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1 :23 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 215, 37(2): DOI: /cjcb 逆转乳腺癌耐药细胞株耐药性的研究刘浩贺智敏 ( 广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所, 广州 5195) 摘要研究表明, mir-34 在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用, 然而, mir-34 在肿瘤耐药中的作用研究不多该研究将合成的成熟序列转染乳腺癌阿霉素耐药细胞 (), 探讨体外逆转细胞耐药性作用及其可能的机制采用 Real-time RT-PCR 检测在乳腺癌耐药细胞株中的表达, MTS 法检测对细胞阿霉素耐药性的影响, 流式细胞术检测对细胞周期和凋亡的影响, Real-time RT- PCR 和 Western blot 法检测多药耐药相关蛋白 MDR MRP 以及细胞周期与凋亡相关蛋白 Bcl-2 E2F3 的表达结果显示, 在乳腺癌耐药细胞中低表达, 转染可明显增加耐药细胞对阿霉素的敏感性 ; 流式分析发现, 可以促进耐药细胞 G 2 期细胞周期阻滞和凋亡 ; 与对照组相比较, 转染组细胞 MDR MRP 蛋白表达无明显变化, 而 Bcl-2 E2F3 mrna 和蛋白表达均明显下调该研究表明, 直接靶向抑制 Bcl-2 和 E2F3 的表达, 诱导细胞周期 G 2 期阻滞和凋亡, 进而增强耐药细胞对阿霉素的敏感性关键词 ; 乳腺癌 ; 耐药 ; 细胞周期阻滞和凋亡 The Reversing and Molecular Mechanisms of on the Cells with Doxorubicin-Resistance Liu Hao, He Zhimin (Cancer Hospital and Cancer Research Institute, Guangzhou Medical University, Guangzhou 5195, CHina) Abstract Recently, some studies showed that mir-34 played an important role in tumor development and progress, but there were few studies on the function of mir-34 in drug resistance. To elucidate the function and mechanism of exogenous involved in drug resistance in the breast cancer cells, mimics was used to transfect into cells with doxorubicin-resistance. The expression of mir-34 was analyzed by Realtime RT-PCR. Cell viability was analyzed by MTS assay. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by PI and Annexin V/PI staining, respectively. The expression of the drug-resistant related protein MDR and MRP, and cell proliferation and apoptosis related protein Bcl-2 and E2F3 were analyzed by Real-time RT-PCR and Western blot. Our results showed that was significantly down-regulated in cells, and overexpression of increased sensitivity to Doxorubicin in cells. Flow cytometry analysis showed that mir- 34c could induce G 2 cell cycle arrest and cell apoptosis. Furthermore, did not affect the expression of 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : ) 资助的课题通讯作者 Tel: , hezhimin25@yahoo.com Received: September 24, 214 Accepted: December 1, 214 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No ) Corresponding author. Tel: , hezhimin25@yahoo.com

