2017药理封面大版

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1 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Feb;33(2):191~7 191 网络出版时间 : :38:00 网络出版地址 :htp:// TGF β3 与熊果酸抑制人结肠癌细胞增殖作用的研究 邵英 1,2, 王东旭 1,2, 陈前昭 1,2, 曾于桦 1,2, 周林云 1,2, 周益 1,2, 任文艳 1,2 1,2, 何百成 (1. 重庆医科大学药理学教研室,2. 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室, 重庆 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) 中国图书分类号 :R284.1;R329.24;R329.25;R735.35; R977.6 摘要 : 目的研究 TGF β3 与熊果酸 (ursolicacid,ua) 抑制结肠癌细胞增殖作用的关系及可能的分子机制 方法采用结晶紫染色法和流式细胞术分析不同浓度 UA 对 HCT116 细胞增殖的作用 利用 Westernblot 和流式细胞术等方法分析 UA 对 HCT116 细胞凋亡的影响 通过 RT PCR 和 ( 或 ) Westernblot 实验分析 UA 在 HCT116 细胞中对 TGF β3 Smad2/3 和 β catenin 表达及磷酸化水平的影响 采用 TGF β3 重组腺病毒和特异性抑制剂以及萤光素酶报告质粒分析 TGF β3 介导 UA 抑制结肠癌细胞增殖的可能分子机制 结果 UA 能明显抑制 HCT116 细胞增殖, 诱导 G 1 期阻滞, 并促进其凋亡 UA 能明显降低 TGF β3 的 mrna 和蛋白表达水平 ;UA 对 Smad2/3 的总蛋白水平无明显影响, 但能明显降低 Smad2/3 的磷酸化水平 ; 外源性过表达 TGF β3 可部分逆转 UA 对 HCT116 细胞增殖的抑制作用,TGF β3 特异性抑制剂则增强 UA 对 HCT116 细胞增殖的抑制作用 ;UA 降低 β catenin 蛋白水平, 并明显抑制 Wnt/β catenin 信号转导 ; 外源性过表达 TGF β3 促进 β catenin 蛋白表达, 并部分逆转 UA 对 β catenin 蛋白表达的抑制效应 ;TGF β3 特异性抑制剂增强 UA 对 β catenin 蛋白表达的抑制作用 结论 UA 能抑制结肠癌细胞 HCT116 增殖并诱导凋亡, 其作用可能是通过下调 TGF β3 表达, 进而抑制 Wnt/β catenin 信号转导 关键词 : 熊果酸 ; 结肠癌 ; 增殖抑制 ; 凋亡 ;TGF β3;wnt/β catenin 结肠癌是消化系统的恶性肿瘤之一 [1], 目前治疗所面临的主要困难在于常用化疗药物的不良反应严重和肿瘤细胞的转移 虽然近年来对结肠癌诊断和治疗技术有了一定的进展, 但预后仍不理想 因此, 临床仍需研发高效而低毒的药物用于治疗结肠收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ) 作者简介 : 邵英 (1990-), 女, 硕士生, 研究方向 : 分子药理学,E mail: @163.com; 何百成 (1972-), 男, 博士, 教授, 研究方向 : 分子药理学和干细胞生物学, 通讯作者,E mail:hebaicheng99@yahoo. com 癌 熊果酸 (ursolicacid,ua) 是从传统中草药中提取出的一种五环三萜类化合物, 具有多种药理活性, 如镇静 抗炎 抗菌 降糖和抗溃疡等 [2] 近年来, UA 因具有明显的抗肿瘤活性而备受关注 [3] 文献报道,UA 的抗肿瘤作用可能与抑制 STAT3/COX 2 NF κb Wnt/β catenin 信号 [4-7], 激活 p53 有关 [8], 但具体分子机制目前仍然不清楚 转化生长因子 β(tgf β) 对细胞的增殖与分化 胚胎发育以及血管生成等多种生理过程有重要的调控作用 TGF β 有 3 种亚型, 即 TGF β1 TGF β2 和 TGF β3, 三者均在结肠癌细胞中表达 研究表明,TGF β3 在肿瘤组织中呈明显异常高表达 [9] TGF β 信号与 Wnt/β catenin 信号之间存在 cros talk [10],Wnt/β catenin 信号的异常是引发结肠癌的重要因素之一 [11] UA 可以有效抑制结肠癌细胞增殖, 但这一作用是否与 TGF β3 或 Wnt/β catenin 信号有关, 尚不清楚 本实验对 UA 抑制人结肠癌细胞增殖的作用进行了相关研究, 并分析介导 UA 这种作用的可能分子生物学机制 结果显示,UA 明显抑制结肠癌细胞增殖, 并促进凋亡, 这种作用可能与 