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言掌
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用高分离度快速液相色谱对三七进行快速高效分析应用报告徐智秀 1 8 6 4 2.5 1. 1.5 2. 2.5 3.

1 用高分离度快速液相色谱对三七进行快速高效分析应用报告徐智秀摘要安捷伦仪器 : 12 系列高分离度快速液相色谱系统 ZORBAX XDB C18 RRHT 柱本应用报告报道了 : 高分离度快速液相色谱 (RRLC) 分析三七方法的方法建立从常规 HPLC 到 RRLC 方法转换的结果用 RRLC 方法在保持复杂组分良好分离度的同时, 缩短了分析时间, 同时提高了样品通量降低了成本用优化方法得到的色谱图显示, 从三七不同部位得到的样品色谱峰轮廓不同, 某些皂甙的浓度也不同应用领域 : 中药

2 前言中药 (TCMs) 具有悠久的用药历史, 其疗效在中国及韩国日本等亚洲国家都得到公认在西方国家, 也越来越普遍地将中药作为食品添加剂或营养补剂被使用过的中药已经有 11, 多种对中药的研究和质量控制很大程度上依靠仪器分离和分析的性能本研究建立了一种分析三七的高分离度快速液相色谱 (RRLC) 方法用安捷伦方法转移器轻松地将常规 HPLC 分析方法转为 RRLC 方法用不同提取方法从三七植物的不同部位制备不同样品用优化的方法分离这些样品, 得到的色谱图显示了不同的色谱峰轮廓本应用报告还报道了定量结果质控部门使用本研究中建立的更快更好的方法, 将缩短分析时间, 提高样品通量使用这些方法还能节省溶剂消耗, 改善整个分析过程三七, 中文名三七或田七, 在中国是一种重要而昂贵的药材它已经有 4 多年的栽培历史,85% 以上的三七都产自中国云南省三七的功效在于促进血液循环去除血液瘀积包括凝血, 治疗肿胀缓解疼痛最近的药理学研究显示, 三七具有抗癌和保肝作用, 如, 对心血管和脑血管系统有保护作用 1 三七的皂甙种类与著名的人参和西洋参 ( 花旗参 ) 相似, 因为它们都属于同一种属三七主要用于中国南方的不同验方著名的中成药云南白药和片仔癀中也含有三七中药的复杂基质常常给质量控制和研究带来挑战 25 版中国药典收载了药材三七及其复方制剂, 如三七伤药片, 其中含有三七皂甙 R1, 是这些制剂中必须分析的成分三七皂甙的分析时间一般是 6 多分钟随着对中药的研究越来越深入, 科学家们认为只控制 1 到 2 个成分还不足以确定中药的质量, 必须开发分离更多组分的质量控制方法像中药这种复杂样品的分离比合成药物的分离需要更长的分析时间当需要考虑样品通量问题时, 理想的解决方案就是在较短的分析时间内达到相似或更高的性能使用 RRLC 有可能开发出分析时间更短性能更好, 又节省溶剂的方法对于生产质量控制来说, 使用 RRLC 意味着产品批次的检定出厂可以比使用常规 HPLC 方法更快实验仪器用于开发 RRLC 方法的 Agilent 12 系列高分离度快速液相色谱系统包含以下组件 : Agilent 12 系列 RRLC 系统包括 : Agilent 12 系列 SL 型二元泵, 带真空脱气机 Agilent 12 系列 SL 型高性能自动进样器 Agilent 12 系列 SL 型柱温箱 Agilent 12 系列 SL 型二极管阵列检测器, 配置微量流通池 (2 µl 体积,3 mm 光程 ) Agilent 化学工作站 B.2.1 SR1, 用于数据采集和分析 Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT 色谱柱,4.6 x 5 mm, 1.8 µm 粒径 2

常规 HPLC 为标准配置 Agilent 11 系列液相色谱, 包含以下组件 : Agilent 11 系列二元泵, 带脱气机 Agilent 11 系列自动进样器 Agilent 11 系列柱温箱 Agilent 11 系列二极管阵列检测器 Agilent ZORBAX SB C18 色谱柱,4.

