中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1):91~6 91 网络出版时间 : :50 网络出版地址 :htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r

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鳜饶裴
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1 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1):91~6 91 网络出版时间 : :50 网络出版地址 :htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html 环阿尔廷烷型四环三萜化合物对 HCT116 细胞增殖细胞周期和凋亡的影响代晓丽 1, 刘静 1, 年寅 2, 邱明华 2 1, 张继虹 (1. 昆明理工大学医学院衰老与分子遗传学实验室 ;2. 中国科学院昆明植物研究所, 云南昆明 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) 中国图书分类号 :R282 71;R329 24;R329 25;R329 28; R ;R979 1 摘要 : 目的探讨升麻中分离的环阿尔廷烷型四环三萜化合物 (KY17) 对人结肠癌 HCT116(p53WT) 细胞增殖凋亡细胞周期的影响方法 MTT 法测定 KY17 对小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 和 HCT116 细胞株增殖的影响 ; 检测 KY17 对 HCT116 细胞周期的影响 ; 荧光显微镜流式细胞仪分析细胞凋亡情况 ;Westernblot 法检测 KY17 对细胞凋亡蛋白 PARP 表达的影响 ;qpcr 法检测 mirna 34a 的表达情况结果 KY17 处理 MEF 细胞的 IC 50 值为 27 28μmol L -1 KY17 处理 HCT116 细胞的 IC 50 值为 9 31μmol L -1, 细胞周期阻滞在 G 2 /M 期, 且凋亡蛋白 PARP 有切割 ; 同时,miRNA 34a 上调,p53 蛋白表达量增加结论 KY17 对 HCT116 细胞的增殖具有抑制作用, 使细胞周期停滞于 G 2 /M 期, 最终诱导肿瘤细胞的凋亡, 其作用机制与 mirna 34a 上调 p53 基因激活有关关键词 : 升麻 ; 环阿尔廷烷型四环三萜 ; 结直肠癌 ; 抑制增殖 ; 凋亡 ; 周期阻滞 ; 抗肿瘤结直肠癌属于一种常见消化道系统恶性肿瘤, 其发病率和死亡率较高 [1], 尤其是亚洲国家, 包括中国 [2] 目前, 治疗结肠癌的有效药物非常少, 急需探索开发 [3] 升麻 CimicifugafoetidaL. 是毛茛科升麻属多年生草本植物, 它的根茎 ( 主要入药部分 ) 已经收录在中国药典中我国云南省的大理香格里拉地区有丰富的云南升麻 (C.yunnanensis) 和绿升麻 (C.foetida) [4] 目前, 从升麻属植物中提取分离的单体化合物主要有环阿尔廷烷型三萜皂苷 ( 如收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 昆明理工大学人才培养基金资助项目 (NoKKSY ) 作者简介 : 代晓丽 (1988-), 女, 硕士, 助理讲师, 研究方向 : 分子药理学,E mail:yndaixiaoli@126.com; 张继虹 (1972-), 女, 博士, 教授, 研究方向 : 分子药理学, 通讯作者,E mail:zhangjihong2000@126.com 升麻醇和升麻亭 ) 和肉桂酸衍生物 ( 如咖啡酸和阿魏酸 ) 具有抗过敏缓解妇女更年期综合症抗肿瘤等广泛的药理活性 [5] 研究发现, 兴安升麻中三萜皂苷对急性粒细胞白血病细胞和肝癌细胞有很强的细胞毒作用, 其机制可能与细胞周期抑制有关 [6] 体外研究发现, 具有细胞毒活性的三萜皂苷类化合物对 12 种人肿瘤细胞株具有一定杀伤效果, 特别是肺癌 A549 细胞株效果明显 [7] 同时, 在人肿瘤裸鼠模型上也表现出对肿瘤生长的抑制作用 [8] 另有研究发现, 类叶升麻苷通过抑制小鼠皮层组织 