UA 通过下调 TGF β3 表达, 进而抑制 Wnt/β catenin 信号转导有关 1 材料与方法 1.1 试剂与细胞培养熊果酸购自西安昊轩生物科技有限公司 HCT116 细胞购自 ATCC 本实验所用 TGF β3 Smad2/3 p Smad2/3 Bcl 2 Bad 和 GAPDH 等一抗均购自 SantaCruzBiotechnology 公司 TGF β3 特异性抑制剂 (2 methoxyestradiol) 购自赛力克公司 细胞培养采用 DMEM 高糖培养基 ( 含 10% 的胎牛血清 100kU L -1 青霉素以及 0 1g L -1 链霉素 ), 细胞培养条件为 5% 的 CO 2 和 重组腺病毒载体构建本实验使用的重组腺病毒载体通过 AdEasy 系统构建 [12] 方法简述如下 : 以 EST 克隆为模板, 用高保真 Taq 酶通过 PCR 将目的基因编码序列扩增并克隆到穿梭质粒中 线性化穿梭质粒后与骨架质粒进行同源重组, 将重组

2 192 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Feb;33(2) 正确的质粒线性化后转染到 HEK 293 细胞中进行病毒包装, 得到目的基因的重组腺病毒载体 ( 以绿色荧光蛋白进行标记 ) 所建病毒载体包括绿色荧光蛋白重组腺病毒载体 (AdGFP, 作为对照 ) 和 TGF β3 重组腺病毒载体 (AdTGF β3) 1.3 细胞增殖检测实验将生长状态良好的 HCT116 细胞均匀种到 24 孔板中, 按实验设计加入相应浓度的 UA 处理细胞 ( 对照组细胞用相同体积的 DMSO 处理 ) 于相应时间点进行结晶紫染色 [11], 检测 UA 对 HCT116 细胞增殖的影响情况 弃培养基, 用 PBS 小心清洗孔板 每孔加入 500μL 结晶紫饱和溶液 ( 用 PBS 缓冲的 10% 甲醛配制 ), 室温下孵育 20min, 然后弃染液并用自来水小心清洗孔板 将孔板在室温下晾干并扫描, 再用 20% 的乙酸溶解结晶紫, 于 590nm 测定吸光度 每组实验重复 3 次 1.4 细胞周期及凋亡检测实验将 HCT116 细胞均匀种于 6 孔细胞培养板中 贴壁后, 按实验设计加入相应浓度的 UA 进行处理 48h 后收集细胞, 并用 PBS(4 ) 清洗, 按试剂盒的说明进行操作 最后通过流式细胞仪进行细胞周期分析 采用 An nexinv EGFP 和 PI 双染法处理细胞, 然后通过流式细胞仪分析 每组实验重复 3 次 1.5 RNA 提取及 RT PCR 实验将细胞种到 T25 培养瓶中, 并用相应浓度的 UA 进行处理 采用 TRIzol 法提取总 RNA, 经逆转录反应制备成 cdna 最后, 通过 PCR 检测目的基因 mrna 的表达水平 本实验所用引物序列如下 :GAPDH 上游引物 5 CAACGAATTTGGCTACAGCA 3, 下游引物 5 AGGGGAGATTCAGTGTGGTG 3 ;TGF β3 上游引物 5 TGGTTAGAGGAAGGCTGAACTC 3, 下游引物 5 ATGAGCAAATCCAACCTCAGAT 3 每组实验重复 3 次 1.6 Westernblot 实验将生长良好的细胞均匀种于 6 孔细胞培养板中, 待细胞贴壁后, 按实验设计加入相应浓度的 UA 进行处理 于处理后相应的时间点提取各组总蛋白, 通过 BCA 法测定总蛋白浓度 SDS PAGE 法进行 Westernblot 操作, 利用 ECL 化学发光法显影并采集图像 每组实验重复 3 次 1.7 萤光素酶报告质粒检测将生长状态良好的 HCT116 细胞种于 T25 培养瓶中, 贴壁后 Lipo fectamine2000 转染 LEF/TCF4 报告质粒 (ptop Luc)3μg,4h 后换液 24h 后将细胞收集, 并重新种于 24 孔细胞培养板中, 分别用不同浓度的 UA 处理 24h 后, 弃培养基并裂解细胞, 按试剂盒操作 说明测定萤光素酶活性 用 BCA 法测定裂解液总蛋白浓度, 用于标准化萤光素酶活性 每组实验重复 3 次 1.8 统计学分析所有实验数据以 x±s 珋表示, 采用 t test 进行组间比较 2 结果 2.1 UA 对 HCT116 细胞增殖的影响结晶紫染色结果显示,UA 能有效地抑制 HCT116 细胞增殖, 且抑制作用呈浓度和时间依赖性增强 (Fig1A); 定量分析结果显示,UA 在 15μmol L -1 时已能明显抑制细胞增殖 (Fig1B) 流式细胞术分析结果显示, 与对照组相比,UA 能明显诱导 HCT116 细胞发生 G 1 期阻 (Fig1C) 结果提示,UA 对 HCT116 细胞的增殖具有明显抑制作用 2.2 UA 对 HCT116 细胞凋亡的影响本研究进一步分析 UA 能否诱导结肠癌细胞凋亡 Western blot 分析结果显示,UA 明显增加 Bad 的水平, 同时降低 Bcl 2 的水平 (Fig2A) 流式细胞术分析结果显示,UA 明显呈浓度依赖性增加 HCT116 细胞凋亡比例 (Fig2B) 以上结果提示,UA 对 HCT116 细胞凋亡具有促进作用 2.3 UA 对 HCT116 细胞中 TGF β3 表达水平的影响 TGF β 信号对细胞的增殖与分化有重要调节作用, 该信号异常与结肠癌的发生和进展密切相关 因此, 我们接着分析 UA 对 HCT116 细胞的抗增殖作用是否与 TGF β 有关 PCR 和 Westernblot 实验结果显示,UA 呈浓度和时间依赖性降低 TGF β3 的 mrna 和蛋白水平 ; 同时,UA 也明显降低 Smad2/3 的磷酸化水平, 但对 Smad2/3 的总蛋白表达没有明显影响 (Fig3) 结果提示,UA 对 HCT116 细胞的抗增殖作用可能与抑制 TGF β3 有关 2.4 TGF β3 对 UA 抑制 HCT116 细胞增殖作用的影响为明确 UA 对 HCT116 细胞的抗增殖作用是否与其下调 TGF β3 有关, 本研究利用重组腺病毒介导的 TGF β3 过表达或 TGF β3 特异性抑制剂进行相关实验 细胞周期分析结果显示, 外源性过表达 TGF β3 部分逆转 UA 诱导的 G 1 期阻滞, 但 TGF β3 抑制剂则增强 UA 诱导 G 1 期阻滞的作用 (Fig4A) 结晶紫染色结果显示, 外源性过表达 TGF β3 能部分逆转 UA 的抗增殖作用 (Fig4B), TGF β3 特异性抑制剂则增强 UA 对 HCT116 细胞的增殖抑制作用 (Fig4C) 结果提示, 下调 TGF β3 表达能部分介导 UA 对 HCT116 细胞的增殖抑制作用, 但具体机制尚不清楚 2.5 TGF β3 与 UA 对 HCT116 细胞 Wnt/β cate

3 中国药理学通报 C P m g B 2 0 7F b 3 3 2 93 F g E UAp HCT 6 A T v g w UA p HCT 6 B Tq v g w UA p HCT 6 P 0 05 P 0 0v C F w m w UA HCT 6 F g2 E UA pp HCT 6 A W b w UA v B B 2 HCT 6 B F w m w UA HCT 6 信号转导的影响 W 信号参与细胞 增殖与分化的调节 该信号异常也是结肠癌发生的 依赖 性 抑 制 LEF T 4报 告 质 粒 的 转 录 活 性 F g 6 主要原因之一 因此 我们进一步分析在 HCT 5A 并明显降低 HCT6细胞中 的蛋白 g5b UA对 GS K3β的总蛋 白 无 明 显 影 水平 F 细胞中 UA是否会影响 W 信号 萤光 响 但能降低 GS K3β的磷酸化水平 F g5b 这些 素酶报告质粒和 W b 结果显示 UA呈浓度 结 果 提 示 UA的 抗 增 殖 作 用 可 能 与 抑 制 W

4 94 中国药理学通报 C P m g B 2 0 7F b 3 3 2 信号转导有关 我们推测 TGF β3表 达 的 下调可能与 W 信号被抑制有关 实验 结果显示 在 HCT6细胞中 TGF β3特异性抑制 剂降低 蛋白表达 并增强 UA对 表达的抑制作用 F g5c 外源性过表达 TGF β3促 进 蛋白表达 并部分逆转 UA对 表达的抑制作用 F g5d 以上结果提示 在人结 肠癌细胞中 UA能通过下调 TGF β3实现对 W 信号转导的抑制作用 3 讨论 从传统中草药提取的天然产物或其衍生物是肿 瘤化疗药物的重要来源之一 如长春新碱 喜树碱和 紫杉醇等早已用于临床 UA作为一种五环三萜类 化合物 普遍存在于多种药用植物与水果中 且具有 多种药理活性 如镇静 降糖 抗炎和抗菌等 近年 研究证实 UA还具有明显的抗肿瘤活性 3 3 其抗 瘤机制可能与抑制 S TAT3 NF 等 κb W 有关 4 4 5 但具体机制仍不清楚 本研究证实 UA能明显抑制人结肠癌细胞 HCT6增殖 机制分 析表明 UA的这种作用可能与通过下调 TGF β3表 达 进而抑制 W 信号转导有关 TGF β 是 一 类 分 泌 型 蛋 白 通 过 激 活 经 典 Sm 途径 参与调节细胞的增殖 分化或凋亡等生 F g3 E UATGF 3 HCT 6 β3sm2 A PCR w UA v TGF HCT 6 B W b w β3 2 3 p p Sm 2 3 UA v TGF β3 Sm HCT 6 理过程 TGF β首先与其 Ⅱ 型受体结合 募集并使 Ⅰ型受体磷酸化 活化后的 Ⅰ 型受体再募集并磷酸 化S m 2与 Sm 3 磷 酸 化 的 Sm 2 3使 Sm 4 磷酸化 并与之结合形成异二聚体 然后转位入核 F g4 E TGF p UA HCT 6 β3 A F w m w TGF UA HCT 6 B T v g β3 w TGF p UA HCT 6 C T v g w TGF β3 β3 p b p UA HCT 6 2 M OE2 TGF b β3

