2017-9中国药理学通报封面

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1 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9):1227~ 网络出版时间 : :47 网络出版地址 :htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html 汉防已甲素抑制人结肠癌细胞增殖与 TGF β1 的关联机制研究任文艳 1,2, 陈前昭 1,2, 周林云 1,2, 邵英 1,2, 廖云鹏 1,2, 王涵 1,2, 朱茄慧 1,2 1,2, 何百成 (1. 重庆医科大学药理学教研室,2. 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室, 重庆 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) 中国图书分类号 :R 332;R284.1;R329.24;R ; R977 6 摘要 : 目的研究汉防已甲素 (tetrandrine,tet) 抑制人结肠癌细胞增殖与 TGF β1 的关系方法利用细胞增殖抑制实验定量 PCR 流式细胞术 AnnexinV EGFP 染色以及 Westernblot 实验, 分析 Tet 对 HCT116 细胞增殖和凋亡的影响 ; 利用定量 PCR Westernblot 细胞增殖抑制和免疫荧光实验, 分析在结肠癌细胞中 Tet 抗结肠癌作用与 TGF β1 的关系, 以及 TGF β1 介导 Tet 抗结肠癌作用可能的分子机制结果与对照组相比,Tet 抑制 HCT116 细胞增殖诱导 G 1 阻滞和细胞凋亡 ;Tet 增加 TGF β1 在 HCT116 细胞中的 mr NA 和蛋白表达水平,TGF β1 增强 Tet 抑制 HCT116 细胞增殖和促进其凋亡, 抑制 TGF β1 明显减弱 Tet 的这种作用 ; Tet 降低 Akt1/2/3 的磷酸化水平, 抑制 PI3K 增强 Tet 对结肠癌细胞增殖的抑制作用 ;TGF β1 增强 Tet 对 Akt1/2/3 磷酸化的抑制作用, 而 Tet 降低 Akt1/2/3 磷酸化水平的作用可被 TGF β1 抑制剂部分逆转 ; 沉默 PTEN 促进 Akt1/2/3 磷酸化, 但 TGF β1 能翻转沉默 PTEN 对 Akt1/2/3 磷酸化的促进作用结论 Tet 能抑制结肠癌细胞增殖和促进凋亡, 机制可能与其通过促进 TGF β1 表达, 抑制 Akt1/2/3 磷酸化有关关键词 : 汉防已甲素 ; 结肠癌 ;HCT116 细胞 ;TGF β1;pi3k/ Akt;PTEN 结肠癌是一种常见的恶性消化系统肿瘤, 具有较高的死亡率, 仅次于肺癌和肝癌 [1] 结肠癌的发病原因与多种因素有关近年来, 随着对结肠癌发病原因的深入研究, 其临床治疗效果有了较大的提高, 尤其是靶向治疗药物的应用, 但结肠癌的治疗效果及预后总体上仍不理想 [2] 治疗结肠癌目前所面临的主要挑战包括传统化疗药物的严重毒性反应癌细胞转移和耐药因此, 临床仍急需开发新型收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ) 作者简介 : 任文艳 (1993-), 女, 硕士生, 研究方向 : 分子药理学,E mail: @qq.com; 何百成 (1972-), 男, 博士, 教授, 研究方向 : 分子药理学和干细胞生物学, 通讯作者,E mail:100869@cqmu.edu.cn 有效的药物, 以提高结肠癌的治疗效果传统中药及其来源的有效单体成份是抗肿瘤药物的重要来源之一, 如喜树碱及其衍生物等早已用于临床治疗结肠癌 [3] 汉防己甲素( 即汉防己碱,tetrandrine,Tet) 来源于防己科植物粉防己 ( 汉防己,Stephaniatetran dras.moore) 的干燥根, 属于二苄基异喹啉类生物碱 Tet 是一种钙通道阻滞剂, 临床可用于治疗高血压关节炎神经及肌肉痛等 [4] 近年研究表明, Tet 还具有抗肿瘤作用, 能抑制多种肿瘤细胞增殖并促进其凋亡, 