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侨栋肝戎
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1 南京中医药大学学报 2017 年 11 月第 33 卷第 6 期 J NanjingUnivTraditChinMedVol.33No.6Nov 不同产地黄芩茎叶 UPLC 指纹图谱与化学模式识别研究严宝飞, 朱邵晴, 宿树兰 *, 朱振华, 郭盛, 曾慧婷, 钱大玮, 段金廒 * ( 南京中医药大学, 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心, 国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室, 江苏南京 ) 摘要 : 目的采用超高效液相色谱法 (UPLC) 建立不同产地黄芩茎叶指纹图谱, 超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法 (UPLC QTOF/MS) 快速鉴定共有峰, 并结合化学模式识别研究, 为黄芩地上茎叶资源循环利用与质量控制提供参考方法采用 UPLC, 色谱条件为 ACQUITY UPLCBEH C18(100mm 2.1mm,1.7μm) 色谱柱, 以乙腈 0.1% 甲酸水为流动相梯度洗脱, 流速 0.4mL/min, 检测波长 254nm, 柱温 35 质谱检测采用负离子模式, 电压 3.0kV, 离子源温度 120, 雾化温度 400, 雾化气 800L/h 通过相似度评价结合聚类分析和主成分分析进行分析评价, 并通过 UPLC QTOF/MS 对黄芩茎叶共有峰进行鉴定结果确定了不同产地黄芩茎叶药材的 19 个共有峰, 建立了 UPLC 指纹图谱 10 个产地 11 批黄芩茎叶样品的指纹图谱相似度均 >0.9, 各产地黄芩茎叶药材的相似度较高, 聚类分析主成分分析结果与相似度分析结果一致结论本方法快速准确可靠重复性好, 黄芩茎叶 UPLC 指纹图谱的构建和化学模式的识别可更好的评价其质量, 为黄芩地上部分资源价值的利用与质量的控制提供参考关键词 : 黄芩茎叶 ; 指纹图谱 ;UPLC;UPLC QTOF/MS; 化学模式识别中图号 :R284.1 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) DOI: /j.issn UPLCFingerprintandChemicalPaternRecognition MethodofScutelariaBaicalensisStem Leaffrom DiferentRegions YANBao fei ZHUShao qing SUShu lan * ZHUZhen hua GUOSheng ZENG Hui ting QIAN Da wei DUAN Jin ao * JiangsuColaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization NationalandLocalColaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcesRecyclingUtilizationofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine Nanjing UniversityofChineseMedicine Nanjing China ABSTRACT OBJECTIVE TostudyandestablishtheUPLCfingerprintofScutelariabaicalensisstem leafsbsl andrapidlyidentifythespecificpeaksbyuplc QTOF MS andcombinedwiththestudyofchemicalpaternrecognitiontoprovidescientificbasisforresourcescirculatingutilizationofthesbsl METHODS ThefingerprintofSBSLwasestablishedbyUPLC thesampleswereconductedbyacquity UPLCBEHC18 100mm 2 1mm 1 7μm andelutedwithacetonitrileand0 1% formicacidwiththeflowrateof0 4mL min Thedetectionwavelengthwassetat254nmandcolumntemperaturewas35 