基于指纹图谱的银翘解毒颗粒质量评价 董婷 1,2, 周建良 2, 赵维良 2, 张文婷 2*, 黄琴伟 ) 2* (1. 浙江中医药大学, 杭州 ;2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 摘要 : 目的采用 HPLC 建立银翘解毒颗粒指纹图谱, 整体评价该制剂质量 方法采用

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1 基于指纹图谱的银翘解毒颗粒质量评价 董婷 1,2, 周建良 2, 赵维良 2, 张文婷 2*, 黄琴伟 ) 2* (1. 浙江中医药大学, 杭州 ;2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 摘要 : 目的采用 HPLC 建立银翘解毒颗粒指纹图谱, 整体评价该制剂质量 方法采用 Waters CORTECS TM C 18 色谱柱 (4.6 mm 150 mm,2.7 μm), 以乙腈为流动相 A,0.1% 甲酸为流动相 B, 梯度洗脱, 流速为 0.5 ml min, 柱温为 25, 检测波长为 245 nm; 采用 LC-MS 对银翘解毒颗粒物质基础进行解析并对色谱峰进行归属 ; 运用中药色谱指纹图谱相似 度评价系统软件, 对 28 家生产企业的 28 批样品进行评价 结果建立了银翘解毒颗粒的 HPLC 指纹图谱 ; 检测 到 34 个成分, 鉴定了其中 30 个成分, 特征峰分别归属于 牛蒡子 薄荷 荆芥 和淡豆豉 7 味药 ; 28 批样品的值为 0.77~0.99 结论评价结果发现个别企业存在低劣饮片投料或工艺过程控制不严等违规生 产现象 建立的指纹图谱方法便捷 特征性强 重复性好, 为综合评价和控制产品质量提供了依据 关键词 : 银翘解毒颗粒 ; 指纹图谱 ; ; 质量评价 中图分类号 :R284.1 文献标志码 :B 文章编号 : (2018) DOI: /j.cnki.issn 引用本文 : 董婷, 周建良, 赵维良, 等. 基于指纹图谱的银翘解毒颗粒质量评价 [J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(9): Quality Evaluation of Yinqiao Jiedu Granules by HPLC Fingerprint DONG Ting 1,2, ZHOU Jianliang 2, ZHAO Weiliang 2, ZHANG Wenting 2*, HUANG Qinwei 2* (1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou , China; 2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish the HPLC fingerprint of Yinqiao Jiedu granules for the quality evaluation and control. METHODS HPLC was performed on a Waters CORTECS TM C 18 column(4.6 mm 150 mm, 2.7 μm) at 25. The mobile phase was acetonitrile-water(containing 0.1% formic acid) with gradient elution, with the flow rate as 0.5 ml min 1 and the detection wavelength as 245 nm. The characteristic peaks were identified by HPLC/QQQ-MS. Similarity of 28 batches samples from 28 nanufacturing enterprise were evaluated by chromatographic fingerprint similarity evaluation software. RESULTS The fingerprint of Yinqiao Jiedu granules was established and 34 peaks were detected, 30 of them were identified. The detected peaks belonged to Lonicerae Japonicae Flos, Forsythiae Fructus, Arctii Fructus, Menthae Haplocalycis Herba, Schizonepetae