2 23 研究论文 MDR and MRP, but significantly inhibited the mrna and protein expression of Bcl-2 and E2F3. Our results suggested that could directly target and inhibit Bcl-2 and E2F3 expression, and induced G 2 cell cycle arrest and apoptosis, which in turn increased sensitivity to Doxorubicin in cells. Keywords ; breast cancer; drug-resistance; cell cycle arrest and apoptosis 乳腺癌是一类严重危害妇女健康的恶性肿瘤, 其全球发病率居女性恶性肿瘤之首 [1] 我国女性乳腺癌发病率逐年升高, 并有逐步年轻化的趋势 [2] 目前, 化疗仍是乳腺癌临床治疗的主要方法之一, 然而因化疗耐药导致的肿瘤复发和转移严重限制着乳腺癌的临床治疗效果 MicroRNA(miRNA) 是一段长 19~25 bp 的单链 RNA 分子, 可通过不完全配对与靶标 mrna 3 - 非翻译区 (3 -UTR) 结合, 在转录后水平对基因的表达进行调控, 导致目的 mrna 的降解或蛋白质翻译抑制 mirnas 参与细胞的分化增殖和凋亡等多种生物学进程 [3] 近年来的研究表明, mirna 在多种肿瘤中存在异常表达, 并且在肿瘤的增殖分化侵袭转移和治疗中扮演了重要的角色 [4] mir-34 是一个保守的 mirna 家族, 由 mir-34a mir-34b 和 mir- 34c 三个同源的 mirna 分子组成 [5] 临床研究发现, mir-34 在肺癌肝癌乳腺癌和结肠癌等多种肿瘤中低表达, 被认为是肿瘤发生的一个普遍事件 [6-1] 然而, mir-34 在乳腺癌耐药性中的作用研究不多在本研究中, 我们发现, 在乳腺癌阿霉素耐药细胞中低表达, 过表达可以逆转耐药细胞的耐药性, 抑制细胞增殖并促进凋亡我们的结果说明, 可通过调控增殖与凋亡相关蛋白表达而逆转乳腺癌的阿霉素耐药作用 1 材料与方法 1.1 材料与试剂乳腺癌及耐药细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞库 DMEM 培养基胎牛血清 (fetal calf serum, FBS) 胰蛋白酶购自 Gibco 公司 ; 转染试剂 Lipofectamine TM 2 购自 Invitrogen 公司 ; ECL 化学发光底物试剂盒购自 Pierce 公司 ; Quick Start Bradford 蛋白定量试剂购自 Bio- Rad 公司 ; Primescript RT reagent Kit 反转录试剂盒和 SYBR Premix Ex Tap TM 试剂盒购自 TaKaRa 公司 ; MTS 购自 Promega 公司 ; Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 购自碧云天生物技术研究所抑制剂 (anti-mir- 34c) 成熟序列 ( mimics) 和阴性对照 (negative control, ) 购自上海吉玛制药技术有限公司 MDR MPR E2F3 β-actin 抗体购自 Santa Cruz 公司 ; Bcl-2 Snail 抗体购自 CST 公司 ; 预染蛋白质 Marker 购自 Fermentas 公司 ; HRP 标记山羊抗鼠 IgG 山羊抗兔 IgG 购自北京鼎国生物技术有限公司 1.2 细胞培养人乳腺癌及耐药细胞用含 1% 胎牛血清的 DMEM 培养液, 于 37 C 5% CO 2 及饱和湿度的培养箱内培养将耐药细胞暴露于低剂量 [1/1 的半数抑制浓度 (5% concentration of inhibition, IC 5 )] 的阿霉素中维持细胞耐药性 1.3 细胞转染转染前 1 d, 接种及耐药细胞于 6 孔板中, 在细胞密度达 5% 汇合度时进行转染吸去旧培养基, 每孔加入 1 5 μl 完全培养基分别将 5 μl 2 μmol/l anti-( 终浓度为 5 nmol/l) 5 μl 2 μmol/l mimics( 终浓度为 5 nmol/l) mirna-negative control 加入到 25 μl Opti-MEM 培养基中, 轻柔混匀 ; 另外, 用 25 μl Opti- MEM 培养基稀释 1 μl TurboFect TM sirna Transfection Reagent, 轻柔混匀, 室温孵育 5 min; 混合 Opti-MEM- 脂质体与 Opti-MEM-miRNA, 室温孵育 2 min, 形成转染复合物 ; 然后将上述混合物加到细胞培养基中, 轻轻混匀, 在 37 C 5% CO 2 及饱和湿度的培养箱中培养分别于 24 h 后收集细胞进行 MTS 和流式实验, 于 48 h 后提取 RNA 和蛋白质 1.4 MTS 法检测对细胞耐药性的作用取转染的细胞, 以 /ml 接种到 96 孔板中, 1 μl/ 孔, 培养过夜使细胞贴壁向对应试验孔加入不同浓度的阿霉素, 继续培养 72 h, 吸去培养基, 加入 1 μl 含.5 mg/ml MTS 的 RPMI-164, 继续培养 4 h 最后, 用酶标仪测定 49 nm 波长下的光密度 (optical density, D) 值, 并计算药物对细胞的抑