Negativeionmodewaschosenforqualitativeanalysis Thecapilaryvoltagewassetat3 0kV Thenebulizationgaswassetto 800L hat400 andthesourcetemperaturewas120 Thesimilarityevaluation clusteranalysis CA andprincipal componentanalysis PCA wereusedtodealwiththeexperimentaldata inordertofindoutthesimilaritiesanddiferencesamongthe11batchesofsbslfrom10diferentregions RESULTS ThespecificchromatogramofSBSLwasobtained and19 commonpeakswereidentifiedbyesi QTOF MS Similaritiesofthe11batchesofsamplesfrom10regionswereover0 9 the resultsofcaandpcawereconsistentwithsimilarityevaluation CONCLUSION Themethodestablishedinthispaperisrapid accurate reliableandreproducible TheestablishmentofUPLCfingerprintofSBSLandtheapplicationofchemicalpatern recognitioncanprovideamorecomprehensivereferenceforthequalitycontrolofsbslandtheresourcescirculatingutilization valueofnon medicinalpartsofs baicalensis KEY WORDS Scutelariabaicalensisstem leaf fingerprint UPLC UPLC QTOF MS chemicalpaternrecognition 黄芩来源于唇形科黄芩属多年生草本植物黄芩 Scutelariabaicalensis Georgi 的干燥根, 药用历史收稿日期 : ; 修稿日期 : 基金项目 : 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目 (ZDXM 3 7) 作者简介 : 严宝飞 (1992-), 男, 江苏南京人, 南京中医药大学 2015 级硕士研究生 * 通信作者 :sushulan1974@163.com;dja@njucm.edu.cn

2 634 南京中医药大学学报 2017 年 11 月第 33 卷第 6 期悠久, 始载于神农本草经 [1] 性味苦寒, 入心肺胆大肠经, 具有泄实火除湿热止血安胎等功效, 临床上常用于治疗肺热咳嗽, 湿热泻痢, 胎动不安等 [2] 病症黄芩药材临床用量较大, 为了满足需求, 国内已大量栽培, 主要分布于黑龙江吉林辽宁河 [3] 北山东山西陕西甘肃等地, 其地上茎叶未被有效利用而废弃, 造成大量资源浪费及环境污染黄芩叶在我国北方各省及云南部分地区作为一种茶叶饮用, 被称为黄芩茶黄金茶等, 其民间应用可能已有千年的历史, 具有清热燥湿泻火解毒消 [4 5] 炎促消化等功效现代研究证实黄芩茎叶中主要含有黄酮类有机酸类二萜类挥发油类多糖类等资源性化学成分黄芩茎叶具有与根和根茎相似的临床疗效及药理活性, 从黄芩茎叶提取所得到的总黄酮具有解热镇痛抗菌抗病毒抗炎等多种药 [6] 理活性, 具有很高的药用价值主要成分为黄芩茎叶总黄酮提取物的黄芩茎叶解毒胶囊已经获得批 [7 8] 准上市, 在临床上作为抗炎药使用目前, 指纹图谱结合模式识别方法已被广泛地应用于药物的质量控制, 现有的文献对不同产地黄芩茎叶指纹图谱的研究较少为进一步开发黄芩地上部分资源价值以及质量控制, 本文采用超高效液相色谱 (UPLC) 法建立黄芩茎叶指纹图谱采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法 (UPLC QTOF/MS) 鉴定共有峰建立了以相似度分析聚类分析和主成分分析为核心的化学模式识别方 [9] 法, 可用于黄芩茎叶质量评价与控制, 从而加快黄芩茎叶资源产业化过程, 带来中药经济新的增长空 [10 11] 间与生态环境效益 1 材料 1.1 仪器 WatersACQUITY UPLC 系统 ( 美国 Waters 公司 ),Synapt TM Q TOF 质谱仪 ( 美国 Waters 公司 ),MassLynx TM 4.1 质谱工作站软件 ( 美国 Waters 公司 ),Mili Q 超纯水制备仪 ( 美国 Mili pore 公司 ),ML204/MS105 型电子天平 ( 梅特勒托利公司 ),DHG 9023A 型电热恒温鼓风干燥箱 ( 上海精宏实验设备有限公司 ),AnkeGL 16GⅡ 型离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ),KQ250E 型超声波清洗器 ( 昆山禾创超声仪器有限公司 ) 1.2 材料对照品对羟基苯甲酸 ( 批号 :DQJS ) 咖啡酸 ( 批号 :KFS ) 阿魏酸 ( 批号 : AWS ) 野黄芩苷 ( 批号 : YHQG ) 黄芩苷 ( 批号 :HQG ) 木犀草素 ( 批号 :MXCS ) 白杨素 7 O β D 葡萄糖醛酸苷 ( 批号 :BYQS ) 黄芩素 ( 批号 :HQS ) 均购自南京春秋生物工程有限公司, 质量分数经高效液相色谱检测均大于 98% 乙腈 ( 美国 Tedia 公司 ) 和甲酸 ( 德国 Merck 公司 ) 均为色谱纯, 超纯水 ( 自制 ), 其他化学试剂均为分析纯 ( 南化试剂公司 ) 11 批黄芩茎叶样品信息见表 1, 经南京中医药大学段金廒教授鉴定为唇形科黄芩属植物黄芩 Scutelariabaicalensis Georgi 的地上茎叶 11 批样品均置于 50 条件下烘干至恒质量, 粉碎后过 40 目筛, 保存备用表 1 11 批不同产地黄芩茎叶样品编号产地采集时间 S1 河北邯郸 2016 年 7 月 S2 河北承德 2016 年 7 月 S3 山西运城 2016 年 7 月 S4 河北承德 2016 年 6 月 S5 山西大同 2016 年 7 月 S6 河北安国 2016 年 7 月 S7 黑龙江大兴安岭地区 2016 年 6 月 S8 江苏南京 2016 年 7 月 S9 北京 2016 年 7 月 S10 陕西商洛 2016 年 7 月 S11 山东济南 2016 年 7 月 2 方法与结果 2.1 对照品溶液制备精密称取干燥至恒质量的对照品适量, 用甲醇配成质量浓度分别为对羟基苯甲酸 102mg/L 咖啡酸 121mg/L 阿魏酸 251mg/L 野黄芩苷 105mg/ L 黄芩苷 102mg/L 木犀草素 231mg/L 白杨素 7 O β D 葡萄糖醛酸苷 111mg/L 黄芩素 122mg/L 的混合对照品溶液 2.2 供试品溶液制备精密称定上述样品粉末 0.5g, 置于 100mL 具塞锥形瓶中, 精密加入 40mL60% 乙醇, 室温超声提取 40min, 放冷摇匀, 离心 10min(13000r/min), 取上清液, 经 0.22μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液作为供试品溶液 2.3 色谱条件色谱柱 :Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (100mm 2.1mm,1.7μm); 流动相 :0.1% 甲酸水

3 严宝飞, 等 : 不同产地黄芩茎叶 UPLC 指纹图谱与化学模式识别研究第 6 期 635 溶液 (A) 乙腈 (B); 梯度洗脱 (0~1min,5%A;1~3 min;5% ~15%A;3~11min,15% ~40%A;11~ 13min,40% ~40%A;13~14min,40% ~95%A; 14~15 min,95% ~5% A;15~16 min,5% ~5% A); 流速 :0.4mL/min; 进样体积 :2μL; 检测波长为 254nm 2.4 质谱条件 ESI 源 ; 扫描方式 :ESI + ESI - 模式 ; 萃取电压 4.0V; 锥孔电压 30V; 毛细管电压 3.0kV; 脱溶剂气温度 400 ; 离子源温度 120 ; 脱溶剂气流量 800 L/h; 锥孔气流量 50L/h; 碰撞能量 6~40eV, 离子能量 1V; 质量扫描范围 m/z:100~ UPLC 指纹图谱方法学考察精密度试验取 S1 号样品, 按照 2.2 项下方法制备供试品溶液, 连续进样 6 次, 计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果表明, 各共有峰的相对保留时间均小于 0.14%, 相对峰面积的 RSD 值均小于 2.71%, 说明仪器精密度良好稳定性试验取 S1 号样品, 按照 2.2 项下方法制备供试品溶液, 分别在 h 进样, 计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果表明, 