Herba, Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma and Sojae Semen Praeparatum, respectively. The similarity values of 28 batches samples ranged from 0.77 to CONCLUSION Some illegal production phenomena are found with raw materials of poor quality or less amount, and lax process control, etc. The method of fingerprint is simple, specific and reproducible. This study provides the basis of comprehensive evaluation and quality control. KEY WORDS: Yinqiao Jiedu granules; fingerprint; similarity analysis; quality evaluation 银翘解毒颗粒源自中医经典著作 温病条辨 ( 清 吴瑭 ) 中的银翘散, 由 薄荷 荆芥 淡豆豉 牛蒡子 ( 炒 ) 桔梗 淡竹叶和等 9 味中药组成, 具有疏风解表 清热解毒的作用, 用于风热感冒, 症见发热头痛 咳嗽口干 咽喉疼痛 银翘解毒颗粒为 2015 年国家抽验品种, 质量标准收载于中国药典 2010 年版一部 [1], 包括薄荷 荆芥 牛蒡子的 TLC 鉴别和以绿原酸为指标的含量测定 查阅国家局数据库, 全国有 70 家生产企业, 共 76 个批准文 号, 此次抽验评价收集到 28 家在生产企业的样品 银翘解毒颗粒的化学成分复杂, 而现行标准质控项目比较单一, 无法整体反映该制剂的化学组分特征并评价不同生产企业的产品质量 指纹图谱是基于图谱的整体信息, 用于中药质量的整体评价, 确保其内在质量的均一和稳定 [2] 本研究拟通过建立反映整体信息的指纹图谱, 为全面 有效评价和控制银翘解毒颗粒质量奠定实验基础 1 仪器与试剂 LC-20ADXR 高效液相色谱仪 ( 日本 Shimadzu 基金项目 :2015 年国家药品抽验项目 * 作者简介 : 董婷, 女, 中药师 Tel: ( dongting0915@163.com 通信作者 : 张文婷, 女, 博士, 主任中药师 Tel: ( leozhwt@163.com 黄琴伟, 女, 硕士, 副主任中药师 Tel: ( qingwei-h@163.com 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No

2 公司, 包括四元低压梯度泵 在线脱气机 自动进样器 柱温箱 PDA 检测器和 Lab solution 色谱工作站 );Agilent LC 6430 QQQ 液质联用仪 ( 美国 Agilent 公司, 包括 1260 液相色谱仪 二元高压梯度泵 在线脱气机 自动进样器 柱温箱 UV 检测器和三重四极杆质谱检测器 );Elmasonic P 超声波清洗仪 ( 德国 Elma 公司 );XPE-205 型分析天平 (Mettler Toledo);Milli-Q Advantage A 超纯水机 ( 美国 Millipore 公司 ) 新绿原酸 ( :PA0819RA13; 纯度 >98%) 隐绿原酸 ( :ZF0226BA14; 纯度 >98%) 异绿原酸 A( :H31D5X1; 纯度 >98%) 异绿原酸 B( :KA0410CA14; 纯度 >98%) 异绿原酸 C( :P28D4S1; 纯度 >98%) 异素( : Z02M3L 素( :ZM0314BD14) 均购于上海源叶生物科技有限公司 ; 绿原酸 ( : ; 纯度 :96.6%) 牛蒡苷( : ) 苷( : ) 酯苷 A( : ) 酯苷 B( : ; 纯度 :93.5%) 酸铵( : ) 苷( : ; 纯度 :93.7%) 木犀草苷( : ; 纯度 :94.9%) 马钱苷( : ; 纯度 :99.2%) 咖啡酸( : 迷迭香酸 ( : ) 大豆苷元( : ) 染料木素( : 芦丁 ( : ) 蒙花苷( : ) 均购于中国食品药品检定研究院 22 种对照品除大豆苷元为鉴别用外, 其余均为含量测定用 28 家不同生产企业的 28 批银翘解毒颗粒样品分别为 ,150702, ,150409, ,150103,141003,150605,150702, ,PC001,150707,141104, , , ,150315,150802, , , , , , , ,150701, , 