3 刘浩等 : 逆转乳腺癌耐药细胞株耐药性的研究 231 制率抑制率 =(1 实验组 D 值 / 对照组 D 值 ) 1% 以阿霉素浓度为横坐标, 抑制率为纵坐标作图并拟合抑制曲线, 计算 IC 5 值 1.5 流式细胞术检测对细胞周期及凋亡的作用取转染的细胞, 以 /ml 接种到 6 孔板中, 于 37 C 5% CO 2 及饱和湿度的培养箱中培养 24, 48 h 收集细胞, 7% 冰乙醇固定过夜, 5 g/ml Rnase 处理.5 h, 1 g/ml 的碘化丙啶 (PI) 于 4 C 染色 3 min, 流式细胞仪 (Beckman-Coulter 公司 ) 检测分析细胞周期分布 ; 收集细胞, 按照 Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒的说明书要求, 先后加入 Annexin V 和 PI, 避光室温反应 1 min 后, 流式细胞仪检测细胞凋亡 1.6 Real-time RT-PCR 按照 Trizol(Invitrogen) 说明书的方法提取细胞总 RNA, 按 Primescript RT reagent Kit 反转录试剂盒 (TaKaRa) 说明书将 RNA 逆转录为 cdna 引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成引物序列如下 : Bcl-2 上游引物 : 5 -ATG TGT GTG GAG AGC GTC AA-3, 下游引物 : 5 -ACA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3 ; CCND1 上游引物 : 5 -GAG GAA GAG GAG GAG GAG GA-3, 下游引物 : 5 -GAG ATG GAA GGG GGA AAG AG-3 ; CDK6 上游引物 : 5 -AGA GAC AGG AGT GGC CTT GA-3, 下游引物 : 5 -TGA AAG CAA GCA AAC AGG TG-3 ; E2F3 上游引物 : 5 -CCC TAA ACC CGC TTC C-3, 下游引物 : 5 -GTT CAC AAA CGG TCC TTC TA-3 ; OA 上游引物 : 5 - TGC AGC AGA ATG TCT TCC AG-3, 下游引物 : 5 - AAA GTT GGC CTC ACC TTG G-3 ; TAF4B 上游引物 : 5 -AAT CTT TCT CCG ACA ATG CT-3, 下游引物 : 5 -GAC TGT GAT CCA CTA CAT GC-3 ; GAPDH 上游引物 : 5 -GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3, 下游引物 : 5 -TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3 Real-time PCR 反应体系及条件参照 SYBR Premix Ex Tap TM 试剂盒, 2 Ct 法计算 mrna 的相对表达量, 以 GAPDH 作为内参每个实验组重复 3 次 1.7 蛋白提取和 Western blot 分析收集细胞, 经 PBS 洗涤后用三去污裂解液 [5 mmol/l Tris-Cl(pH8.), 15 mmol/l NaCl,.2 g/l 叠氮钠, 1 mg/l Aprotin, 1 mg/l PMSF, 1 g/l SDS, 1 g/l NP-4, 5 g/l 去氧胆酸钠 ] 裂解, 离心后收集上清, 用 Bradford 法测定蛋白浓度 ; 等量蛋白样品经 1% 的 SDS-PAGE 电泳分离后, 转印至 PVDF 膜上, 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h, MDR MRP Bcl-2 E2F3 β-actin 一抗均以 1:1 比例稀释, 4 C 孵育过夜经 PBST 洗涤后, 加入 HRP 标记的特异性二抗以 1:5 比例稀释, 室温下孵育 2 h, 最后用 ECL 化学发光试剂对 X 光片显影, 扫描图片 1.8 统计学方法每组实验重复 3 次, 采用 SPSS 15. 软件 One-way analysis of variance 方式进行方差分析, 两两比较采用 Students t 检验, P<.5 表示差异有统计学意义 2 结果 2.1 在耐药细胞中低表达采用 MTS 法检测阿霉素对细胞以及耐药细胞的增殖抑制作用, 结果发现, 阿霉素能够有效抑制细胞增殖 (IC 5 为 5.3 μmol/l), 而对耐药细胞的增殖抑制作用较弱 (IC 5 为 52.6 μmol/l)( 图 1A) 采用 Real- Cell viability (%) A: MTS 法检测阿霉素对细胞和耐药细胞的增殖抑制作用 ; B: Real-time RT-PCR 检测 mir-34a mir-34b 和在细胞和耐药细胞中的表达 A: effects of Doxorubicin on cell viability of and cells were measured by MTS assay; B: expressions of mir-34 in MCF- 7 and cells were measured by Real-time RT-PCR. 图 1 mir-34 在耐药细胞中的表达 Fig.1 The expression of mir-34 in cells with doxorubicin-resistance DOX (µm) Realtive mirna levels mir-34a mir-34b

