$ 西安交通大学学报医学版第卷结直肠癌是一种严重威胁人类健康的疾病发病率居各种恶性肿瘤第位致死率居第位发展中国家近年来的结直肠癌发病率明显升高且趋于年轻化目前手术切除是结直肠癌的主要治疗方法但对于中晚期患者需要化疗来缓解症状以延长生命上世纪 3 年代 $%&' 已用于

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端讼骆
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1 第卷第期年月西安交通大学学报医学版!" #$# # %&'& & 基础研究通过抑制自噬反应提高结肠癌的化疗效果侯妮刘娜韩佳李杰西安交通大学医学部细胞生物学与遗传学系陕西西安第二附属医院普通外科陕西西安 # 摘要目的探索新的联合化疗方案以提高 $%&' 为基础的结肠癌化疗效果方法研究 $%&' $% $ 以及两种药物联合使用对人结肠癌细胞株 ()* 的自噬及凋亡影响 **( "+,-. 染色检测细胞生长及凋亡 /) 染色观察细胞内自噬反应 0"+"1 观察细胞内的凋亡及自噬相关蛋白改变将 ()* 细胞注射至裸鼠皮下建立在体肿瘤模型并进行治疗观察肿瘤生长情况结果 ** 检测结果显示 ()* 在 $%&' 作用下细胞生长受到抑制 ( "+,-. 染色显示 $%&' 联合 % 组凋亡数量较 $%&' 组明显增加 0"+"1 检测 $%&' 联合 % 组的凋亡蛋白 ) + +"%-- 表达较 $%&' 组明显增高同时 /) 染色以及自噬特异性蛋白 ). 检测发现在 $%&' 作用下自噬反应升高而通过 % 抑制 $%&' 引起的细胞自噬反应细胞生长抑制率从 $%&' 单独作用的 $ # # # 提高至 2 32$ 凋亡增加超过皮下注射 ()* 细胞的裸鼠肿瘤模型 $%&' 联合 % 组较单独使用 $%&' 组有效抑制肿瘤生长肿瘤体积及质量均明显减少结论 % 可抑制 $%&' 处理引起的细胞自噬反应促进细胞凋亡 ()* 细胞生长抑制率明显增加为提高 $%&' 为基础的结肠癌化疗提供新思路关键词结直肠癌 $%&'% 凋亡自噬化疗 ) + +"%-- ) 中图分类号 % $ 文献标志码 $2!" # $!%&! & ' %%'%!% $!#% " (4' 5.' 5 ( 56.6 " /" 1 " 7)" 89"" +: ; 6 ' "1+(" "")""1: ; /" 1 " 79""1!1 "1 " " 7" ( +7: ; 6 ' "1+: ; #) () " $ # $ ()" #** ## ##&+ ####+, -"* # $ ( &$. *"!/$. * # )##" * "* &! -" )* # &+#*01"!, -" " # "* &) -"* ##* & ( *- * "& " ** +, -") $ ( " *# ) $ ( "!/ " *&/* -#" ) $ ( "!/ * )"$ ( "#"* & * ##" $&# #&# 2&32 &$ " * #") * &+, #-# " *" "#& *# ) $ ( "!/ * )" * - * #" -* $ ( &!/ *# $ ( "#" ) * ) * +, " * #") ## ###** & *+, -( ## ## $ (!/* #**,0/ 0., 收稿日期 $%$%$ 修回日期 $%% 基金项目国家自然科学基金资助项目 53$3! 1""5 5!1""&! 7)53$3 通讯作者李杰 %"$ 优先出版 "+ "22 $2 $$%%2! "!