caspase 3 基因表达, 进而维持皮层组织神经细胞的正常形态及数量, 对小鼠脑损伤具有明显保护作用 [9] 从中药材的地域特异性出发, 对取材于云贵高原的升麻提取物进行抗肿瘤活性研究, 将对未来研究抗肿瘤药物提供依据 1 材料与方法 1.1 材料细胞株人类结肠癌上皮细胞株 (HT 29 HCT116 SW480) 人类乳腺癌细胞株 (MCF 7 SK BR 3 MDA MB 468) 购自中国科学院上海细胞库 ; 正常野生型小鼠成纤维 MEF 细胞由本实验室提供受试化合物与试剂化合物 KY17 由中国科学研究院昆明植物研究所提取分离噻唑蓝 (MTT, 货号 M2128) DMSO( 货号 D2650) 碘化丙啶 (PI, 货号 P4170) 均购自美国 Sigma 公司 ;Annex inⅤ(bd 公司, 货号 );RPMI1640 培养基 (Gibco 公司, 货号 );RNA 提取试剂盒 ( 天根生物科技, 货号 DP419); 凋亡染色试剂盒 ( 北京四正柏生物公司, 货号 FXP021); 胎牛血清 (Bio logicalindustries, 货号 B/A) 1.2 方法 MTT 法检测细胞增殖细胞培养后, 待细胞传代 3 次以上, 选择生长稳定且处于对数期的细胞接种于 96 孔板中, 在 37 CO 2 培养箱内培养, 使其贴壁生长加药处理后, 放回培养箱中培养 72h 后, 先观察药物处理后细胞生长情况密度形态等

2 92 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) 再加入 20μLMTT(0 5g L -1 ), 在培养箱中培养 4 h 然后小心吸出培养基, 并加入 150μLDMSO, 在 37 避光恒温箱里震荡 10min, 用酶标仪在 490nm 波长下测定每孔的吸光值 (OD) 根据 OD 值计算 IC 50 值 PI 染色测定细胞周期以每孔个细胞接种于 6 孔板中, 待细胞贴壁之后, 加药处理药物处理时间到达后收集细胞, 用 1 PBS 洗 2 次, 1000 g, 离心 5min 用 70% 的乙醇 4 固定过夜加入 RNAnase 缓冲 (RnaseA1μg L -1,EDTA 20mmol L -1,1 PBS)37 温育 30min 后, 加入 PI 工作液 (1mg L -1 ), 并轻轻混匀, 常温避光染色 2h 流式细胞仪检测 DNA 含量变化, 采用 Flow jo7 6 软件进行分析统计 AnnexinⅤ /PI 双染色检测细胞凋亡以每孔个细胞接种于 6 孔板中, 待细胞贴壁之后, 加药处理药物处理时间到达后, 收集细胞用 400 目的尼龙筛进行过滤, 用血球计数板进行细胞计数, 每个样品收集个细胞将细胞沉淀按照试剂盒的说明书, 用 100μL 的缓冲液重悬, 每个样品加入 5μL 的 AnnexinV FITC,37 避光染色 20 min 每个样品加入 10μL 的 PI 染液,37 避光染色 10min 流式细胞仪检测, 根据阴性对照组进行设门和调节电压, 采用 BD AccuriC6 进行分析统计蛋白免疫印迹技术经药物处理后, 收集细胞沉淀, 再用细胞裂解液提取总蛋白 Bradford 法进行蛋白定量按照定量浓度, 每孔上样量为 15 μg, 金属浴 100 恒温 10min, 冷却后, 上样经 4% ~20% 的梯度胶进行约 1 5~2h 180V 恒压 SDS PAGE 电泳待电泳结束后, 将蛋白全部转移到 PVDF 膜上转膜完毕, 用 PBST 清洗 2 次, 每次 5 min 将膜放入 PBST 配制的 10% 脱脂奶缓冲液中封闭 1h, 再用 PBST 清洗 3 次, 每次 5min 加入按 1 10 稀释好的一抗, 放于 4 摇床摇晃过夜再用 PBST 清洗 3 次, 每次 5min 加入用 PBST 稀释好的二抗, 室温摇床摇晃 1~1 5h,PBST 清洗 3 次, 每次 10min 清洗干净的膜按顺序摆放在暗盒上, 正面朝上, 加上显影发光剂, 检测蛋白实时荧光定量 PCR 每孔个细胞接种于培养皿中, 待细胞完全贴壁后, 加药处理, 试剂盒提取总 RNA, 用紫外分光光度仪测 RNA 浓度参照 First StrandSynthesisSystem forq PCR 试剂盒说明书反转录成 cdna 将 cdna 加 ddh 2 O 稀释, 使用 5 SYBRGreenPCRMasterMix 的反应体系分装到 RT PCR 专用 