如肝癌乳腺癌结肠癌等, 但介导这种作用的具体分子生物学机制目前尚不十分清楚 [5-6] 本研究发现,Tet 能抑制结肠癌细胞增殖和促进凋亡, 这种作用可能与其上调 TGF β1 表达进而抑制 PI3K/Akt 信号有关, 但具体分子机制尚需进一步分析本研究结果有利于促进将 Tet 作为抗肿瘤药物或辅助抗肿瘤药物用于治疗结肠癌, 提高结肠癌的治疗效果 1 材料与方法 1.1 试剂及细胞培养 HCT116 细胞购自美国菌种保藏中心 (American Type Culture Colection, ATCC) 汉防已甲素购自西安昊轩生物科技有限公司 ; 实验所用抗体购自 SantaCruzBiotechnology 公司 ;TGF β1 抑制剂 (LY364947) 购于赛力克公司 (Seleck) HCT116 细胞的培养条件为 :DMEM 培养基 ( 高糖, 含 10% 胎牛血清 100kU L -1 青霉素以及 0 1g L -1 链霉素 ),5% CO 2 及实验设计及分组将 HCT116 细胞按实验设计分为对照组和实验组 Tet 用二甲基亚砜 (dimeth ylsulfoxide,dmso) 溶解, 实验组细胞按实验设计, 用不同浓度 Tet 进行处理 ; 对照组细胞采用体积相同的 DMSO 进行处理 1.3 重组腺病毒载体构建本实验所用重组腺病毒采用 AdEasy 系统构建 [7] 用 PCR 扩增目的基因编码序列并克隆到穿梭质粒, 或将人工合成的干扰 RNA 片段连接到穿梭质粒将测序正确的穿梭质粒线性化后, 与 BJ5183 AdEasy 细菌进行重组, 然后将重组的质粒线性化并转染到 HEK 293 细胞包装病毒, 得到目的基因或干扰 RNA 的重组腺病毒即

2 1228 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) GFP 重组腺病毒 (AdGFP) TGF β1 重组腺病毒 (Ad TGF β1) 和 PTEN 干扰 RNA 重组腺病毒 (Ad sipten), 其中 AdGFP 作为空白对照 1.4 细胞增殖能力检测采用 CCK 8 试剂盒 (# C008 3, 七海生物 ) 检测细胞增殖能力将生长良好的 HCT116 细胞接种到 96 孔板中, 细胞密度为 / 孔细胞壁贴后用不同浓度 Tet 或相同体积的 DMSO 处理, 分别于 h 进行检测每孔加 10μLCCK 8 试剂并孵育 4h, 然后用酶标仪测定吸光度, 测定波长为 450nm 每组实验重复 3 次 1.5 细胞周期分析将 HCT116 均匀种于 6 孔板, 待细胞贴壁后按预试结果, 用不同浓度 Tet(1 2 4 μmol L -1 ) 或相同体积 DMSO 处理细胞 48h 后收集细胞, 用 PBS(4 ) 重悬并离心 (800r min -1 5min,2 次 ) 用预冷的 70% 50% 以及 30% 乙醇进行固定, 并用 PBS(4 ) 洗涤加入 1mLPI(20 g L) 溶液 ( 含 RNA 酶,1g L -1 ) 孵育 30min 最后通过流式细胞仪进行周期分析每组实验重复 3 次 1.6 AnnexinV EGFP 检测凋亡将生长良好的 HCT116 均匀种于 24 孔板, 细胞贴壁后, 按实验设计用不同浓度 Tet(1 2 4μmol L -1 ) 或相同体积 DMSO 处理细胞 24h 后将细胞清洗 2 次, 然后每孔加入 500μL 缓冲液和 2μLAnnexinV EGFP 融合蛋白, 室温下孵育 5min, 然后丢弃缓冲液, 并用 PBS(4 ) 清洗细胞 2 次最后利用荧光显微镜摄像每组实验重复 3 次 1.7 RNA 提取及 real timepcr 实验将细胞种于 T25 培养瓶中, 贴壁后, 按实验设计加入相应的处理因素采用异硫氰酸胍 - 酚 - 氯仿法提取总 RNA, 通过逆转录反应 (reversetranscription,rt) 制备 cdna, 然后通过 real timepcr 检测目的基因表达情况实验所用 PCR 引物如下 :GAPDH 上游引物 5 CAACGAATTTGGCTACAGCA 3, 下游引物 5 AGGGGAGATTCAGTGTGGTG 