各共有峰的相对保留时间均小于 0.33%, 相对峰面积的 RSD 值均小于 2.33%, 说明样品在 24h 内具有良好的稳定性重复性试验取 S1 号样品 6 份, 按照 2.2 项下方法制备供试品溶液, 计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积, 结果表明, 各共有峰的相对保留时间均小于 0.18%, 相对峰面积的 RSD 值均小于 2.08%, 说明该方法重复性良好 2.6 不同产地黄芩茎叶 UPLC 指纹图谱的建立及相似度评价指纹图谱的建立取 11 批黄芩茎叶样品, 按 2.2 项制备供试品溶液, 按 2.3 项进行分析, 记录色谱图, 并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A 版 ), 设置 S11 分析得到的图谱为参照指纹图谱, 叠加图谱及对照图谱见图参照峰的确定在所有样品图谱中 7 号峰分离度良好位置居中峰面积较大且稳定, 所以确定 7 号峰为参照峰共有峰的确定依据所有样品的 UPLC 分析确定 19 个共有峰, 共有峰的峰面积之和大于 90%, 共有峰的相对保留时间 RSD 值在 0.000~ 范围内, 相差较小 ; 相对峰面积的 RSD 值相差图 1 11 批黄芩茎叶样品的叠加图谱及对照图谱较大, 其中号峰 RSD 值较大, 结果见表 2~ 相似度计算以对照图谱为参照 ( 值为 1), 计算各样品相似度, 结果见表 4 11 批黄芩茎叶样品的相似度在 0.952~0.999 范围内, 说明这 11 批黄芩茎叶样品质量较为均一稳定 ; 图 1 表明各批次黄芩茎叶在化学成分种类上基本一致, 但各峰的峰面积有所差异, 表明各成分的含量有差异由表 4 可知, 样品 S3( 产地山西运城 ) 与 S7( 产地黑龙江大兴安岭地区 ) 相似度较低, 其余产地样品相似度则较高主要共有峰的鉴定根据对照品以及文献 [12 13] 报道, 鉴定了 8 个共有峰所代表的化学成分, 结果见表化学模式识别研究主成分分析以 19 个共有峰峰面积为变量, 采用 SPSS19.0 统计软件对收集的 11 批黄芩茎 [14] 叶样品进行主成分分析, 结果见表 6, 前 2 个主成分的特征值均大于 1, 说明前两个因子在反映产地与 19 个共有成分的相互关系中起主导作用, 主成分 PC1 贡献率为 40.3%,PC2 贡献率为 23.3%, 前 2 个主成分的累计贡献率为 63.6%, 能够客观的反映不同产地与 19 个共有成分之间的内在联系, 故选取前 2 个主成分进行分析, 各样品的主成分的得分图见图 2 图 2 表明,S3 与 S7 号样品标示的点相比于其他样品较为分散, 说明 S3 与 S7 号黄芩茎叶样品与其他产地黄芩茎叶差异较大

4 636 南京中医药大学学报 2017 年 11 月第 33 卷第 6 期表 2 共有峰在 11 批黄芩茎叶样品 UPLC 指纹图谱的相对保留时间分析峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 RSD/% 表 3 共有峰在 11 批黄芩茎叶样品 UPLC 指纹图谱的相对峰面积分析峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 RSD/% 聚类分析将 11 批黄芩茎叶的 19 个共有色谱峰的峰面积数据导入 SPSS19.0 统计软件, 采用中间数平方欧式距离进行聚类分析结果见图 3 图 3 表明,11 批药材样品可以分成 Ⅰ 和 Ⅱ 两类, 其中 S3 号样品为 Ⅰ 类, 剩余的样品为 Ⅱ 类 ;Ⅱ 类被分成 a 和 b 两类, 其中 S7 号样品为 a 类, 剩余的样品为 b 类结果表明样品 S3 和 S7 与其他产地的样品存在一定的差异, 与相似度评价的结果一致 3 讨论黄芩是我国的传统常用中药, 是大宗药材之一, 因此每年产生了巨量的黄芩茎叶资源, 现代研究证实黄芩茎叶中含有丰富的且具有明显药理活性的资

