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1 第 8 卷第 12 期西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) 201 年 12 月 Vol.8 No.12 JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScienceEdition) Dec. 201 文章编号 : (201) 波棱瓜子药材指纹图谱研究 王佩龙 1, 杨丽花 1, 令狐浪 1, 邹妍琳 1, 兰小中 2, 廖志华, 陈敏 1 1. 西南大学药学院, 发光与实时分析教育部重点实验室, 重庆 ; 2. 西藏大学农牧学院, 西藏林芝 );. 西南大学生命科学学院, 重庆 摘要 : 目的 : 建立波棱瓜子药材的 HPLC 指纹图谱, 为波棱瓜子药材的质量控制提供保证. 方法 : 甲醇提取物依次用石油醚 乙酸乙酯萃取, 乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解定容, 制备样品溶液 ; 采用 RP-HPLC 分析, 色谱条件为 WondaSilC18 色谱柱 (4.6mm 150mm,5μm), 流动相 A 为 50mM 磷酸二氢钾缓冲盐水溶液 (ph2.6), 流动相 B 为甲醇, 程序梯度洗脱, 流速 0.7mL/min, 柱温 25, 检测波长 254nm, 进样量 5μL. 利用中药指纹图谱相似度评价系统 (2004A 版 ) 对不同批次波棱瓜子药材 HPLC 图谱进行分析比较. 结果 : 建立了波棱瓜子药材的 HPLC 指纹图谱, 以 HerpetolideA 为参照峰确立了波棱瓜子药材指纹图谱中的 18 个共有峰. 结论 : 建立的指纹图谱的重现性及稳定性均好, 可用于波棱瓜子药材的质量管理规范. 关键词 : 波棱瓜子 ;HPLC; 指纹图谱 ; 质量控制中图分类号 :R284.1 文献标志码 :A 波棱瓜子系葫芦科波棱瓜子属植物波棱瓜子 (Herpetospermumcaudigerum Wal) 的干燥成熟种子, 为常用藏药, 具有清胆热 泻肝火 解毒功效, 临床上主治肝胆疾病, 黄疸型传染性肝炎, 胆囊炎, 消化不 良等 [1-2], 主要分布于中国的云南 西藏等地及印度 尼泊尔等国. 波棱瓜子化学成分主要包括苯呋喃类 [-9], [10-1]. 木脂素类 香豆素类化合物等研究表明具有抗肝损伤 抗氧化等药理活性 波棱瓜子现行标准为部颁标准, 对波棱瓜子的质量控制仅限于显微鉴别 薄层鉴别, 没有涉及到对有 [14-15] 效成分的控制, 远不能达到控制其质量的目的. 对波棱瓜子指纹图谱研究将为波棱瓜子质量标准建立 提供重要依据, 对波棱瓜子药材的标准化种植, 确保其临床用药的安全都具有重要作用. 本文使用具有活 性的 herpetolidea 作为对照品, 采用 RP-HPLC 建立了波棱瓜子药材指纹图谱, 分析了 12 批波棱瓜子药 材, 建立了基于指纹图谱的质量控制方法. 1 仪器与材料 1.1 仪器 日立高效液相色谱仪 ( 检测器 L-2455 输液泵 L-210); 分析天平 ( 十万分之一 ); 超声清洗仪 (KQ 收稿日期 : 基金项目 : 藏药巴朱抗肿瘤活性成分快速发现及作用机制研究 ( ); 西藏自治区科技厅重点项目子课题 西藏道地性药材波棱瓜子有效成分研究 (2010KJGX01 6). 作者简介 : 王佩龙 (1985 ), 男, 陕西宝鸡人, 硕士研究生, 主要从事化学及生物药物分析方面的研究. 通信作者 : 陈敏, 教授, 硕士生导师.