3 ;TGF β1 上游引物 5 CCCACAACGAAATCTATGACAA 3, 下游引物 5 AAGATAACCACTCTGGCGAGTC 3 ;PCNA 上游引物 5 GGCTCTAGCCTGACAAATGC 3, 下游引物 5 GCCTCCAACACCTTCTTGAG 3 每组实验重复 3 次 1.8 Westernblot 实验将生长良好的 HCT116 细胞种于 6 孔板, 按实验设计, 将细胞用不同浓度 Tet (1 2 4μmol L -1 ) 或相同体积 DMSO 处理于相应时间点提取总蛋白, 采用 BCA 法测定样品总蛋白浓度然后按常规 Westernblot 实验方法进行实验, 最后利用化学发光试剂 (ECL) 显影并采集图像每组实验重复 3 次 1.9 免疫荧光实验将细胞均匀种于 24 孔板中, 贴壁后, 按实验设计用不同重组腺病毒处理细胞 48h 后, 将细胞用 4% 甲醛固定,PBS 清洗后, 用 0 3% 的 TritonX 100 处理 10min PBS 清洗后用山羊血清封闭 20min, 然后用一抗 (p Akt1/2/3) 孵育过夜 (4 ) PBS 清洗后, 再孵二抗 (FITC 标记 ) 用 PBS 清洗后加 DAPI(100μg L -1 ) 孵育 10min PBS 清洗后封片, 荧光显微镜下采集图像每组实验重复 3 次 1.10 统计学分析采用 SPSS11 0 软件进行统计学分析, 实验数据以 x±s 珋表示利用 SNK 检验法进行组间比较 2 结果 2.1 Tet 对 HCT116 细胞增殖的影响 CCK 8 测试结果显示,Tet 呈浓度和时间依赖性抑制 HCT116 细胞增殖 (Fig1A) 定量 PCR 分析结果显示,Tet 明显呈浓度依赖性抑制 PCNA 表达 (Fig1B) 细胞周期分析结果显示,Tet 明显增加 G 1 期细胞比例而降低 S 期细胞比例, 表明 Tet 能诱导细胞发生 G 1 期阻滞 (Fig1C) 结果提示,Tet 对 HCT116 细胞增殖具有明显抑制作用 2.2 Tet 对 HCT116 细胞凋亡的影响诱导肿瘤细胞凋亡是大多数抗肿瘤药物的一个重要特点本研究就 Tet 影响 HCT116 细胞凋亡的情况进行分析 AnnexinV EGFP 染色结果显示,Tet 在 2μmol L -1 时已能明显诱导细胞凋亡 (Fig2A) Westernblot 分析结果显示,Tet 明显呈浓度依赖性增加 HCT116 细胞中 Bad 的蛋白水平, 下调 Bcl 2 的蛋白水平 (Fig 2B) 结果提示,Tet 能促进 HCT116 细胞凋亡 2.3 Tet 对 HCT116 细胞中 TGF β1 表达水平的影响 TGF β 对细胞增殖与分化具有重要调节作用文献报道 [8],TGF β1 与结肠癌关系密切 Tet 能明显抑制 HCT116 细胞增殖和促进凋亡, 但这种作用是否与 TGF β1 有关, 尚不清楚定量 PCR 分析结果显示,Tet 在 HCT116 细胞中能明显促进 TGF β1 的 mrna 表达 (Fig3A) Westernblot 分析结果显示,Tet 能明显增加 HCT116 细胞中 TGF β1 的蛋白水平 (Fig3B), 并且 TGF β1 在几种结肠癌细胞中的表达水平明显高于 FHC 细胞 (Fig3C) 结果提示,Tet 在结肠癌细胞中能促进 TGF β1 表达, 并且可能与 Tet 抗结肠癌作用有关 2.4 TGF β1 对 Tet 抑制 HCT116 细胞增殖和促进其凋亡作用的影响为明确 TGF β1 对 Tet 抑制