3 常规 HPLC 为标准配置 Agilent 11 系列液相色谱, 包含以下组件 : Agilent 11 系列二元泵, 带脱气机 Agilent 11 系列自动进样器 Agilent 11 系列柱温箱 Agilent 11 系列二极管阵列检测器 Agilent ZORBAX SB C18 色谱柱,4.6 x 5 mm, 5 µm 粒径样品和样品制备三七皂甙 R1 人参皂甙 Rg1 和人参皂甙 Rb1 标准品购自中国国家药品与生物制品检定所 (NICPBP), 人参皂甙 Re 和人参皂甙 Rc 标准品购自美国 Sigma- Aldrich 公司三七茎叶提取物 (NCLE) 由用户实验室提供茎和叶用 6% 乙醇提取, 溶剂蒸干后残渣用正丁醇溶解, 再将溶剂挥发掉, 残留黄色粉末用甲醇溶解, 待进样三七根提取物 (NRE) 由用户实验室提供粗品用水提取, 用大孔滤膜过滤, 滤液挥发至干残留白色粉末状物质用甲醇溶解, 待进样三七购自当地一家药材商店 ( 品牌为同仁堂 ) 粗品用水/ 甲醇 (3/7, v/v) 超声萃取 3 分钟, 用.22 微米滤膜过滤, 用澄清的滤液进样水乙腈和甲醇均购自美国 Fisher 公司方法转换需要将使用填充 5 µm 填料色谱柱的常规 HPLC 方法转换成使用填充 1.8 µm 填料色谱柱的 RRLC 方法使用安捷伦方法转换计算器 ( 可用光盘,Agilent 12 系列高分离度快速液相色谱系统, 发行号 EN), 可使这一过程简便快速 ( 图 1) 方法转换计算器上列出了各种不同参数, 可以根据具体需求对转换后的方法进一步改进如需了解如何将一个常规 HPLC 方法手动转换成 RRLC 方法, 请参阅安捷伦相关应用报告 2,3,4 图 1 安捷伦方法转换计算器用于将标准 HPLC 方法转换为 RRLC 方法 3

4 结果与讨论色谱图药理学研究结果显示, 三七植物的不同部位因所含的成分不同具有不同的药效使用特殊的提取方法以达到获得更多有效成分的目的用常规 HPLC 方法和 RRLC 方法分析三七样品得到不同的峰轮廓图 2 显示了用常规 HPLC 方法分析三七茎和叶提取物 (NCLE) 得到的色谱图这种分析通常需要 6 多分钟 5 如实验部分所述, 用于分析三七样品的 RRLC 方法是在常规 HPLC 方法的基础上开发的用常规 HPLC 方法和 RRLC 方法分析了相同的 NCLE 样品色谱图见图 2 和图 3 图 3 中的色谱峰比图 2 中的更窄这意味着分离复杂样品的峰容量增加了 RRLC 分析的分离度或分离性能优于常规 HPLC 同时, 分析时间从 6 分钟明显缩短到 2 分钟另一个要考虑的因素是常规 HPLC 和 RRLC 柱的选择性应保持一致如果新的 RRLC 柱与常规 HPLC 柱相比具有完全不同的选择性, 方法转换将失去意义在本研究中, 峰图 2 用常规 HPLC 方法在 Agilent 11 系列 LC 系统上分析 NCLE 的色谱图, 色谱条件见表图 3 用 RRLC 方法 1 在 Agilent 12 系列 LC 系统上分析 NCLE 的色谱图, 色谱条件见表 1 在 Agilent 11 系列 LC 上进行常规方法分析的色谱条件 : 色谱柱 : 流动相 : 梯度 : Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 x 25 mm, 5 µm 粒径 A: 水,B: 乙腈分钟, 2 %B; 1 分钟, 3 %B; 2 分钟, 35 %B; 3 分钟, 4 %B; 4 分钟, 6 %B; 5 分钟, 1 %B 流速 : 1. ml/min 进样量 : 5 µl 二极管阵列 23 nm ±8 nm, 检测 : 参比 36 nm ±1 nm 表 1. 色谱条件 RRLC 方法 1 色谱条件 : 色谱柱 : Agilent ZORBAX XDB C18, 4.6 x 5 mm, 1.8 µm 粒径 RRLC 方法 2 色谱条件 : 色谱柱 : Agilent ZORBAX XDB C18, 4.6 x 5 mm, 1.8 µm 粒径流动相 : A: 水,B: 乙腈流动相 : A: 水,B: 乙腈梯度 : 分钟, 2 %B; 3 分钟, 3 %B; 7 分钟, 35 %B; 1 分钟, 4 %B; 13 分钟, 6 %B; 17 分钟, 1 %B 梯度 : 分钟, 2 %B; 1.5 分钟, 3 %B; 5 分钟, 35 %B; 7 分钟, 4 %B; 1 分钟, 6 %B; 12 分钟, 1 %B 流速 : 1. ml/min 流速 : 1.5 ml/min 进样量 : 5 µl 进样量 : 5 µl 二极管阵列 23 nm ±8 nm, 二极管阵列 23 nm ±8 nm, 检测 : 参比 36 nm ±1 nm 检测 : Ref. 36 nm ±1 nm RRLC 方法 3 色谱条件 : 色谱柱 : 流动相 : 梯度 : Agilent ZORBAX XDB C18, 4.6 x 5 mm, 1.8 µm 粒径 A: 水,B: 乙腈分钟, 2 %B; 1.5 分钟, 6 %B; 5 分钟, 1 %B 流速 : 2.5 ml/min 进样量 : 5 µl 二极管阵列 23 nm ±8 nm, 检测 : Ref. 36 nm ±1 nm 4