2 2 西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 8 卷 型, 昆山市超声仪器公司 ). 1.2 试剂 甲醇 (SPECTRUM, 色谱纯 ); 甲醇 石油醚 乙酸乙酯均为分析纯 ;HerpetolideA( 自制, 面积归一法 确认纯度达 98%). 1. 药材 表 1 波棱瓜子药材来源 编号 采集时间 购买 / 采集地 收集方式 编号 购买时间 购买 / 采集地 收集方式 S 西藏林芝 采集 S 西藏拉萨 购买 S 西藏林芝 采集 S 四川成都 购买 S 安徽亳州 购买 S 安徽亳州 购买 S 青海西宁 购买 S 四川成都 购买 S 浙江宁波 购买 S 西藏林芝 采集 S 四川成都 购买 S 西藏林芝 采集 2.1 供试品溶液的制备 波棱瓜子药材粉碎, 过筛, 精密称定 1.000g, 置于 50mL 三角烧瓶中, 精密加入 40mL 甲醇, 超声提 取 40min(200W), 回收溶剂依次用石油醚 乙酸乙酯萃取 5 次, 收集乙酸乙酯部分, 用 ml 甲醇溶解, 定容,10000r/min 离心 10min, 取 1mL 滤液, 用 0.22μm 微孔滤膜过滤,4 保存. 2.2 对照品溶液的制备 精密称取 HerpetolideA0.68mg 用色谱级甲醇溶解定容到 10 ml, 配成 mg/ml, 以 0.22μm 微孔滤膜过滤,4 保存. 2. HPLC 分析方法 色谱柱为 WondaSilC18 柱 (4.6mm 150mm,5μm), 柱温 25, 检测波长 254nm, 进样量 5μL, 流速 0.7mL/min, 流动相以 (A)-50mmol 的磷酸二氢钾缓冲盐水 ph=2.61,(b) 甲醇, 采用梯度洗脱程序 : 表 2 流动相洗脱梯度 时间 /min B/% 方法学考察 精密度试验 取经同一处理的波棱瓜子样品, 连续进样 5 次. 然后把数据转换为 AIA 格式, 全谱导入中草药指纹图 谱相似度评价软件, 自动峰匹配后, 得峰面积和保留时间相对标准差 (RSD) 稳定性试验 取同一批供试品溶液, 分别在 0,4,8,16,24h 各精密吸取 5μL 进样. 然后把数据转换为 AIA 格式, 全 谱导入中草药指纹图谱相似度评价软件, 自动峰匹配后, 得峰面积和保留时间的 RSD 值 重复性试验 取同一批波棱瓜子样品 5 份, 按 2.1 方法处理进样. 然后把数据转换为 AIA 格式, 全谱导入中草药指 纹图谱相似度评价软件, 自动峰匹配后, 得峰面积和保留时间相对标准差 (RSD). 2.5 波棱瓜子药材样品指纹图谱建立 将 12 批波棱瓜子药材样品 HPLC 图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价体系 2004A( 国家药典委员 会颁布 ) 版进行峰匹配. 结果与分析.1.1 精密度试验按 方法检验仪器的精密度, 主要色谱峰相对保留时间 RSD 为 0.12% ~0.57%, 相对峰面积

3 第 12 期 王佩龙,等:波棱瓜子药材指纹图谱研究 RSD 为 0.7%~.1%,说明仪器有很好的精密度..1.2 稳定性实验 按2.4.2 方法进行稳定性试验,结果其峰面积的 RSD 为 1.2%,表明供试品在 24h 内基本稳定..1. 重现性实验 按2.4. 方法检验方 法 的 重 现 性,主 要 色 谱 峰 相 对 保 留 时 间 RSD 为 0.16% ~2.64%,相 对 峰 面 积 RSD 为 0.08%~1.6%,表明该法重复性良好..1.4 n 强峰标定 把 12 批药材的色谱图与生成的对照图谱进行比较,发现 1 号药材与之相似度最高,可将 1 号药材作为 标准药材.选取峰面积较大且稳定的 图 谱 共 有 峰,得 到 7 个 强 峰,分 别 为 共 有 峰 号 ( % ),11 号 ( % ),12 号 (.1927% ),1 号 (.9855% ),14 号 ( 5.519% ),16 号 ( % ),18 号 ( % ),其峰面积之和占总峰面积的80% 以上.这7 强峰可反映波棱瓜子内在特征,用来鉴别波棱瓜 子药材..2 指纹图谱的建立 将 12 批 波 棱 瓜 子 样 品 的 HPLC 数 据 以 AIA 格 式 全 谱 导 入 中 药 色 谱 指 纹 图 谱 相 似 度 评 价 体 系 2004A,对 应 的 峰 进 行 多 点 校 对 后 进 行 色 谱 峰 匹 配,得 到 共 有 峰 18 个.选 择 色 谱 图 中 18 个 主 要 峰 为 校 正 点,建 立 波 棱 瓜 子 药 材 生 成 对 照 标 准 谱 图,如 图 1 和 指 纹 图 谱 如 图 2,共 有 峰 分 别 以 1~18 数 字 为 序 号,以 虚 线 连 接. 图 1 波棱瓜子药材标准指纹图谱 图 2 12 批波棱瓜子药材的 HPLC 指纹图谱