3 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) 1229 Fig1 EfectsofTetonproliferationofHCT116cels A:CCK 8asayresultsshowedtheefectofTetonproliferationofHCT116cels;B:Real timepcranalysisresultshowedtheefectoftetonthe mrnalevelofpcnainhct116cels;c:flowcytometeryanalysisresultsshowedtheefectoftetoncelcycleinhct116cels. P<0 05, P< 0 01vscontrol. Fig2 EfectsofTetonapoptosisinHCT116cels A:AnnexinV EGFPstainingresultsshowedtheefectofTetonapoptosisinHCT116cels;B:WesternblotasayresultsshowedtheefectofTeton theproteinlevelofbadandbcl 2inHCT116cels

4 1230 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) Fig3 EfectsofTetonexpresionofTGF β1inhct116cels A:Real timepcranalysisresultsshowedtheefectoftetonthemrnaexpresionoftgf β1inhct116cels. P<0 05, P<0 01vscon trol;b:westernblotanalysisresultsshowedtheefectoftetontheproteinleveloftgf β1inhct116cels;c:westernblotanalysisresultsshowedthe endogenousproteinleveloftgf β1infhcandthecommericalavailablecoloncancercellines. HCT116 细胞增殖和促进其凋亡作用的影响, 本研究利重组腺病毒介导的 TGF β1 外源性表达和 TGF β1 抑制剂进行相应的实验结果显示, 外源性过表达 TGF β1 抑制 HCT116 细胞增殖, 并增强 Tet 对 HCT116 细胞的增殖抑制作用 ;TGF β1 抑制剂对 HCT116 细胞增殖无明显影响, 但可明显减弱 Tet 对 HCT116 细胞增殖的抑制作用 (Fig4A) Western blot 分析结果显示, 外源性高表达的 TGF β1 虽对 Tet 诱导 Bad 蛋白水平增加的作用无明显影响, 但能明显降低 Bcl 2 的蛋白水平 (Fig4B); 抑制 TGF β1 能减弱 Tet 对 Bad 表达的促进作用, 并部分逆转 Tet 对 Bcl 2 表达的抑制作用 (Fig4C) 结果提示, Tet 抑制 HCT116 细胞增殖和促进细胞凋亡可能部分通过其促进 TGF β1 表达介导, 但 TGF β1 抑制 HCT116 细胞增殖的机制尚不清楚 2.5 PI3K/Akt 对 Tet 抑制 HCT116 细胞增殖作用的影响 PI3K/Akt 信号是调节细胞存活与抗凋亡的重要信号, 也是多种抗肿瘤药物的重要靶点之一因此, 本研究对 Tet 抑制 HCT116 细胞增殖与促进凋亡是否与该信号有关进行分析 Westernblot 分析结果显示,Tet 对 Akt1/2 的总蛋白水平无明显影响, 但能明显降低 Akt1/2/3 的磷酸化水平 (Fig 5A) CCK 8 测试结果显示, 抑制 PI3K/Akt 信号, 明显增强 Tet 对 HCT116 增殖的抑制作用 (Fig5B) 结果提示,Tet 对 HCT116 细胞的增殖抑制作用可能与抑制 PI3K/Akt 信号有关 2.6 TGF β1 和 Tet 对 HCT116 细胞中 Akt1/2/3 磷酸化的影响 Tet 能抑制 PI3K/Akt 信号并促进 TGF β1 表达, 但 Tet 对 PI3K/Akt 信号的抑制作用是否与其促进 TGF β1 表达有关尚不清楚 Western blot 结果显示, 外源性过表达 TGF β1 能明显增强 Tet 对 Akt1/2/3 磷酸化的抑制作用 (Fig6A), 而抑制 TGF β1 则部分逆转 Tet 抑制 Akt1/2/3 磷酸化 (Fig6B) 免疫荧光分析结果显示, 外源性过表达 TGF β1 降低 Akt1/2/3 的磷酸化水平, 沉默 PTEN 明显促进 Akt1/2/3 的磷酸化 ; 但沉默 PTEN 对 