 等 启 膈 方 对 人 食 管 癌 细 胞 株 EC 人胃癌细胞株 MGC黏附的影响 J 中国中医基 础医学杂志 刘亚娴 李际君 付小梅 等 启膈方对小鼠免疫功能的 影响 J 中国实验方剂学杂志 收稿日期

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