232 研究论文 time RT-PCR 检测 mir-34 家族成员在细胞和耐药细胞中的表达情况, 结果发现, mir- 34a mir-34b 在耐药细胞中均下调表达, 且下调表达最为显著 ( 图 1B) 2.2 对细胞与耐药细胞耐药性的影响实验结果显示, 与对照组相比较, 转染组的耐药细胞对阿霉素的敏感性明显增加 ( 图 2A), 转染组 IC 5 为 15.

4 232 研究论文 time RT-PCR 检测 mir-34 家族成员在细胞和耐药细胞中的表达情况, 结果发现, mir- 34a mir-34b 在耐药细胞中均下调表达, 且下调表达最为显著 ( 图 1B) 2.2 对细胞与耐药细胞耐药性的影响实验结果显示, 与对照组相比较, 转染组的耐药细胞对阿霉素的敏感性明显增加 ( 图 2A), 转染组 IC 5 为 15.2 μmol/l, 而对照组 IC 5 为 46.3 μmol/l 相反, 采用抑制剂 (anti) 转染细胞, 结果发现, 转染 anti- 的细胞对阿霉素的敏感性明显降低 ( 图 2B) 2.3 转染抑制 Bcl-2 和 E2F3 的表达为了探讨逆转耐药性的可能机制, 我们首先分析了对 MDR MRP 耐药相关蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示, 与对照组相比较, 转染组细胞中 MDR MRP 耐药相关蛋白的表达没有明显变化 ( 图 3A) 进一步采用流式细胞仪分析发现, 转染并不 DOX (µm) Cell viability (%) Cell viability (%) anti- DOX (µm) A: MTS 法检测转染对耐药细胞存活率的影响 ; B: MTS 法检测转染抑制剂对细胞存活率的影响 A: effects of on cell viability in cells were determined by MTS assay; B: effects of anti- on cell viability in cells were determined by MTS assay. 图 2 对细胞与耐药细胞耐药性的影响 Fig.2 Effects of on cell viability in cells and cells with doxorubicin-resistance MDR MRP Actin (C) 5. Realtive mirna levels Counts A: Western blot 检测转染对耐药细胞耐药相关蛋白 MDR MRP 表达的影响 ; B: 流式细胞检测转染对细胞内阿霉素浓度的影响 ; C: Real-time RT-PCR 检测靶基因在细胞和耐药细胞中的表达情况 ; C: TargetScan 软件预测与 Bcl-2 和 E2F3 的 3 -UTR 互补结合区 ; D: Realtime RT-PCR 检测转染对耐药细胞 Bcl-2 和 E2F3 mrna 表达的影响 ; E: Western blot 检测转染对耐药细胞 Bcl-2 和 E2F3 蛋白表达的影响 A: effects of on the expression of drug-resistant related protein MDR and MRP in cells were measured by Western blot; B: effects of on cellular doxorubicin concentration was determined by flow cytometry analysis; C: the expressions of targets in and cells were measured by Real-time RT-PCR; C: the match sites of on the 3 -UTR of Bcl-2 and E2F3 were predicted by TargetScan; D: effects of on the mrna expression of Bcl-2, E2F3, and CDK6 were measured by Real-time RT-PCR; E: effects of on the protein expression of Bcl-2 and E2F3 were measured by Western blot. 