Akt1/2/3 磷酸化的促进作用能明显被外源性过表达 TGF β1 取消 (Fig6C) 结果提示,TGF β1 介导 Tet 抑制 HCT116 细胞的增殖和促进凋亡作用可能与其抑制 PI3K/Akt 信号有关 3 讨论结肠癌是临床中常见的一种消化系统恶性肿瘤, 具有较高的发病率和致死率, 仅次于肝癌肺癌和胃癌, 每年全球约有近 60 万患者因结肠癌而死亡 [1] 虽然目前对结肠癌的诊断和治疗都已有明显改善, 但其预后仍不理想因此, 临床仍需开发高效而低毒性的抗肿瘤药物用于治疗结肠癌本研究表明,Tet 能明显抑制人结肠癌 HCT116 细胞增殖并

5 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) 1231 Fig4 EfectsofTGF β1onanti proliferationpotential oftetinhct116cels A:CCK 8asayresultsshowedtheefectofTGF β1on Tet inducedproliferationinhibitioninhct116cels. P< 0 05, P<0 01vscontrol; # P<0 05, ## P<0 01vs Tet;B:WesternblotanalysisresultsshowtheefectofTGF β1ontheproteinlevelsofbadandbcl 2afectedbyTetin HCT116cels;C:Westernblotanalysisresultsshowedthe efectoftgf β1inhibitorontheproteinlevelsofbadand Bcl 2afectedbyTetinHCT116cels.LY364947:TGF β1 inhibitor 促进其凋亡, 这种作用可能与 Tet 促进 TGF β1 表达, 进而抑制 PI3K/Akt 信号活化有关 ; 但 Tet 促进 TGF β1 表达的具体分子机制尚不清楚 Tet 属于二苄基异喹啉类生物碱, 主要从防己科植物粉防己的干燥根中提取 Tet 具有多种药理活性, 临床可用于治疗高血压关节炎神经痛肌肉痛等相关疾病研究表明,Tet 还具有明显的抗肿瘤作用, 对多种肿瘤细胞具有抗增殖和促进凋亡作用, 如肝癌乳腺癌结肠癌等, 这种作用可能与 Wnt/β catenin 及 p53 信号等有关 [5-6,9-10] 课题组前期研究结果也证明,Tet 对结肠癌具有明显抑制作用, 但具体分子生物学机制尚不十分清楚结肠癌发生与生活方式以及基因突变等因素有关,Wnt/β catenin 信号转导异常是其发生的重要原因之一 [11] 除此之外, 其他与结肠癌发生有关的突变包括 PTEN BRAF 和 KRAS 等 [11-12] TGF β 超家簇包括一系列分泌性蛋白, 如 TGF β 骨形态蛋白 (bonemor phogeneticproteins,bmps) 活化素 (activins) 以及 Nodal 等这些因子与相应受体结合后, 通过 Smads 与相应转录因子结合调节下游靶基因表达研究表明,TGF β 功能异常也与结肠癌的发生关系密切 TGF β 有 3 种亚型, 即 TGF β1 TGF β2 TGF β3 这些异构体在哺乳动物细胞中均有表达, 且对肿瘤具有双向作用, 既可促进肿瘤生长, 也可抑制肿瘤生长 [13] 出现这种情况的原因可能与肿瘤微环境细胞种类以及细胞的分化阶段有关 TGF β1 在结肠癌表达水平较高, 可通过上调 Criptol 1 而促进结肠癌的发展 [14] 本研究结果显示,TGF β1 在结肠癌细胞中的表达水平明显高于正常结肠上皮细胞 (FHC) 提示,TGF β1 在结肠癌中具有重要调节作