5 严宝飞, 等 : 不同产地黄芩茎叶 UPLC 指纹图谱与化学模式识别研究第 6 期 637 源性化学成分, 以黄芩茎叶为原料的黄芩茎叶解毒表 4 11 批黄芩茎叶相似度分析结果胶囊已上市, 但关于其指纹图谱研究较少为提升样品编号相似度样品编号相似度黄芩茎叶资源循环利用价值与质量控制水平, 本文 S S 首次采用 UPLC 法建立了黄芩茎叶指纹图谱, 相比 S S S S 于普遍的高效液相色谱法, 分析时间大幅缩短, 反映 S S 的样品化学成分信息更为丰富, 灵敏度和分离度更 S S 高 S 表 5 共有峰的鉴定峰号 tr/min 质量数 ESI - (m/z) 质量偏差测量值理论值 mda 10-6 二级碎片离子 (m/z) 分子式鉴定结果 ,120 C7H6O3 对羟基苯甲酸 ,135 C9H8O4 咖啡酸 ,178 C10H10O4 阿魏酸 ,271,253,225 C21H18O12 野黄芩苷 ,271,253,225,169 C21H18O11 黄芩苷 ,199,179,151,133 C15H10O6 木犀草素 ,209,181 C21H18O10 白杨素 -7-O-β-D- 葡萄糖苷 ,253,225 C15H10O5 黄芩素表 6 主成分的特征值及贡献率本文共标定 19 个共有峰, 通过 UPLC QTOF/ 主成分特征值方差贡献率 /% 累积方差贡献率 /% MS 对共有峰定性分析, 结果表明黄芩茎叶 60% 乙醇提取物中主要化学成分为黄酮类和少量的酚酸类, 其中野黄芩苷为含量最高的成分, 这也表明这些 [4] 成分可能是黄芩茎叶药理作用的物质基础各共有峰相对保留时间差异较小, 表明化学成分种类上基本一致 ; 而相对峰面积差异较大, 表明各黄芩茎叶样品中化学成分含量有差异化学模式识别方法已被广泛应用到多个学科的分析工作中, 在处理指纹图谱等多维数据的分析中具有优势因此本文采用相似度评价主成分分析和聚类分析综合评价, 来自河北邯郸河北承德河北安国山西大同陕西商洛北京江苏南京山东济南的黄芩茎叶聚为一类, 而产地为山西运城与黑图 2 11 批黄芩茎叶的 PCA 图龙江大兴安岭地区的样品与其他产地具有一定差异, 表明黄芩产地的地理气候水纹等因素能够在黄芩茎叶积累次生代谢产物的过程中产生一定的影响, 从而导致品质的差异为了能在一张色谱图中尽可能的全面反映样品中化学成分信息, 本文考察了提取溶剂因素 (50% 60% 70% 乙醇 50% 60% 70% 甲醇 ) 超声时间因素 ( min) 以及回流时间因素 (1 2 3h) 对黄芩茎叶化学成分溶出的影响, 考察结果为 60% 乙醇超声 40min, 黄芩茎叶中化学成分提取率最高在流动相系统的选择上比较了乙腈甲酸水乙腈磷图 3 11 批黄芩茎叶聚类树状图酸水系统, 结果表明二者在色谱信息方便并无明显

6 638 南京中医药大学学报 2017 年 11 月第 33 卷第 6 期差别, 但是乙腈磷酸水系统的基线不平稳, 因而选择乙腈甲酸水作为流动相在色谱图处理过程中对检测波长进行了考察, 比较了 280nm 和 254nm, 结果发现在 254nm 波长下样品的色谱信息更为丰富, 所以选择 254nm 为检测波长按照 2.4 项下 UPLC QTOF/MS 条件进样, 对项下溶液进行正负离子模式扫描, 发现在负离子模式下响应较高, 灵敏度及准确度较高所以, 黄芩茎叶中共有峰采用负离子模式来定性鉴别分析本文建立的方法可对不同产地黄芩茎叶进行整体性的评价, 且稳定可靠简便快速, 可用于黄芩茎叶资源质量评价与控制, 从而促进黄芩茎叶资源的产业化过程, 并为其他非传统药用部位资源开发与利用提供参考参考文献 : [1] 胡世林, 冯学锋. 黄芩研究的某些新进展 [J]. 中国药学杂志, 2001,36(11): HUSL,FENG XF.Somenew developmentsinscutelariabaicalensisgeorgi.[j].chinpharmj,2001,36(11): [2] 梁英, 韩鲁佳. 黄芩中黄酮类化合物药理学作用研究进展 [J]. 中国农业大学学报,2003,8(6):9 14. LIANG Y,HAN LJ.Advancesinresearchofpharmacological activitiesofflavoniodcompoundsinscutelariabaicalensisgeorgi [J].JChinAgrUniv,2003,8(6):9 14. [3] 于晶, 陈君, 肖新月, 等. 不同来源黄芩产量及质量性状的比较研究 [J]. 中国中药杂志,2005,30(7): YUJ,CHENJ,XIAO XY,etal.Studyonyieldandqualityof Scutelariabaicalensisfrom diferenthabitats[j].chinj Chin MaterMed,2005,30(7): [4] 何春年, 彭勇, 肖伟, 等. 黄芩茶的应用历史与研究现状 [J]. 中国现代中药,2011,13(6): (6):3 7. [5] 朱艳霞, 骆翔, 赵东平, 等. 黄芩黄芩茶及其水溶液中矿质元素含量分析 [J]. 