图 3 转染对耐药细胞耐药相关蛋白增殖与凋亡相关蛋白表达的影响 Fig.3 Effects of on the expression of drug-resistant related protein, cell proliferation and apoptosis related protein of cells with doxorubicin-resistance FL3 E3F3 3 -UTR 5...CAAUUAAUUUGUAAACACUGCCA...3 ( ) hsa- 3 CGUUAGUCGAUUGAUGUGACGGA (E) 1.5 (F) Bcl-2 CDK6 CCND1 E2F3 OA TAF4B (D) Bcl-2 3 -UTR 5...UCGAAUCAGCUAUUU -- ACUGCCAA...3 (23-29) hsa- Realtive mirna levels Bcl-2 E2F3 3 CGUUAGUCGAUUGAUGUGACGGA E2F3 Bcl-2 Actin

5 刘浩等 : 逆转乳腺癌耐药细胞株耐药性的研究 h G1 S 2.5% G1 59.2% S 17.6% 22.7% G1 S 6.8% G1 39.5% S 18.9% 32.8% 48h FL3 LIN 123 FL3 LIN % 26.9% G1 56.5% G1 36.7% S 22.7% S 11.1% G1 S 2.1% G1 S 25.3% FL3 LIN FL3 LIN Q1 1.68% Q3 Q4 Q2 1.52% Q1 2.54% Q2 9.29% FL2-H 1 2 FL2-H 1 2 A: PI 染色流式细胞仪检测转染对耐药细胞周期的影响 ; B: Annexin V/PI 染色流式细胞仪检测对耐药细胞凋亡的影响 Q4 93.5% FL1 LIN Q3 3.34% FL1 LIN A: effects of on cell cycle distribution of cells were analyzed by PI staining; B: effects of on cell apoptosis of / DOX were analyzed by Annexin V/PI staining. 图 4 转染对耐药细胞周期和凋亡的影响 Fig.4 Effects of on cell cycle distribution and apoptosis of cells with doxorubicin-resistance 1 1 Q4 76.8% Q % 影响细胞内阿霉素的浓度 ( 图 3B), 提示逆转耐药性可能与减少药物的外排作用无关采用 TargetScan 软件预测靶基因发现, 细胞增殖凋亡相关蛋白 Bcl2 E2F3 CDK6 CCND1 OA TAF4B 的 3 -UTR 均包含的结合位点进一步运用 Real-time RT-PCR 检测显示, Bcl-2 CDK6 E2F3 基因的 mrna 表达水平在耐药细胞中上调表达 ( 图 3C), 且转染能显著抑制 Bcl-2 E2F3 的 mrna 的表达, 却对 CDK6 mrna 表达没有明显的影响 ( 图 3D 和图 3E) 此外, 转染组 Bcl-2 E2F3 的蛋白表达亦明显下调表达 ( 图 3F) 2.4 转染对耐药细胞周期和凋亡的影响采用 PI 染色和流式细胞术检测对 MCF- 7/DOX 耐药细胞周期和凋亡的影响, 结果显示, 转染 24 h 时, 细胞在 G 2 期细胞比例明显增加 ; 而在 48 h 时, 转染组细胞在 Sub-G 1 期的细胞比例明显增加 ( 图 4A) 进一步采用 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒检测发现, 转染组凋亡的细胞比率显著增加 ( 图 4B) 以上结果表明, 上调的表达可以诱导耐药

6 234 研究论文细胞 G 2 期阻滞和细胞凋亡 3 讨论 mir-34 家族是一类重要的肿瘤抑制 mirna, 其在前列腺癌 [7] 结直肠癌 [8] 肺癌 [9] 和乳腺癌 [1] 等多种肿瘤中的下调表达被认为是肿瘤发生发展的普遍事件本研究采用乳腺癌耐药细胞模型发现, 过表达能够增加乳腺癌耐药细胞对化疗药物的敏感性肿瘤细胞增加药物的外排减少药物的吸收是其耐受化疗药物的一种主要手段 ABC 家族的跨膜转运蛋白 MDR MRP 可将药物从细胞内测泵到外侧 [11] 许多研究表明, 乳腺癌阿霉素耐药细胞高表达 MDR 和 MRP, 且抑制 MDR 和 MRP 蛋白的表达能克服乳腺癌阿霉素耐药 [12-13], 然而转染对 MDR 和 MRP 的蛋白表达没有明显的影响, 说明 mir- 34c 逆转乳腺癌细胞耐药的机制可能与减少药物的外排作用无关本研究发现, 诱导耐药细胞 G 2 期阻滞和凋亡, 提示抑制细胞增殖诱导细胞凋亡是逆转乳腺癌细胞耐药的重要机制实验结果显示, E2F3 在乳腺癌 / DOX 耐药细胞中显著高表达 E2F3 是 E2F 转录因子家族成员之一, 是调控细胞周期进程的重要调控蛋白之一已有的研究显示, E2F3 在多种肿瘤中异常表达, 在调节细胞增殖促进肿瘤的发生发展等方面具有重要的作用 [14-15] 近年来, 有研究发现, 许多 mirna 参与调节 E2F3 的表达 [16] 例如, mir-449a mir-141 通过靶向 E2F3 分别抑制肺癌细胞肝癌细胞的增殖 [17-18] Li 等 [19] 发现, 在乳腺癌细胞中 