6 1232 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) Fig5 EfectsofPI3K/Aktonanti proliferationefect oftetinhct116cels A:WesternblotanalysisresultsshowedtheefectofTet ontheproteinlevelofakt1/2andthephosphorylationof Akt1/2/3inHCT116cels;B:CCK 8asayresultsshowed theefectofpi3kinhibitorontet inducedproliferationin hibitioninhct116cels. P<0 05, P<0 01vscon trol; ## P<0 01vsTet.LY294002:PI3Kinhibitor 用, 但这种表达增高对结肠癌的具体影响还不十分清楚文献报道 [15],Tet 在除草醚诱导的先天性膈疝中能抑制 TGF β1mrna 表达, 但具体机制不详提示,Tet 可能会影响 TGF β1 在肿瘤细胞中表达本研究显示,Tet 在结肠癌细胞中对 TGF β1 的 mr NA 和蛋白表达均有促进作用由于 Tet 本身具有明显的抗肿瘤作用, 课题组推测 Tet 的抗肿瘤作用可能与其上调 TGF β1 表达有关增殖抑制和凋亡检测实验结果证实, 外源性表达 TGF β1 能增强 Tet 的抗肿瘤作用, 而抑制 TGF β1 则明显减弱 Tet 的这种抗肿瘤作用因此,Tet 对结肠癌细胞的增殖抑制和促进凋亡作用可能部分通过上调 TGF β1 介导, 但具体作用机制不清楚 TGF β 信号主要通过经典的 TGF β 通路 (TGF β/smads) 实现对细胞增殖与分化等重要生理过程的调控除此之外,TGF β 还可通过非经典 TGF β 通路参与细胞生理功能的调节, 如 TGF β 可通过激活 PI3K/Akt 信号来促进癌细胞迁移和侵袭 [16] 本研究预试验发现,Tet 在结肠癌细胞中不仅未增加 Smad2/3 的磷酸化水平, 反而抑制其磷酸化提示, TGF β1 可能通过非经典的 TGF β 信号影响 Tet 的抗结肠癌作用 PI3K/Akt 信号与细胞的增殖分化及凋亡关系密切本研究结果显示,Tet 能明显降低 Akt1/2/3 的磷酸化水平, 但对 Akt1/2 的总蛋白水平无明显影响 ; 抑制 PI3K/Akt 信号明显增强 Tet 抗结肠癌细胞增殖的作用因此,Tet 对 Akt1/2/3 磷酸化的抑制作用可能与 TGF β1 过表达有关进一步分析结果显示, 外源性过表达 TGF β1 明显增强 Tet 对 Akt1/2/3 磷酸化的抑制作用, 而 TGF β1 抑制剂则能部分逆转 Tet 对 Akt1/2/3 磷酸化的抑制作用 PTEN 是 PI3K/Akt 信号的重要负性调节因子, 沉默 PTEN 能明显增加结肠癌细胞中 Akt1/2/3 的磷酸化水平, 但外源性过表达 TGF β1 能取消沉默 PTEN 对 Akt1/2/3 磷酸化的促进作用结果提示,TGF β1 表达水平增加可能通过抑制 PI3K/Akt 信号而介导 Tet 对结肠癌细胞的增殖抑制和促进凋亡作用体外实验结果证明,Tet 具有明显的抗结肠癌作用, 这种作用可能与其促进 TGF β1 表达, 进而抑制 PI3K/Akt 信号有关 TGF β1 可能是治疗结肠癌药物潜在的有效靶点之一, 但 Tet 促进 TGF β1 表达的分子机制还有待进一步研究并在其他结肠癌细胞中进行确证

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) 1233 Fig6 EfectsofTGF β1and/ortetonphosphorylationofakt1/2/3inhct116cels

HCT116cels;B:WesternblotanalysisresultsshowedtheefectofTetand/orTGF β1inhibitorontheproteinlevelofakt1/2andthephosphorylationof

onthephosphorylationofakt1/2/3inhct116cels [ 致谢 : 本研究工作在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成感谢芝加哥大学医学中心何通川教授 (T.C. He) 为本研究馈赠所需的重组腺病毒 ] 参考文献 : [1] BrennerH,KloorM,PoxCP.