分析样品所用乙腈 甲酸均为色谱纯 ( 德国 Merck 公司 ); 制备样品所用甲醇为分析纯 ( 国药集团化学试剂有限公司 ); 水为超纯水 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱 :Waters CORTECS TM C 18 (4.6 mm 150 mm,2.7 μm); 流动相 : 乙腈 (A)-0.1% 甲酸 (B) 梯度洗脱 (0~20 min,5% 15%A;20~45 min,15% 22%A ; 45~80 min, 22% 52%A) ; 流速 : 0.5 ml min ; 柱温 :25 ; 检测波长 :245 nm; 进样量 :10 μl 2.2 质谱条件离子源 : 电喷雾离子源正离子模式 (ESI + ) 和负离子模式 (ESI ); 扫描方式 :Scan; 离子扫描范围 : m/z 100~1 200; 干燥氮气流速 :9 L min ; 干燥气体温度 :350 ; 雾化室压力 :241.3 kpa; 毛细管电压 :4 000 V; 碎片电压 :110 V 2.3 溶液的制备 对照品溶液的制备取新绿原酸 隐绿原酸 异绿原酸 A 异绿原酸 B 异绿原酸 C 异素 素 绿原酸 牛蒡苷 苷 酯苷 A 酯苷 B 酸铵 苷 木犀草苷 马钱苷 咖啡酸 迷迭香酸 大豆苷元 染料木素 芦丁 蒙花苷适量, 精密称定, 加 50% 甲醇分别制成每 1 ml 含约 20 µg 的定性用对照品溶液 供试品溶液的制备取本品 10 袋, 研细, 取约 1.5 g( 规格 : 每袋 15 g) 1.2 g( 规格 : 每袋 12 g) 或 0.5 g( 规格 : 每袋 5 g), 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入 50% 甲醇 25 ml, 超声处理 ( 功率 250 W, 频率 40 khz)30 min, 放冷, 用 50% 甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得 2.4 指纹图谱方法学考察 仪器精密度试验取样品 ( :150702)1 份, 按 项下方法制备供试品溶液, 按 2.1 项下色谱条件连续进样 6 次, 记录色谱图, 并按国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱评价系统 (2012 版 ) 对其进行评价, 采用全谱峰匹配, 以夹角余弦法计算, 均为 1.000, 表明仪器的精密度良好 重复性试验取样品 ( :150702)6 份, 按 项下方法制备供试品溶液, 按 2.1 色谱条件测定, 记录色谱图, 并按国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱评价系统 (2012 版 ) 对其进行评价, 采用全谱峰匹配, 以夹角余弦法计算, 均为 1.000, 表明该方法具有较好的重复性 稳定性试验取供试品溶液 ( : )1 份, 按 2.1 项下色谱条件, 分别在 0, 1338 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No.9 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期

3 6,13,21,26,36 和 43 h 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 并按国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱评价系统 (2012 版 ) 对其进行评价, 以夹角余弦法计算, 与生成的对照色谱图比较, 各色谱峰的 RSD 为 0.3%, 结果表明供试品溶液在 43 h 内稳定 特征峰指认采用 LC-MS 技术, 按 2.1 项下色谱条件和 2.2 项下质谱条件对银翘解毒颗粒的物质基础进行解析, 结果见图 1 共检测到 34 个成分, 结合对照品保留时间 紫外吸收光谱 图 准分子离子及相关药味的分析鉴定了其中的 30 个成分并进行色谱峰的药味归属, 分别归属于 7 味药, 结果见表 测定 28 批银翘解毒颗粒按 项下方法制备供试品溶液, 按 2.1 项下色谱条件进行分析, 记录色谱图, 并以 28 批样品的色谱图为基础, 采用中药色谱指纹图谱评价系统软件 (2012 版 ) 建立共有模式, 采用全谱峰匹配, 计算 28 批样品与共有模式间的, 结果见表 2, 图 2 表 1 银翘解毒颗粒 HPLC 指纹图谱共有峰的指认与归属 Tab. 1 Identified compounds in the