2 $ 西安交通大学学报医学版第卷结直肠癌是一种严重威胁人类健康的疾病发病率居各种恶性肿瘤第位致死率居第位发展中国家近年来的结直肠癌发病率明显升高且趋于年轻化目前手术切除是结直肠癌的主要治疗方法但对于中晚期患者需要化疗来缓解症状以延长生命上世纪 3 年代 $%&' 已用于结直肠癌的化疗至 222 年 $%&' "! 1 的治疗方案成为结直肠癌化疗的金指标年以后奥沙利铂依立替康等药物联合 $%&' 化疗方案也应用于临床治疗中但是疗效始终有限需要探索和研究以提高结直肠癌对 $%&' 化疗的敏感性自噬是细胞内的一种降解途径通过降解衰老受伤的细胞器及一些大分子蛋白质来维持细胞内环境 # 的稳定近年来多项研究发现自噬与恶性肿瘤遗传性肌病及神经变性性疾病等多种疾病有关其中自噬与肿瘤发生发展及治疗的关系正成为研究的焦点大量的研究发现自噬可以导致肿瘤细胞发生自噬性死亡提高肿瘤化疗效果但同时也有研究发现自噬可以帮助肿瘤细胞耐受或阻止化疗药物毒性所引起的细胞破坏因此解析自噬与肿瘤之间的 $ 复杂关系有利于肿瘤治疗新靶点的探索本研究观察 $%&' 单用或联用自噬抑制剂 % 对人结肠癌细胞 ()* 生长凋亡的影响及自噬反应激活情况并进一步进行在体实验验证. 材料与方法.. 主要试剂和抗体 $%&'$%7! 1!1 和 % % "" " 均购于美国公司 % 被用作自噬抑制剂溶解于 ( 4 中配制成并室温保存 /) % +"1 " 是一种荧光染料被用作自噬活性变化的示踪剂购于美国公司抗 ) + +"% -- 抗体均购于美国 )"*" "+ 公司 ) 抗体为日本 8 公司 % 抗体为美国公司提供. / 细胞培养人结肠癌细胞株 ()* 由西安交通大学医学部细胞生物学与遗传学系提供 ()* 细胞常规培养于含有胎牛血清并添加.' 青霉素和链霉素的 -.# 培养基美国 ( " 公司并置于二氧化碳培养箱中贴壁培养更换次培养液.0 法检测细胞生长抑制率及实验分组 ()* 细胞种于 2 孔培养板中每孔细胞数为 # ()* 在不同浓度 $$$ $%&' 作用 #3 后每孔内加入 ** 溶液 $ 继续置于培养箱中孵育 # 后移除培养液每孔内加入 $ /4 并振荡酶联免疫检测仪测 #2 波长处每孔吸光度值进而计算细胞生长抑制率抑制率 <= 试验组对照组结果表示为平均抑制率标准差实验分组根据实验结果选取适宜的 $%&' 浓度取对数生长期细胞分成 # 组进行治疗干预实验分别为对照组无药物处理 % 组 $ % 处理 $%&' 组 $$%&' 处理及 % 联合 $%&' 治疗组 $$%&' 与 $ % 共同处理分别干预 #3 每组设 $ 个复孔 ** 法检测细胞生长抑制率情况.01) 染色检测各干预组细胞内自噬情况自噬改变通过 /) 染料检测 /) 可标注自噬泡并通过荧光显微镜进行观察 # 组细胞干预 #3 加入 $ /) 在孵育后置于荧光显微镜 ).-* %'5 下在 3 激发波下进行观察并采集图像.0-! " '!% 检测自噬及凋亡相关蛋白的表达分别收集 # 组细胞于细胞裂解液 *1 +%() ( /* # 5 ) 5-%# 1 "" % "+! 7 7! 1"-& +! " 中裂解通过 8) -1 " ++ - "1" 进行蛋白质浓度定量取蛋白质经 / %- 9 凝胶电泳分离后转至 ->/& 膜充分干燥 $ 脱脂牛奶封闭依次给以一抗 ) ) + +"% 或 -- 抗体稀释比均为? 连接辣根过氧化物酶的二抗孵育稀释度为?$ 后 ) 1" 发光扫描仪扫描并保存图像.0! 染色 /5 结合染料 ( "+ # 和 -. 标记凋亡细胞 3 激发波荧光显微镜下进行观察凋亡细胞可观察到破碎的凋亡小体呈蓝色或红色荧光而正常存活细胞或坏死细胞仍显示出完整的细胞核呈蓝色或红色最少观察 # 个视野不少于 $ 个细胞并计算细胞凋亡率.0 建立动物模型及实验皮下注射 ()* 细胞悬液于裸鼠右胁部当肿瘤体积达预定值 3 $ 大约在注射后左右裸鼠被随机分成 # 组进行治疗干预对照组 % 组 $%&' 组及 % 联合 $%&' 组 $%&'# % 分别溶于盐水中按照预定分组注射于裸鼠腹腔内每 $ 注射次共计 $ 次对照组同时! "!