[3] LingX,LiuX,ZhongK,etal.FL118,anovelcamptothecinan alogue,overcomesirinotecanandtopotecanresistanceinhuman tumorxenograftmodels[j].

7 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) 1233 Fig6 EfectsofTGF β1and/ortetonphosphorylationofakt1/2/3inhct116cels A:WesternblotanalysisresultsshowedtheefectofTetand/orTGF β1ontheproteinlevelofakt1/2andthephosphorylationofakt1/2/3in HCT116cels;B:WesternblotanalysisresultsshowedtheefectofTetand/orTGF β1inhibitorontheproteinlevelofakt1/2andthephosphorylationof Akt1/2/3inHCT116cels(LY364947:TGF β1inhibitor);c:immunofluorescentstainingresultsshowedtheefectoftgf β1and/orptenknockdown onthephosphorylationofakt1/2/3inhct116cels [ 致谢 : 本研究工作在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成感谢芝加哥大学医学中心何通川教授 (T.C. He) 为本研究馈赠所需的重组腺病毒 ] 参考文献 : [1] BrennerH,KloorM,PoxCP.Colorectalcancer[J].Lancet, 2014,383(9927): [2] SeeberA,GastlG.Targetedtherapyofcolorectalcancer[J].On colrestreat,2016,39(12): [3] LingX,LiuX,ZhongK,etal.FL118,anovelcamptothecinan alogue,overcomesirinotecanandtopotecanresistanceinhuman tumorxenograftmodels[j].am JTranslRes,2015,7(10): [4] 杨义方, 王联亿. 汉防己甲素的药理作用研究近况 [J]. 中国药理学通报,1986,2(4):45-7. [4] YangYF,WangLY.Advanceinthepharmacologyresearchof tetrandrine[j].chinpharmacolbul,1986,2(4):45-7. [5] TingCT,LiW C,ChenCY,etal.Preventiveandtherapeutic roleoftraditionalchineseherbalmedicineinhepatocelularcarci

8 1234 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Sep;33(9) noma[j].jchinmedasoc,2015,78(3): [6] 王东旭, 袁霜雪, 伍秋香, 等. 胰岛素样生长因子结合蛋白 5 与汉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖的关系研究 [J]. 中国药理学通报,2015,31(10): [6] WangDX,YuanSX,WuQX,etal.Studyontherelationship betweeninsulin likegrowthfactorbindingprotein5andtheanti proliferationefectoftetrandrineinhumancoloncancercels[j]. ChinPharmacolBul,2015,31(10): [7] LuoJY,DengZL,LuoXJ,etal.Aprotocolforrapidgenera tionofrecombinantadenovirusesusingtheadeasysystem[j]. NatProtoc,2007,2(5): [8] HanS,BuiNT,HoM T,etal.DexamethasoneinhibitsTGF β1 inducedcelmigrationbyregulatingtheerkandaktpath waysinhumancoloncancercelsviacyr61[j].cancerres Treat,2016,48(3): [9] HeBC,GaoJL,ZhangBQ,etal.TetrandrineinhibitsWnt/ beta cateninsignalingandsuppresestumorgrowthofhumancolo rectalcancer[j].molpharmacol,2011,79(2): [10] MengLH,ZhangH,HaywardL,etal.Tetrandrineinducesearly G 1 arestinhumancoloncarcinomacelsbydown regulatingthe activityandinducingthedegradationofg 1 S specificcyclin de pendentkinasesandbyinducingp53andp21cip1[j].cancer Res,2004,64(24): [11] LiuYZ,WuK,HuangJ,etal.ThePTEN/PI3K/AktandWnt/ β cateninsignalingpathwaysareinvolvedintheinhibitoryefectof resveratrolonhumancoloncancercelproliferation[j].intjon col,2014,45(1): [12] RiemerP,SreekumarA,ReinkeS,etal.Transgenicexpresion ofoncogenicbrafinduceslosofstemcelsinthemouseintes tine,whichisantagonizedbyβ cateninactivity[j].oncogene, 2015,34(24): [13]NeuziletC,Tijeras