4 4 西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 8 卷 根据如图 2 匹配结果, 中药色谱指纹图谱相似度评价体系 A 版系统软件自动计算出色谱峰的峰面积, 利用 Excel 表格导出, 得到表 的数据. 表 中,12 批波棱瓜子药材的非共有峰面积占总峰面积的百分比 都不超过 10%, 符合指纹图谱研究的技术要求. 根据图 2 的谱图信息得到 12 批波棱瓜子药材的相对峰面 积如表 4, 相似度计算结果见表 5. 表 编号 SC SP 共有峰与非共有峰面积及占总峰面积百分比 SC SC+SP / % 编号 SC SP SC SC+SP / % S S S S S S S S S S S S 注 :SP 非共有峰面积 ;SC 共有峰面积 ;SC/(SC+SP) 共有峰面积占总面积百分比. 编号 表 4 12 批次波棱瓜子特征指纹图谱的相对峰面积 相对峰面积 S1 S2 S S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S 表 5 12 批波棱瓜子药材相似度结果样品 S1 S2 S S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 相似度 由表 5 可知,12 批波棱瓜子药材相似度值均大于 0.96, 说明目前市场上流通的波棱瓜子商品药材质量比较稳定 ; 采用对照品可知 18 号峰为 HerpetolideA, 是指纹谱中峰面积最大的峰, 可能是影响药材质量的最关键峰.. 系统聚类分析将各色谱峰相对于内参比色谱峰的峰面积量化, 运用 SPSS 统计分析软件 对其进行系统聚类分析, 采用欧氏距离 (Euclidean) 作为样品的测度, 见图. 根据图 可以看出 12 批波棱瓜子药材可以分为两大类,S4,S8 聚为一类, 其余聚为一类, 参照样品产

5 第 12 期 王佩龙, 等 : 波棱瓜子药材指纹图谱研究 5 地,S6,S10,S2,S,S5,S1,S7,S9,S12,S11 的产地应该接近西藏 ; 而 S4,S8 的产地接近, 同时一级聚类与 样品间的相似度是一致的 ; 二级聚类聚为一类的 10 个批次样品的差异可能是由于指纹图谱中 8,9,14,15, 16 号共有峰的相对峰面积的差异导致的. 图 波棱瓜子药材指纹图谱的聚类分析 4 讨论 本文采用甲醇提取, 石油醚 乙酸乙酯萃取, 是因为波棱瓜子的有效成分主要为木脂素及香豆素类, 主要集中在乙酸乙酯部分. 试验中考察了甲醇水 甲醇 0.2% 甲酸水 0.2% 甲酸甲醇 0.2% 甲酸水 甲醇 0.1% 醋酸水 以及甲醇 50 mmol 磷酸缓冲盐的不同 ph 等多种流动相系统, 结果表明采用甲醇 50 mmol 磷酸盐缓冲盐 ph=2.6 进行梯度洗脱, 可以确保各共有峰能有好的分离度. 本文采用 RP-HPLC 方法建立了波棱瓜子药材的指纹图谱. 标定了 18 个共有峰, 建立了 7 强峰, 这 7 个强峰代表了波棱瓜子中的主要成分及量 ; 通过相似度分析,12 批波棱瓜子相似度均达到 0.9 以上, 整体来说 12 批波棱瓜子的质量较均一 ; 指纹图谱中的 18 个共有峰相对保留时间符合程度好, 相对面积略有差异, 表明批次间各成分含量的相对比值有所不同, 即使是同一产地, 峰面积比值也有差别 ; 聚类分析结果表明于不同地方购买的药材其产地可能相近或相同. 指纹图谱是目前控制中药材质量最有效 最直观的手段之一. 本文利用 HPLC 法建立了波棱瓜子指纹图谱, 该方法稳定 可靠 重现性好, 可为波棱瓜子药材质量分析 评价与控制提供依据. 参考文献 : [1] 杨竞生. 迪庆藏药 ( 下册 )[M]. 昆明 : 云南民族出版社,1989. [2] 徐冰. 藏药波棱瓜子化学成分研究 [D]. 重庆 : 西南大学,2012. [] 张梅. 藏药波棱瓜子中一个新的倍半降木脂素 [J]. 药学学报,2006,41(7): [4] KAOUADJIM,FAVREBONVINJ.Herpetrione,TrimericLignoidIsolatedfrom Herpetospermum-Caudigerum [J]. TetrahedronLeters,198,24(52): [5] KAOUADJIM,FAVREBONVINJ.Herpepentol,aNew PentamericLignoidIsolatedfrom Herpetospermum-Caudigerum Wal[J].TetrahedronLeters,1984,25(45): [6] KAOUADJIM,FAVREBONVINJ.Herpetol,aNew DimericLignoidfrom Herpetospermum-Caudigerum Wal[J]. ZeitschriftFurNaturforschungC-aJournalofBiosciences,1984,9(-4): [7] KAOUADJIM,FAVREBONVINJ,MARIOTTE A M.Herpetal,BenzofuranIsolatedfrom Herpetospermum-Caudigerum [J].Phytochemistry,1978,17(12): [8] KAOUADJIM,FAVREBONVINJ,SARRAZIN F,etal.Herpetetrone,AnotherTetramericLignoidfrom Herpeto-