3 期侯妮刘娜韩佳等 % 通过抑制自噬反应提高结肠癌 $%&' 的化疗效果 $ 注射盐水进行对照观察每 $ 观察次肿瘤体积肿瘤体积通过公式 >< 为肿瘤最大直径为肿瘤最小直径进行估算月后切除肿瘤新生物并拍摄照片同时测量肿瘤体积及质量.0 统计学分析应用 - 统计软件进行分析所得数据采用均数标准差表示两组比较采用! 1"! ";+%"+ 以 $ 为差异有统计学意义 / 结果 /0. 可增强对 ).. 的生长抑制作用 ** 检测结果显示 ()* 在不同浓度 $$$ $%&' 作用 #3 后细胞生长受到明显抑制具有一定的浓度依赖关系 $$%&' 作用 #3 的细胞生长抑制率可达 $ # # # 图据此 $ $%&' 处理 ()* 细胞 #3 被用于后续实验中 ** 检测 # 组干预处理组细胞结果显示 $% &'% 联合组 ()* 细胞生长抑制率从 $%&' 单独作用下的 $ # # # 提高至 2 32 $ 而单独使用 % 所造成的细胞抑制较对照组仅有轻微升高图 8 图. 法检测细胞生长抑制率的变化 & )"+ 7" +!1 ()*1" "$%&' 1% 不同浓度 $%&' 作用 ()* 细胞 #38 与单独 $%&' 对比联合使用 % 与 $%&' 显著提高细胞生长抑制率结果取自至少次独立重复实验 /0/ 可以抑制引起的 ).. 自噬的激活 /) 是一种荧光染料用于标记细胞内酸性颗粒常被用作自噬活性改变的示踪剂而 % 是磷脂酰肌醇激酶的抑制剂进而影响自噬泡的发生被广泛用作自噬的抑制剂 /) 检测发现 $% &' 组 ()* 细胞质中或核周围区域光点样结构较对照组明显增加提示 $%&' 在抑制细胞生长的同时细胞内自噬反应被激活而联合 % 处理细胞后光点样结构减少提示 % 有效抑制 $%&' 引起的自噬反应图通过 ) 蛋白免疫印迹方法验证显示同样结果图 8 在自噬反应激活时细胞胞质中可溶性 ).3! 与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺 - 结合形成 ).! ). 含量以及 ). ). 的值通常用来反映细胞的自噬活性 0"+% "1 结果中条带灰度通过软件 9" (" 量化计算 ). ). 与 $%&' 组对比联合使用 % 使得 ). ). 比值明显减少图 ) /0 明显增加引起细胞凋亡及相关蛋白表达变化 ( "+,-. 染色显示 $%&' 联合 % 组凋亡数量较 $%&' 组明显增加通过在高倍镜视野中计数 $ 个以上细胞发现 $%&' 联合 % 组凋亡数量较 $%&! 组中增加超过倍图 0"+"1 检测凋亡蛋白 ) + +"% 及 -- 活性片段增多图 8 这提示 $%&' 在抑制细胞生长的同时可导致细胞发生凋亡而 % 明显增加凋亡 /01 联合使用的在体实验显示有效抑制肿瘤生长裸鼠皮下种植肿瘤细胞后按照预定实验方案进行分组治疗实验全程各组裸鼠体质量及健康程度无明显差异 $%&' 联合 % 组较单独 $%&' 组肿瘤形成明显缓慢图 # $ 后终止实验时单独 $%&' 组和联合处理组的肿瘤体积分别为 3 和 $#$ 肿瘤质量分别为 ### 和 #$# $%&' 联合 % 组裸鼠最终形成的肿瘤明显小于和轻于单独 $%&' 组有效抑制肿瘤的生长图 #8 和 #)! "!

4 $ 西安交通大学学报医学版第卷图 / 和或作用于 ).. 细胞的自噬改变 & )"+ 7! ()*1" "$%&' 1% 各组细胞的 /) 染色结果 80"+"1 检测各组细胞中 ) 蛋白的表达结果 ) ). ). 的量化结果与 $%&' 组比较 $ 结果取自至少次独立重复实验图 1 联合应用明显抑制裸鼠肿瘤生长 & #. 7 " $% &'% 各组肿瘤体积的改变 8 各组形成肿瘤的大体病型照片 ) 各组形成肿瘤的质量比较 $ 结果取自至少次独立重复实验讨论图! 染色及 -! " '!% 检测凋亡蛋白表达 & )" ()*1" "$%&' 1% 各组细胞的 ( "+,-. 染色结果 8 各组细胞中 ) + +"% 及 -- 蛋白的表达结果结果取自至少次独立重复实验结直肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤疾病化疗能够有效地减少肿瘤的复发并延长患者生命然而越来越多抗药性的产生严重影响到结直肠癌的治疗效果急需研究新的化疗方法本研究通过体外及在体实验发现 $%&' 抑制结直肠癌细胞的生长并可导致细胞凋亡同时细胞内自噬反应被激活通过自噬抑制剂 % 抑制自噬反应细胞凋亡明显增加裸鼠皮下种植肿瘤体积大幅度缩小提高了 $% &' 结直肠癌化疗效果已发现自噬与肿瘤有着密切联系如在肿瘤早期自噬能够损伤肿瘤细胞而抑制肿瘤的发生在进展期自噬又似乎促进肿瘤的发展肿瘤中心区的细胞可以通过自噬反应来耐受低氧及低营养的环境特别是在肿瘤化疗过程中自噬能够通过隔离并降解! "!