HPLC fingerprints of Yinqiao Jiedu granules 准分子离子 峰号 t R /min 分子量 正离子 负离子 化合物 主要归属 [M+Na] + 375[M-H] 2- 甲氧基 -3,4,5- 三羟基苯乙醇苷 [M+Na] +,731[2M+Na] + 353[M-H] [3] 新绿原酸 [M+Na] + 461[M-H] 酯苷 E [3] [M+Na] +,731[2M+Na] + 353[M-H] 绿原酸 [M+Na] + 389[M-H] 马钱苷 [M+Na] +,731[2M+Na] + 353[M-H] 隐绿原酸 [M+H] + 179[M-H] 薄荷 咖啡酸荆芥 牛蒡子 [M+Na]+ 401[M-H] 7-O-ethyl sweroside [4] [M+Na] + 403[M-H] [5] 断氧化马钱苷 [M+Na] + 623[M-H] 酯苷 H/I [3] [M+Na] + 417[M-H] 苷 [M+H] + 609[M-H] 芦丁 薄荷 [M+H] + 755[M-H] 酯苷 B [M+Na] + 623[M-H] 酯苷 H/I [3] [M+Na] + 623[M-H] 酯苷 A [M+H] + 447[M-H] 木犀草苷 荆芥 [M+H] + 461[M-H] N.I. ( 未知 ) 荆芥 [M+Na] +, 1 063[2M+Na] + 519[M-H] [6] 松脂素 -β-d- 葡萄糖苷 [M+Na] +, 517[M+ H] + 515[M-H] 异绿原酸 B [M+Na] +, 517[M+ H] + 515[M-H] 异绿原酸 A [M+Na] +, 517[M+ H] + 515[M-H] 异绿原酸 C [M+Na] + 359[M-H] 迷迭香酸 薄荷 荆芥 [M+H] + 461[M-H] N.I. ( 未知 ) 荆芥 [M+Na] + 253[M-H] 大豆苷元 淡豆豉 [M+Na] +, 1 091[2M+Na] + 579[M+HCOO] 苷 [M+H] + 255[M-H] 素 [M+Na] + 579[M+HCOO] 牛蒡苷 牛蒡子 [M+Na] + 637[M+HCOO] 蒙花苷 薄荷 [M+Na] + 269[M+HCOO] 染料木素 淡豆豉 [M+H] +, 861[M+Na] + 837[M-H] N.I. ( 未知 ) [M+Na] +, 1 095[2M+Na] + 535[M-H] 牛蒡酚 A 或异牛蒡酚 A [7] 牛蒡子 [M+H] + 255[M-H] 异素 [M-NH 3 +Na] +, 823[M-NH 3 +Na] + 821[M-NH 3 -H] 酸铵 [M+H] + 843[M-H] N.I. ( 未知 ) 注 : 经对照品比对鉴定 Note: Identified by standards. 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No

4 图 1 银翘解毒颗粒一级质谱总离子流图(A)和 HPLC-UV 指纹图谱(B) Fig. 1 Total ion chromatogram(tic) (A) and HPLC-UV fingerprint (B) of Yinqiao Jiedu granules 表 2 28 批样品 Tab. 2 Determination results of similarity of 28 batches of samples PC 图 2 银翘解毒颗粒样品色谱图 Fig. 2 HPLC chromatograms of Yinqiao Jiedu granules 1340 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No.9 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期

5 3 讨论 3.1 检测波长的选择 采用 PDA 检测器对银翘解毒颗粒进行紫外扫 描,245 nm 波长下, 基线平稳, 色谱峰信息量较 大且主峰相应较高, 故选择 245 nm 作为检测波长 3.2 色谱柱的选择 本研究比较了 Agilent ZORBAX SB C 18 (4.6 mm 250 mm,5 μm) Diamonsil C 18 (4.6 mm 250 mm, 5 μm) Kromasil SB C 18 (4.6 mm 250 mm,5 μm) Waters CORTECS TM C 18 (4.6 mm 150 mm,2.7 μm) Agilent Poroshell 120 EC-C 18 (4.6 mm 150 mm,2.7 μm) Dikma C 18 (4.6 