96 孔板中, 荧光定量 PCR 仪检测引物序列如下 :mirna 34aForward:5 TG GCAGTGTCTTAGCTGG 3,Reverse:5 TATCCAGTG CGTGTCGTG 3 ;U6Forward:5 CGCTTCACGAATTT GCGTGTCAT 3,Reverse5 GCTTCGGCACATATACT AAAAT 3 ;GAPDH Forward5 TGCACCACCAACTG CTTAG 3,Reverse5 GGCATGGACTGTGGTCAT 统计学处理统计学方法采用 SPSS19.0 软件, 各组数据均用 x±s 珋表示, 组间比较采用方差分析 2 结果 2.1 KY17 对肿瘤细胞增殖的影响为了检测升麻中提取的化合物对肿瘤细胞增殖的影响, 我们选用了两株小鼠肿瘤细胞 (p53 / +v+ras/p53 / +s +Ras) 和一株正常野生型小鼠成纤维 (MEF) 细胞 MTT 检测结果表明,KY17 作用于 MEF 细胞的 IC 50 为 27 28μmol L -1, 作用于小鼠肿瘤胞的 IC 50 分别为 13 10μmol L -1 和 13 94μmol L -1, 约为小鼠正常细胞的 2 08 和 1 96 倍 (Tab1), 结果提示 KY17 具有一定的抗肿瘤活性我们还检测了 KY17 对人类结肠癌上皮细胞 (HT 29 HCT116 SW480) 人类乳腺癌细胞 (MCF 7 SK BR 3 MDA MB 468) 增殖的影响结果表明,KY17 的对结肠癌上皮细胞株具有抑制增殖的作用, 对乳腺癌细胞株的抑制作用较小, 且 IC 50 值都大于 50μmol L -1 KY17 对 HCT116 细胞的抑制作用较明显, 当 KY17 浓度到达 1μmol L -1 时, 与对照组相比有明显的抑制作用,IC 50 值为 9 31μmol L -1 (Tab1,Fig1) Tab1 TumorproliferationactivityinhibitedbyKY17 Tumorcellines KY17IC 50 /μmol L -1 p53 / +v+ras p53 / +s+ras MEF HCT116(p53WT) 9.31 HT 29(p53R273H) 8.84 SW480(p53R273H) 8.75 SK BR 3 MDA MB 468 MDA MB 231 MCF KY17 对 HCT116 细胞周期的影响细胞周期调控紊乱导致的肿瘤细胞失控性增殖是恶性肿瘤最常见的生物学特征因此, 通过流式细胞仪检测

ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) 93 KY17 对 HCT116 细胞的周期变化情况如 Fig2 所示, 与对照组 (26 60%) 相比, 用 KY17 处理 HCT116 细胞的 DNA 合成期和分裂期 (G 2 /M) 的细胞比例增加, 分别为 36 61% 38 05% 38 91%, 有浓度依赖性结果表明, 化合物 KY17

3 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) 93 KY17 对 HCT116 细胞的周期变化情况如 Fig2 所示, 与对照组 (26 60%) 相比, 用 KY17 处理 HCT116 细胞的 DNA 合成期和分裂期 (G 2 /M) 的细胞比例增加, 分别为 36 61% 38 05% 38 91%, 有浓度依赖性结果表明, 化合物 KY17 抑制结肠癌细胞增殖通过 G 2 /M 期周期阻滞来实现 Fig1 KY17inhibitionofHCT116celproliferation detectedbymttasay A:ChemicalstructureofKY17;B:KY17onHCT116celprolifer ation. P<0 05, P<0 01vscontrol 2.3 KY17 诱导 HCT116 细胞凋亡 KY17 处理 HCT116 细胞 48h,AnnexinⅤ /PI 双染后, 用荧光显微镜观察细胞的荧光强度早期凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸 (PS) 外翻, 并与 AnnexinⅤ 结合, 出现绿色荧光随着浓度增加, 带有绿色荧光的细胞数量越来越多, 表明早期凋亡的细胞比例增多 (Fig3A) 与对照组 (2 