6 6 西南师范大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 8 卷 spermum-caudigerumseeds[j].journalofnaturalproducts,1987,50(6): [9] KAOUADJIM,PIERACCINIE.Herpetetradione,aNew TetramericLignoidIsolatedfrom Herpetospermum-Caudigerum Wal[J].TetrahedronLeters,1984,25(45): [10] 张 梅. 藏药波棱瓜子治疗肝病有效成分的研究 [D]. 成都 : 成都中医药大学,200. [11] 方清茂, 张 浩, 曹 毓. 藏药波棱瓜子提取物对肝损伤大鼠的抗氧化作用 [J]. 华西药学杂志,2008,2(2): [12] 陈 兴. 波棱瓜子提取物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用 [J]. 成都中医药大学学报,2008,1(): [1] 丛龙波. 藏药波棱瓜子抗肝炎药效物质基础研究 [J]. 医学研究杂志,2007,6(8). [14] 邹 亮. 中药补阳还五汤的 HPLC 指纹图谱研究 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2009,1(4). [15] 曾礼娜, 夏之宁, 颜 磊. 槐米的高效毛细管电泳指纹图谱研究 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2008. OnHPLCFingerprintofHerbaHerpetospermumCaudigerum Wal WANGPeiḻong 1, YANGLiẖua 1, LING HU-lang 1, ZOU Yaṉlin 1, LAN Xiaoẕhong 2, LIAOZhiẖua, CHEN Min 1 1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,KeyLaboratoryonLuminescence andreal-timeanalysis,chongqing400715,china; 2. AgriculturalandAnimalHusbandryColege,TibetUniversity,NyingchiofTibet860000,China;.SchoolofLifeSciences,SouthwestUniversityChongqing400715,China Abstract:ThispaperdealswiththeestablishmentofthechromatographicfingerprintforHerbaHerpetospermumcaudigerum WalbyRP-HPLCby meansofmethanolextractpartitionedwithpetroleumether andethylacetatesuccessively.fractionofethylacetatehasthenbeendissolvedin methanol,preparation ofsamplesolutionandanalyzedbyrp-hplcwithawondasilc18column(4.6mm 150mm,5μm), GradientelutionwithA (watercontaining50mmolpotassiumdihydrogenphosphatebufersaltph=2.6)- B (methanol)at25,andmonitoredwithdaddetectorat254nm.theflowrateis0.7 ml/min,and samplevolumeinjectedwas5μl.thechromatogramsofdiferentbatchesofherbah.caudigerum have beencomparedbythesoftwareofsimilarityevaluationsystemforchromatographicfingerprintoftcm (Version2004A).Resultsshowthat HPLC Fingerprintof Herba H.caudigerum hasbeenestablished withherpetolideaasthereferencecompound.eighteenmutualpeakshavebeenselectedasthefingerprint peaksofh.caudigerum Wal.ItcanbeconcludedthatthemethodcanbeprovidedasascientificandeffectivewayforqualitycontrolofH.caudigerum. Keywords:Herpetospermumcaudigerum Wal;HPLCFingerprint;herpetolideA 责任编辑 汤振金

7 第 12 期 王佩龙, 等 : 波棱瓜子药材指纹图谱研究 7

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