5 期侯妮刘娜韩佳等 % 通过抑制自噬反应提高结肠癌 $%&' 的化疗效果 $ 被药物破坏的蛋白或细胞器而保护细胞并对抗化疗 3 药物降低化疗药物疗效 % 是一种经典的自噬抑制剂近来有许多研究发现 % 能够有效地联合化疗药物促进肿瘤细 2 胞发生凋亡如 (5% 5*4. 0.)@ 等的研究发现在人前列腺癌细胞中 % 可以通过促进细胞色素 ) 在细胞质中的释放而促进 +! 7 1 % " 导致的 -)% 细胞凋亡而在乳腺癌 )&% 细胞中 % 同样可以增加喜树碱所导致的细胞死亡本实验也同样发现在 $%&' 作用下人结肠癌细胞中自噬反应增加通过 % 抑制后细胞凋亡增加倍以上自噬对细胞的作用具有两面性既可以作为细胞生长的朋友也可能成为敌人这取决于疾病进展的不同阶段细胞周围环境的变化和治疗干预措施的不同因此更深入地研究 $%&' 导致细胞内自噬反应发生的机制及自噬与凋亡间的联系自噬与肿瘤之间的联系等并将对自噬的干预用于肿瘤治疗中将是今后的研究重点并成为肿瘤治疗的新亮点参考文献!/.//2(, '!! &3)## #&,/,#, 2 2& '' +4.55!05,0&,# ##&.# #322#2 $& 5,5''..!&5#"* ### *&, 5#2 23 3#& # 4. 4/ /&/* &/ ' 2 /#" $# $ $2 & $,+ //+.6 1$.5 + / &/* "&!5#2# $&!17 $+1!/!&! *" * &1 #*,##2 $& $+/ 1(1!'!5 $/4.&! * "#&! *"!$2 2 $& 3+5'/ +/!! +3 $ /($5'.&/* "## * &!0* ##3$3 33& 2 +!/' /' 5$11,7 /5+'$5' $1'3+ $%& $ *#* * )# #* #" *###&,# $33 $3$& / 1'! /'3!, 5''..!/ &/* " ##" * ) ###- '/"&,*#$ $& 编辑国荣上接第 ## 页 '15 5 $4/ $45 $4/!4501'$4104 /2 & #!, #111 " 5$# #) #* # "8 #" & "23#$ #& 7+5 ($+ ' 6,./ (&' # # **# "8&.8#2## #2& (.7+/'3 312, &1 "* # "8&,* 3$$ $$& 2 2!!('/'$!$$/.61/ &'/ 0+ "# - * " "# " ) ## 8 &.8 $3 32&,/1 '$ /+/1$1$!/4 &## #)&',#3$ 2$& 5254 '1$&'# " #"# # &/" " $3 3 & 5'3$3,+5 3 & "5$#" # ## * ) - #* #&#* *,$# #2 2& /%/ /$/ / 1.+5(($,+1 ( &$5 - &1,#22 $# #3& # 5' +&$ ""* "" #&( " #!" 22$3#$ 2#& $,+ '/1$ /'15..5!3 1 / 0 &5" #*# "#"" 4$#&( " #!"33 & ! 4 /. ', & "#"" -" 9" #&'# #2 $ #& 0 5%1',1/.1! 5''1'1// 3 ' / 1/ & ##" 7,"#" ###&( " #!"$# ##$& 3 7 '3,0/'(5' $./ &$* A "" " ) *" "#*"& 2 & 2 2 2/ 5 //!1' & "# " # +* " 8 ##&1! *"2$2 $& 编辑国荣! "!