5 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Feb;33(2) 195 Fig5 EfectofTGF β3onwnt/β cateninsignalinginhct116cels A:LuciferasereporterasayresultsshowedtheefectofUAonWnt/β catenininhct116cels;b:westernblotanalysisresultsshowedtheefectof UAonGSK 3βandthephosphorylationofGSK 3βinHCT116cels;C:WesternblotanalysisresultsshowedtheefectofTGF β3specificinhibitoronthe UA induceddecreaseofβ catenininhct116cels(2 MeOE2:TGF β3inhibitor);d:westernblotanalysisresultsshowedtheefectoftgf β3onthe UA induceddecreaseofβ catenininhct116cels 与相应的效应元件结合, 调节下游靶基因表达 研究报道,TGF β 信号通路的异常是结肠癌的主要病因之一, 其 3 种亚型均与结肠癌相关 [16] 由于 TGF β3 在肿瘤组织中的表达水平明显要高于正常肠黏膜组织 [9], 因此我们推测 TGF β3 在结肠癌的发展中可能起着关键作用 我们的研究结果已经证实, UA 对结肠癌细胞具有抗增殖作用, 但这种效应是否与 TGF β3 有关仍不清楚 通过进一步分析, 结果显示 UA 明显抑制 TGF β3 表达, 并明显降低 Smad2/3 的磷酸化水平 ; 外源性过表达 TGF β3 则能部分逆转 UA 对 HCT116 细胞的增殖抑制作用, 而抑制 TGF β3 则相应增强 UA 对 HCT116 细胞的抗增殖作用 以上结果提示,UA 对 HCT116 细胞增殖的抑制作用可能与其下调 TGF β3 表达有关, 但 TGF β3 介导 UA 这种作用的机制尚不清楚 Wnt/β catenin 信号的异常是结肠癌的重要发病原因之一 这种异常可能与其重要成员突变有 关, 如 APC 和 β catenin 等 [11] 除此之外,Wnt/β catenin 信号本身也受其他信号的调节, 如 IGFs PI3K/Akt p53 TGF β 等 其中,TGF β3 受到 Wnt/ β catenin 信号的调节 [17], 即 TGF β3 与 Wnt/β cate nin 信号之间可能存在相互调节的关系, 但在结肠癌细胞中,TGF β3 与 Wnt/β catenin 信号之间的关系仍不清楚 我们的实验结果显示, 在 HCT116 细胞中,UA 明显抑制 Wnt/β catenin 信号转导, 并明显降低 β catenin 的蛋白表达水平 ; 外源性过表达 TGF β3 部分逆转 UA 对 β catenin 表达的抑制作用 ; 抑制 TGF β3 则能促进 UA 对 β catenin 表达的抑制作用 本研究表明,UA 对人结肠癌 HCT116 细胞具有增殖抑制作用, 这种作用可能与其通过下调 TGF β3 表达水平, 进而抑制 Wnt/β catenin 信号转导有关 但在结肠癌细胞中,UA 抑制 TGF β3 表达, 以及 TGF β3 调节 Wnt/β catenin 信号转导的具体过程还

6 196 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2017Feb;33(2) 有待进一步深入研究 [ 致谢 : 本实验在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成 感谢何通川教授 (Tong ChuanHe, 芝加哥大学医学中心 ) 为本研究提供重组腺病毒 ] 参考文献 : [1] RoyS,MajumdarAP.Signalingincoloncancerstemcels[J].J MolSignal,2012,7(1):11. [2] ZangLL,WuBN,LinY,etal.Researchprogresofursolic acid santi tumoractions[j].chinjintegrmed,2014,20(1): [3] ChenH,GaoY,WangA,etal.Evolutioninmedicinalchemistry ofursolicacidderivativesasanticanceragents[j].eurjmed Chem,2015,92: [4] 唐丹, 李剑萍, 郑锡凤, 等. 熊果酸通过 STAT3 通路调控胃癌细胞增殖和凋亡 [J]. 