mir- 34a 的功能障碍导致转录因子 E2F3 的表达量增高, 当过表达 mir-34a 后通过下调靶基因 E2F3 mrna 的表达可抑制细胞增殖我们发现, 过表达同样能够抑制 E2F3 的表达, 这可能是过表达诱导乳腺癌耐药细胞周期 G 2 期阻滞的重要因素 Bcl-2 是一个在细胞凋亡中发挥重要作用的蛋白, 可抑制肿瘤细胞的凋亡近年来, 多项研究发现, Bcl-2 的高表达与肿瘤的耐药成正相关 [2-21] Kim 等 [22] 发现, 抑制 Bcl-2 的表达能够增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性本研究发现, 在耐药细胞中, Bcl-2 的蛋白表达水平明显升高, 提示 Bcl-2 介导的抗凋亡是乳腺癌细胞产生耐药的重要机制我们通过生物信息学分析发现, 能够靶向 Bcl-2 的 3 -UTR 区, 而过表达能显著抑制 Bcl-2 mrna 和蛋白表达, 这与流式实验观察到的细胞凋亡率明显上升一致总之, 本研究发现, 在乳腺癌 / DOX 耐药细胞中明显低表达, 过表达能诱导耐药细胞周期 G 2 期阻滞和细胞凋亡, 从而逆转其耐药性, 且负性调控细胞增殖与凋亡相关蛋白 E2F3 Bcl-2 的表达可能是其逆转乳腺癌 / DOX 细胞耐药的重要机制参考文献 (References) 1 Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 213. CA Cancer J Clin 213; 63(1): 郑莹, 吴春晓, 张敏璐. 乳腺癌在中国的流行状况和疾病特征. 中国癌症杂志 (Zheng Ying, Wu Chunxiao, Zhang Minlu. The epidemic and characteristics of female breast cancer in China. China Oncology) 213; 23(8): Garzon R, Fabbri M, Cimmino A, Calin GA, Croce CM. MicroRNA expression and function in cancer. Trends Mol Med 26; 12(12): Adams BD, Kasinski AL, Slack FJ. Aberrant regulation and function of micrornas in cancer. Curr Biol 214; 24(16): Wang R, Ma J, Wu Q, Xia J, Miele L, Sarkar FH, et al. Functional role of mir-34 family in human cancer. Curr Drug Targets 213; 14(1): Hermeking H. The mir-34 family in cancer and apoptosis. Cell Death Differ 21, 17(2): Hagman Z, Larne O, Edsjo A, Bjartell A, Ehrnstrom RA, Ulmert D, et al. is downregulated in prostate cancer and exerts tumor suppressive functions. Int J Cancer 21; 127(12): Roy S, Levi E, Majumdar AP, Sarkar FH. Expression of mir- 34 is lost in colon cancer which can be re-expressed by a novel agent CDF. J Hematol Oncol 212; 5: Garofalo M, Jeon YJ, Nuovo GJ, Middleton J, Secchiero P, Joshi P, et al. MiR-34a/c-dependent PDGFR-α/β downregulation inhibits tumorigenesis and enhances TRAIL-induced apoptosis in lung cancer. PLoS One 213; 8: e Cole KA, Attiyeh EF, Mosse YP, Laquaglia MJ, Diskin SJ, Brodeur GM, et al. A functional screen identifies mir-34a as a candidate neuroblastoma tumor suppressor gene. Mol Cancer Res 28; 6(5): Yang S, Li Y, Gao J, Zhang T, Li S, Luo A, et al. MicroRNA-34 suppresses breast cancer invasion and metastasis by directly targeting Fra-1. Oncogene 213; 32(36): Wind NS, Holen I. Multidrug resistance in breast cancer: from in vitro models to clinical studies. Int J Breast Cancer 211; 211: Hembruff SL, Laberge ML, Villeneuve DJ, Guo B, Veitch Z, Cecchetto M, et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC Cancer 28; 8: 318.