04%) 相比,KY17 处理 HCT116 早期凋亡的细胞比例分别为 14 26% 15 32% 30 46% 晚期凋亡的细胞核上易被 PI 染色, 发出橙红色荧光与对照组 (0 8%) 相比,KY17 处理 HCT116 晚期凋亡的细胞比例为 9 14% 13 87% 28 00%(Fig 3B) 为了确证 KY17 能诱导 HCT116 凋亡, 采用流式细胞术分析 KY17 处理 24 48h 的 HCT116 细胞的凋亡情况 Fig4 结果显示,KY17 处理 24h, 早期 Fig2 EfectofKY17oncelcycleofHCT116cels A:KY17histogramofHCT116celscycle;B:Quantitativemapof KY17onHCT116cels. 凋亡比例趋于平稳 ; 而与对照组 (1 1%) 相比, 晚期凋亡的细胞比例增加至 1 3% 6 2% 5 6% KY17 处理 48h, 与对照组 (3 6%) 相比, 早期凋亡的细胞比例增加至 4 3% 5 0% 5 1%, 晚期凋亡的细胞比例从对照组的 2 3% 增加至 2 5% 3 5% 9 9% 结果表明,KY17 呈浓度依赖和时间依赖性地诱导 HCT116 细胞凋亡用 Westernblot 检测凋亡相关蛋白 PARP 的表达情况 Fig5 结果显示,KY17 处理后的细胞,PARP 蛋白有切割随着 KY17 浓度的增加,PARP 蛋白切割越明显相同浓度处理 48h 的切割比 24h 更加明显以上结果表明, 化合物 KY17 可诱导 HCT116 细胞凋亡 2.4 KY17 对 HCT116 细胞 mirna 表达影响 p53 是重要的抑癌基因, 能够调节许多 mirna 的表达为了研究 KY17 是否调控 mirna 的表达, 用 10μmol L -1 的 KY17 处理 HCT116 细胞 72h

4 ９４ＣｈＰｈｍｇＢｕ２０１８Ｊ３４１Ｆｇ３ＥＫＹ１７ＨＣＴ１１６ｂｕｍＡＦｕｍｗｕｄｄｈＨＣＴ１１６ＫＹ１７ＢＦｕｍｗｕｄｑｕｖＰ００１ｖＦｇ４ＥＫＹ１７ＨＣＴ１１６ｂｗｍＡＦｗｍｗｕｄｄＫＹ１７ＨＣＴ１１６ＢＣｑｕｖｂｇｈＰ００５Ｐ００１ｖ

ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) 95 Fig5 EfectofKY17onHCT116celPARP proteinexpresionbywesternblot 后,qPCR 检测发现 KY17 使 HCT116 细胞的 mir NA 34a 上调 1 倍 (Fig6A) 同时, 检测发现 p53 蛋白表达增加 (Fig6B) Fig6

5 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) 95 Fig5 EfectofKY17onHCT116celPARP proteinexpresionbywesternblot 后,qPCR 检测发现 KY17 使 HCT116 细胞的 mir NA 34a 上调 1 倍 (Fig6A) 同时, 检测发现 p53 蛋白表达增加 (Fig6B) Fig6 EfectofKY17onmiRNA 34aandp53 proteininhct116cels A:ExpresionofmiRNA 34ainHCT116celswasdetectedby qpcr;b:expresionofp53proteininhct116celswasanalyzedby Westernblot. P<0 01vscontrol 3 讨论近年来, 包括本实验室在内的多个研究团队发现升麻中含有很多抗肿瘤的活性物质本实验室先前研究发现 KY17 对乳腺癌细胞抑制活性较弱, 但能诱导结肠癌 HT 29 细胞发生凋亡和自噬 [10] 另有研究表明, 从云南升麻中得到的新骨架分子 Ci myunninsa D 存在乳腺癌抑制活性, 这些分子的抗血管生成活性与一线药物舒尼替尼相当, 它们代表了一种新颖的抗血管生成活性分子的结构模板 [11] 与此同时, 研究还发现, 其中一个分子 KHF16 能够有效抑制三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞系 (MDA MB 468 细胞 SW527 细胞 ) 的体外存活, 降低 XIAP Mcl 1 Survivin 和 CyclinB1/D1 等蛋白的表达水平, 