5 轮廓和洗脱顺序都相同, 所以不需要再对新色谱图中的峰进行鉴定而且, 二极管阵列检测器得到的 UV 光谱图将有助于进一步对色谱峰进行确证图 4 显示了用 RRLC 方法 2 分析 NCLE 样品的色谱图流速提高到 1.5 ml/min, 又缩短了分析时间同时, 保持了与图 3 结果相同或相当的性能对于更复杂的样品, 缩短分析时间意味着将损失峰容量所以, 用户必须在峰容量和分析时间之间进行权衡图 4 NCLE 色谱图, 用 RRLC 方法 2 在 Agilent 12 系列 RRLC 系统上分析色谱条件见表 1 如实验部分所述, 有三种不同来源的样品图 3 显示了用 RRLC 方法 1 对三七根提取物 (NRE) 样品的分析样品为用不同的方法从三七根中提取色谱峰轮廓显示,NRE 和 NCLE 含有不同类型的皂甙和其它成分图 5 NRE 色谱图, 用 RRLC 方法 1 在 Agilent 12 系列 RRLC 系统上分析色谱条件见表 1 5

6 为了检验所建立的 RRLC 方法是否能用于其它三七样品, 我们从当地的一家中药店中购买了三七品牌为同仁堂, 中药店已将三七研成粉末三七分析的色谱图见图 6 和图 7 图 6 用 RRLC 方法 1 获得, 图 7 用 RRLC 方法 3 获得与需要 6 多分钟的常规 HPLC 方法相比, 图 7 中色谱图的分析时间只有 4 分钟三七茎和叶的提取物比其它样品更复杂, 为了节省时间并保持分离度, 用方法 1 或 2 分析对于不太复杂的样品, 如同仁堂的三七提取物, 可以在更短的时间里用更快的方法分析, 如图 7 所示图 6. 同仁堂三七色谱图, 用 RRLC 方法 1 在 Agilent 12 系列 RRLC 系统上分析色谱条件见表图 7. 同仁堂三七色谱图, 用 RRLC 方法 3 在 Agilent 12 系列 RRLC 系统上分析色谱条件见表 1 6

7 定量结果用 RRLC 方法 2 分析实验部分所列的标准品使用不同浓度水平的标准品绘制校正曲线, 并测定了三个样品的浓度表 2 显示了定量结果 NCLE 含有许多种皂甙, 但不含 Rc 或 Re NRE 含皂甙种类较少, 但含有本研究所分析的 5 种标准品同仁堂三七提取物中没有许多种类的皂甙, 也不含 Rc 或 Re, R1 Rb1 和 Rg1 的浓度比 NCLE 和 NRE 高所有样品中三七 R1 的浓度范围为.29 到.89 µg/µl 本研究中建立的定量方法可以很容易地用于不同提取方法三七的质量控制标准品公式相关系数 NCLE 中的浓度 NRE 中的浓度同仁堂三七粉末 Y: 峰面积 (µg/µl) (µg/µl) 中的浓度 x: 含量 (µg/µl) (.1 µg/µl) R1 Y = x Rb1 Y = x Re Y = x N/A 1.28 N/A Rg1 Y = x Rc Y = x N/A.25 N/A 表 2. 皂甙标准品的定量结果结论中药是复杂的天然产物, 用常规 HPLC 进行分析需要高性能的系统和很长的分析时间本研究中建立的 RRLC 方法显示了在保持复杂组分良好分离度的同时, 如何缩短了分析时间色谱图显示了不同三七提取样品具有不同的峰轮廓考虑到应用的需要, 使用更快流速的 RRLC 可得到更快的分析方法本研究中建立的定量方法可以很容易地开发为三七产品的质量控制方法用 RRLC 方法在保持或获得更高性能的同时, 显著缩短分析时间, 从而提高样品通量, 节省经费 7

8 参考文献 1. Wei J.X., Du Y.C., Modern science research and application of panax 三七, Yunnan Science and Technology Press, Kunming, China, Angelika Gratzfeld-Huesgen, Fast and Ultra-fast Analysis with the Agilent 12 Series Rapid Resolution LC System Compared to a Conventional Agilent 11 Series LC System Using Sub 2-µm Particle Columns, Agilent Application Note, Publication Number EN, Michael Woodman, Improving the Effectiveness of Method Translation for Fast and High Resolution Separations, Agilent Application Note, Publication Number EN, Michael Frank, Saving analysis time and gaining resolution by simple means, Agilent Application Note, Publication Number EN, Lau A.J., Woo S.O., Koh H.L., Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection, J. Chromatogr. A, 111, 77-87, 23. 徐智秀是安捷伦科技上海有限公司的应用化学工程师 27 安捷伦科技公司 28 年 1 月中国印刷出版号 CHCN

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