7 刘浩等 : 逆转乳腺癌耐药细胞株耐药性的研究 Foster CS, Falconer A, Dodson AR, Norman AR, Dennis N, Fletcher A, et al. Transcription factor E2F3 overexpressed in prostate cancer independently predicts clinical outcome. Oncogene 24; 23(35): Feber A, Clark J, Goodwin G, Dodson AR, Smith PH, Fletcher A, et al. Amplification and overexpression of E2F3 in human bladder cancer. Oncogene 24; 23(8): Miles WO, Tschop K, Herr A, Ji JY, Dyson NJ. Pumilio facilitates mirna regulation of the E2F3 oncogene. Genes Dev 212; 26(4): Ren XS, Yin MH, Zhang X, Wang Z, Feng SP, Wang GX, et al. Tumor-suppressive microrna-449a induces growth arrest and senescence by targeting E2F3 in human lung cancer cells. Cancer Lett 214; 344(2): Xue J, Niu YF, Huang J, Peng G, Wang LX, Yang YH, et al. mir-141 suppresses the growth and metastasis of HCC cells by targeting E2F3. Tumour Biol 214; 35(12): Li L, Xie X, Luo J, Liu M, Xi S, Guo J, et al. Targeted expression of mir-34a using the T-VISA system suppresses breast cancer cell growth and invasion. Mol Ther 212; 2(12): Yip KW, Reed JC. Bcl-2 family proteins and cancer. Oncogene 28; 27(5): Huang Y, Ray S, Reed JC, Ibrado AM, Tang C, Nawabi A, et al. Estrogen increases intracellular p26bcl-2 to p21bax ratios and inhibits taxol-induced apoptosis of human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 1997; 42(1): Kim R, Tanabe K, Emi M, Uchida Y, Toge T. Modulation of tamoxifen sensitivity by antisense Bcl-2 and trastuzumab in breast carcinoma cells. Cancer 25; 13(1):

23 研究论文 nificantly inhibited the mrna and protein expression of Bcl-2 and E2F3. Our results suggested that could directly target and inhibit Bcl-2 and

23 研究论文 nificantly inhibited the mrna and protein expression of Bcl-2 and E2F3. Our results suggested that could directly target and inhibit Bcl-2 and Chinese Journal of Cell Biology 215, 37(2): 229 235 DOI: 1.11844/cjcb.215.2.289 逆转乳腺癌耐药细胞株摘要耐药性的研究刘浩贺智敏 ( 广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所, 广州 595) mir-34 在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用, 然而, mir-34 在肿瘤耐药中的作用研究不多该研究将合成的成熟序列转染乳腺癌阿霉素