并能抑制 TNBC 细胞中 NF κb 信号通路 [12] 这些研究结果表明, 来源于升麻的活性分子具有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性, 并且拓宽了研究者对升麻抗肿瘤活性的认识, 为中药升麻的研究提供了思路本研究发现, 升麻中环阿尔廷烷型四环三萜化合物 KY17 对 HCT116 细胞具有抑制增殖的作用, 并且呈现药物浓度依赖性这种抑制增殖的作用通过诱导 HCT116 细胞 G 2 /M 期阻滞和细胞凋亡来实现我们还发现 KY17 激活 PARP 蛋白表达, 进而诱导 HCT116 细胞凋亡但是, 细胞周期调控和细胞凋亡涉及多因子和多层次作用, 还需要进一步研究探索 p53 是最重要的抑癌基因, 研究发现 p53 能够调节许多 mirna 的表达 [13] 其中,miRNA 34a 是一类在进化上高度保守的 mirna, 其主要功能包括细胞周期的阻滞和诱导细胞凋亡 [14] 同时,DNA 的损伤也能诱导 mirna 34a 的表达上调, 而 mir NA 34a 的上调依赖于 p53 基因的激活 [15] 本研究初步探索发现,KY17 作用于 HCT116 细胞会诱导 p53 激活, 同时诱导 mirna 34a 上调因此,KY17 诱导 HCT116 细胞周期阻滞和凋亡是通过激活 PARP 和 p53 表达, 上调 mirna 34a 来实现的新分子化合物通过调控肿瘤细胞的信号通路, 诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞来抑制增殖的研究是当今的热点, 这也为本研究提供了方向 ( 致谢 : 本实验在昆明理工大学医学院衰老与分子遗传学实验室完成, 在此致以由衷的感谢!) 参考文献 : [1] JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globlalcancerstatistics[J]. CAcancerJClin,2011,61(2): [2] XiongF,WuC,BiX,etal.Riskofgenome wideasociation study identifiedgeneticvariantsforcolorectalcancerinachinese population[j].cancerepidemiolbiomarkersprev,2010,19(7):

6 96 ChinesePharmacologicalBuletin 2018Jan;34(1) [3] LaubertT,HabermannJK,HemmelmannC,etal.Metachro nousmetastasis andsurvival analysisshowprognosticimportance oflymphadenectomyforcoloncarcinomas[j].bmcgastroen terol,2012,12:24. [4] YamakuchiM,FerlitoM,LowensteinCJ.MiR 34arepresion ofsirt1regulatesapoptosis[j].procnatlacadsciu SA, 2008,105(36): [5] 曹丽, 杨卫彬, 潘瑞乐, 等. 兴安升麻总苷抗肿瘤药效研究 [J]. 中国中医药信息杂志,2008,15(12):31-3. [5] CaoL,YangW B,PanRL,etal.Experimentalstudyonantitu morefectsoftotalglycosideofcimicifugadahuricamaxim[j]. ChinJInfTraditChinMed,2008,15(12):31-3. [6] GaoJC,HuangF,ZhangJH,etal.CytotoxicCycloartaneTriter penesaponinsfrom Actaeaasiatica[J].JNatProd,2006,69 (10): [7] SunLR,QingC,ZhangYL,etal.CimicifoetisidesAandB, twocytotoxiccycloartanetriterpenoidglycosidesfromtherhizomes ofcimicifugafoetida,inhibitproliferationofcancercels[j]. BeilsteinJOrgChem,2007,3:3. [8] 吴德松, 卿晨. 