RabalandA,CohenR,etal.Targetingthe TGFβpathwayforcancertherapy[J].PharmacolTher,2015, 147: [14]MancinoM,StriziL,WechselbergerC,etal.Regulationofhu mancripto 1geneexpresionbyTGF beta1andbmp 4inembry onalandcoloncancercels[j].jcelphysiol,2008,215(1): [15]XuC,LiuW,ChenZ,etal.Efectofprenataltetrandrineadmin istrationontransforminggrowthfactor beta1levelinthelungofni trofen inducedcongenitaldiaphragmaticherniaratmodel[j].j PediatrSurg,2009,44(8): [16]VoBT,MortonDJr,KomaragiriS,etal.TGF betaefectson prostatecancercelmigrationandinvasionaremediatedbypge2 throughactivationofpi3k/akt/mtorpathway[j].endocrinol ogy,2013,154(5): Relationshipbetweenanti proliferation efectoftetrandrineandtgf β1inhumancoloncancercels RENWen yan 1,2,CHENQian zhao 1,2,ZHOULin yun 1,2, SHAOYing 1,2,LIAOYun peng 1,2,WANGHan 1,2,ZHUJia hui 1,2,HEBai cheng 1,2 (1.DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing ,China; 2.ChongqingKeyLabrotoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing ,China) Abstract:Aim Tostudytherelationshipbetweenthe anti proliferationefectoftetrandrine(tet)andtgf β1inhumancoloncancercels.methods Celviabil ityasay,westernblot,flow cytometryandannexin Ⅴ EGFPstainingwereintroducedtoanalyzetheanti cancerefectoftetonhct116cels.real timepcr, Westernblot,celviabilityandimmunofluorescentwere employedtodeterminetherelationshipbetweenthean ti cancerefectoftetandtgf β1inhct116cels, therelationshipbetweentheanti cancerefectoftet andpi3k/aktonhct116cels,andhowtgf β1me diatedtheanti cancerefectoftetonhct116cels. Results Comparedwiththecontrolgroups,Tetap parentlyinhibitedtheproliferation,andinducedcel cyclearestatg 1 phaseand apoptosisin HCT116 cels.tetgreatlyup regulatedtheexpresionoftgf β1eitherthemrna orproteinlevel,andexogenous expresionoftgf β1potentiatedtheanti cancerefect oftetinhct116cels,whiletgf β1inhibitoraten uateditnotably.tetdecreasedthephosphorylationof Akt1/2/3,butnoapparentefectwasobservedontotal proteinlevelofakt1/2;pi3k inhibitorenhancedthe anti cancerefectoftetinhct116substantialy.ex ogenousexpresionoftgf β1enhancedthetet in duceddecreasephorphorylationofakt1/2/3,which waspartlyreversedbytgf β1inhibitorinhct116 cels.meanwhile,knockdownofpten elevatedthe levelofphorphorylatedakt1/2/3,whichwasabolished bytheexogenousexpresionoftgf β1inhct116 cels.conclusion Tetmaybeapotentcandidatedrug forcoloncancertreatment,andtheanti cancerefect oftetmaybepartlymediatedbyup regulatingtgf β1 toinactivatepi3k/aktsignal. Keywords:tetrandrine;coloncancer;HCT116cels; TGF β1;pi3k/akt;pten

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) 39 用 [1-3], 并且对结肠癌还具有一定的预防作用 [4] 除此之外,Tet 对乳腺癌细胞也具有抑制增殖和促进凋亡的作用, 机制可能与抑制 PKC α 和逆转耐药等有关 [5-6], 但具体

38 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1):38~43 网络出版时间 :2017-12-1413:50 网络出版地址 :htp://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.r.20171211.1847.020.html IGFBP 5 及 p53 与汉防己甲素抑制乳腺癌 MCF 7 细胞增殖的关系研究周林云