光谱学与光谱分析,2011,31(11): ZHU YX,LUO X,ZHAODP,etal.Analysisofthecontentof HECN,PENGY,XIAO W,etal.Applicationhistoryandcurrentresearchsituationofskulcaptea[J].ModChinMed,2011, mineralelementsinscutelariabaicalensisskulcapteaanditssolution[j].spectroscspectanal,2011,31(11): [6] 黄贤荣, 梁爱君, 黄忠, 等. 黄芩茎叶药理作用研究进展 [J]. 解放军药学学报,2012,28(3): HUANG XR,LIANGAJ,HUANGZ,etal.Advancesinpharmacologicalresearch ofscutelaria baicalensisstem leaf[j]. PharmJChinPLA,2012,28(3): [7] 陈云, 陈四平, 李洪波, 等. 黄芩茎叶总黄酮胶囊溶出度测定方法的研究 [J]. 中成药,2006,28(7): CHEN Y,CHEN SP,LI HB,etal.Studyondetermination methodofdissolutionofscutelariabaicalensisstem leaftotal flavonoidscapsules[j].chintraditpatmed,2006,28(7): [8] 马森林. 黄芩茎叶化学成分研究 [D]. 石家庄 : 河北师范大学, MASL.ChemicalConstituentsfromStemsandLevesofScutellariaBaicalensis[D].Shijiazhuang:HeibeiNormalUniversity, [9] 韦卓纯, 姚志红, 王其意, 等.UPLC 结合化学计量学方法的肿节风指纹图谱研究 [J]. 中草药,2015,46(6): WEIZC,YAO ZH,WANG QY,etal.FingerprintofSarcandraeHerbaby UPLCcoupled withchemometrics methods[j]. ChinTraditHerbDrugs,2015,46(6): [10] 段金廒, 宿树兰, 郭盛, 等. 中药资源产业化过程废弃物的产生及其利用策略与资源化模式 [J]. 中草药,2013,44(20): DUANJA,SUSL,GUOS,etal.Productionofcastoffrom processinchinesemateriamedicaresourcesindustrializationas welasresourceutilizationstrategiesandmodes[j].chintraditherbdrugs,2013,44(20): [11] 段金廒. 中药资源化学 : 理论基础与资源循环利用 [M]. 北京 : 科学出版社,2015: DUANJA.ResourceChemistryofTraditionalChinese Medicine:TheoreticalBasisand ResourceRecycling[M].Beijing: Sciencepress,2015: [12]LIU G,RAJESH N,WANG X,etal.Identificationoffla- vonoidsinthestemsandleavesofscutelariabaicalensisgeor- gi.[j].jchromatogrbanalyttechnolbiomedlifesci,2011, 879(13/14): [13]GUOS,DUANJA,TANG Y,etal.High performanceliquid chromatography twowavelengthdetectionoftriterpenoidacids fromthefruitsofziziphusjujubacontainingvariouscultivarsin diferentregionsandclassificationusingchemometricanalysis [J].JPharm BiomedAnal,2009,49(5): [14] 杨洁, 段金廒, 李国龙, 等. 不同产地南五味子中木脂素分析研究 [J]. 中国中药杂志,2014,39(23): YANGJ,DUANJA,LIGL,etal.Determinationoflignansin schisandraesphenantheraefructusfrom diferentregions[j]. ChinJChin MaterMed,2014,39(23): ( 编辑 : 杨巍敏 )

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