中国药理学通报,2012,28(2): [4] TangD,LiJP,ZhengXF,etal.Ursolicacidregulatestheprolif erationandaoptosisingastriccancerthroughstat3pathway[j]. ChinPharmacolBul,2012,28(2): [5] 朱悦, 周逸婵, 朱国琴, 等. 熊果酸抑制胃癌细胞 COX 2 表达的信号转导研究 [J]. 中国药理学通报,2016,32(7): [5] ZhuY,ZhouYC,ZhuGQ,etal.Signaltransductionpathwayof ursolicacidinhibitingcox 2expresioningastriccancercels [J].ChinPharmacolBul,2016,32(7): [6] ParkJH,KwonHY,SohnEJ,etal.InhibitionofWnt/beta cateninsignalingmediatesursolicacid inducedapoptosisinpc 3 prostatecancercels[j].pharmacolrep,2013,65(5): [7] YieY,ZhaoS,TangQ,etal.Ursolicacidinhibitedgrowthof hepatocelularcarcinomahepg2celsthroughampkalpha media tedreductionofdnamethyltransferase1[j].molcelbiochem, 2015,402(1-2): [8] PrasadS,YadavVR,SungB,etal.Ursolicacidinhibitsgrowth andmetastasisofhumancolorectalcancerinanorthotopicnude mousemodelbytargetingmultiplecelsignalingpathways:chemo sensitizationwithcapecitabine[j].clincancerres,2012,18 (18): [9] LavertyHG,WakefieldLM,OcclestonNL,etal.TGF beta3 andcancer:areview[j].cytokinegrowthfactorrev,2009,20 (4): [10] GuereroF,HerenciaC,AlmadenY,etal.TGF betaprevents phosphate inducedosteogenesisthrough inhibition ofbmp and Wnt/beta catenin pathways[j]. PLoS One,2014,9(2): e [11] 刘映孜, 金洁利, 黄军, 等. 粉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖与 Wnt/β catenin 信号的关系研究 [J]. 中国药理学通报, 2014,29(1):30-4. [11]LiuYZ,JinJL,HuangJ,etal.Studyontherelationshipbe tweentheanti proliferationefectoftetrandrineandwnt/β catenin signalincoloncancercels[j].chinpharmacolbul,2014,29 (1):30-4. [12] LuoJ,DengZL,LuoX,etal.Aprotocolforrapidgenerationof recombinantadenovirusesusingtheadeasysystem[j].natpro toc,2007,2(5): [13]KashyapD,TuliHS,SharmaAK.Ursolicacid(UA):ametabo litewithpromisingtherapeuticpotential[j].lifesci,2016,146: [14] KimJH,KimYH,SongGY,etal.Ursolicacidanditsnatural derivativecorosolicacidsupprestheproliferationofapc mutated coloncancercelsthroughpromotionofβ catenindegradation[j]. FoodChemToxicol,2014,67: [15] LinJ,ChenY,WeiL,etal.Ursolicacidinhibitscolorectal cancerangiogenesisthroughsuppresionofmultiplesignalingpath ways[j].intjoncol,2013,43(5): [16]LampropoulosP,Zizi SermpetzoglouA,RizosS,etal.TGF beta