mm 150 mm,2.7 μm)6 种色谱柱, 结果小粒径色谱柱 分离效果更好 分析时间短且流速低, 有效节约资源 供试品中各主要色谱峰在上述 3 根小粒径色谱柱上均分离良好, 具有较好的色谱柱耐用性 3.3 柱温的选择本研究考察了 25,30,35,40 的柱温对色谱分离的影响, 结果发现 25 时供试品中各主要色谱峰的分离效果最佳, 故色谱条件中确定柱温为 物质基础的研究在指纹图谱色谱条件的基础上, 进一步采用 LC-MS 技术对银翘解毒颗粒中的物质基础进行解析, 检测了 34 个主要成分, 鉴定了其中 30 个, 并对每个成分进行了药味归属, 分别归属于 牛蒡子 薄荷 荆芥 和淡豆豉 7 味药, 覆盖全处方的 78%, 处方中的淡竹叶和桔梗在该色谱条件下未见主要特征峰, 物质基础的研究弥补了银翘解毒颗粒指纹图谱的模糊性属性, 也为其安全用药及深入研究提供了基础保障 3.5 指纹图谱的建立及在银翘解毒颗粒评价中的应用本研究以 28 批不同生产企业的色谱图为基础, 生成了标准对照指纹图谱, 并对 28 批样品的进行测定, 考虑到处方中药味多, 易受种种不确定因素影响, 故暂定的限度为 0.85, 结果有 4 批 ( 即 4 家生产企业 ) 不合格 为了进一步评价现阶段全国市场上的银翘解毒颗粒质 量现状, 对抽验的 28 家生产企业的 191 批样品进行了测定, 采用全谱峰匹配, 以夹角余弦法计算, 计算 191 批样品与标准对照指纹图谱的, 为 0.70~0.99, 有 50 批次不合格, 总合格率为 74% 从结果可见, 多数企业生产的样品较高, 表明整体上各生产企业对原药材来源 工艺参数 储存等可能影响产品质量的环节做到了规范有序, 较好地保证了批间的稳定性和一致性, 但仍有一些企业不同批次样品的差距较大, 分析原因可能是生产控制不严 工艺参数不稳定导致 另对不合格的样品进行分析发现, 其供试品溶液的各个主峰明显低于标准对照指纹图谱, 提示相关企业可能存在低质饮片投料 少投料或过程控制不当等现象, 下阶段有必要进一步从量上分析银翘解毒颗粒原料与制剂质量的相关性 综上分析, 所建立的银翘解毒颗粒指纹图谱能较好地从整体上评价其质量, 为更有效地保证制剂质量提供了研究基础 REFERENCES [1] 中国药典. 一部 [S]. 2010: [2] ZHU M, CHEN B L, SHI S M. Application of fingerprint technology on traditional Chinese medicine in Chinese Pharmacopoeia(2015 Edition) Volume [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2016, 33(5): [3] ZHANG C X, LIU S X, ZHAO Y M, et al. Analysis on chemical constituents from Forsythiae Fructus by HPLC-Q-TOF-MS [J]. Chin Tradit Herb Drugs( 中草药 ), 2016, 47(12): [4] ZHANG L Y, LI Y B, LI L X, et al. Chemical constituents of Lonicera japonica Thunb. by RRLC-Q-TOF/MS [J]. Cent South Pharm( 中南药学 ), 2012, 10(3): [5] ZHU H, CUI L, LIU Q, et al. Determination of chemical constituents in Lonicera maackii with HPLC-DAD-ESI-Q- TOF/MS [J]. Chin Tradit Herb Drugs( 中草药 ), 2017, 48(1: [6] LUO B, ZHANG J Z. Study on chemical constituents of extract of Forsythia suspense [J]. Chin J Exp Tradit Med Form( 中国实验方剂学杂志 ), 2013, 19(3): [7] QIN Z B, DING L F, LI L, et al. Chemical constituents of the seed of Arctium lappa L.[J]. Nat Prod Res Dev( 天然产物研究 与开发 ), 2015(12): 收稿日期 : ( 本文责编 : 曹粤锋 ) 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No