signalingincoloncarcinogenesis[j].cancerlet,2012,314 (1):1-7. [17]HeF,XiongW,WangY,etal.EpithelialWnt/β cateninsigna lingregulatespalatalshelffusionthroughregulationoftgfβ3ex presion[j].devbiol,2011,350(2): RelationshipbetweenTGF β3and anti proliferativeefectofursolicacidinhumancoloncancercels SHAOYing 1,2,WANGDong xu 1,2,CHENQian zhao 1,2, ZENGYu hua 1,2,ZHOULin yun 1,2,ZHOUYi 1,2,RENWen yan 1,2,HEBai cheng 1,2 (1.DeptofPharmacology,2.ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistry andmolecularpharmacology,chongqingmedicaluniversity,chongqing ,China) Abstract:Aim ToinvestigatetheroleofTGF β3in theanti proliferationefectofursolicacid(ua)inco loncancercelsandtheposiblemolecularmechanism underlyingthisefect.methods Weintroducedcrys talvioletstaining,flowcytometryandwesternblotas saytodeterminetheefectofua onproliferationand apoptosisinhct116cels.thelevelsoftgf β3, Smad2/3andβ catenininhct116celwereevaluated byrt PCRandWesternblot.Finaly,TGF β3inhibi torandrecombinantadenovirus,andluciferasereporter asaywereused toanalyzetheposiblemechanism throughwhichtgf β3mediatedtheanti cancerefect ofua inhct116cels.results UA inhibitedthe proliferation and induced apoptosis apparently in HCT116cels.UA down regulatedtgf β3bothin mrnaandinproteinlevel.meanwhile,uadecreased

7 thephosphorylationofsmad2/3concentrationdepend ently,althoughnosignificantefectwasfoundonthe totalproteinlevelofsmad2/3inhct116cels.over expresionoftgf β3atenuatedtheinhibitoryefectof UA ontheproliferationofhct116 cels,whilethe TGF β3 inhibitorpotentiated thisefect. UA sup presedthetransconductionofwnt/β cateninsignaling inhct116celsthroughdecreasingthelevelofβ catenin.exogenousexpresionoftgf β3 increased thelevelofβ cateninandpartlyreversedtheua in duceddecreaseofβ catenin.however,tgf β3inhib itorpotentiatedtheinhibitoryefectofuaonβ catenin inhct116cels.conclusion Theanti proliferation activityofuaincoloncancermaybepartlymediated throughdown regulatingtgf β3tosuppreswnt/β cateninsignalingatleast. Keywords:ursolicacid;coloncancer;anti prolifera tion;apoptosis;tgf β3;wnt/β catenin

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