升麻药理学活性研究进展 [J]. 医学综述, 2009,15(6): [8] WuDS,QingC.Investigationprogresonpharmaclogicalactivi tiesofcimicifugarhizoma[j].medrecapitulate,2009,15(6): [9] 彭晓明, 高莉, 霍仕霞, 闫明. 类叶升麻苷对阿尔采末病小鼠皮层 caspase 3 基因表达的影响 [J]., 2014,30(12): [9] PengXM,GaoL,HuoSX,YanM.Efectsofacteosideonex presionofcaspase 3incerebralcortexofmousemodelsofAlzhe imer sdisease[j].chinpharmacolbul,2014,30(12): [10] DaiX L,LiuJ,NianY,etal.A novelcycloartanetriterpenoid fromcimicifugainducesapoptoticandautophagicceldeathin humancoloncancerht 29cels[J].OncolRep,2017,37(4): [11] KongYJ,NianY,LiuTY,etal.NewAnti angiogenicleading structurediscoveredinthefruitofcimicifugayunnanensis[j]. SciRep,2015,5: [12] KongYJ,NianY,ZhouZM,etal.KHF16isaleadingstructure fromcimicifugafoetidathatsuppresesbreastcancerpartialyby inhibitingthenf kbsignalingpathway[j].theranostics,2016,6 (6): [13] HeL,HeX,LimLP,etal.AmicroRNAcomponentofthep53 tumoursuppresornetwork[j].nature,2007,447(7148): [14] HermekingH.ThemiR 34familyincancerandapoptosis[J]. CelDeathDifer,2010,17(2): [15] TazawaH,TsuchiyaN,IzumiyaM,NakagamaH.Tumor suppres sivemir 34ainducessenescence likegrowtharestthroughmod ulationofthee2fpathwayinhumancoloncancercels[j].proc NatlAcadSciUSA,2007,104(39): Thecelproliferation,celcycleandapoptosisefectsof cycloartanetriterpenoidonhct116cels DAIXiao li 1,LIUJing 1,NIANYin 2,QIUMing hua 2,ZHANGJi hong 1 (1.LabofMolecularGeneticsofAgingandTumor,MedicineSchool,KunmingUniversityofScience andtechnology;2.statekeylabofphytochemistryandplantresourcesinwestchina,kunminginstitute ofbotany,chineseacademyofsciences,kunming ,China) Abstract:Aim Toinvestigatetheantitumorefectsof cimigenol(ky17),anovelcycloartanetriterpenoid from Cimicifuga, in human colon cancer cels (HCT116).Methods MTTasaywasusedtodeter minetheefectofky17ontheproliferationofmouse embryonicfibroblasts(mef)andhumancoloncancer HCT116celline.Flowcytometrywasemployedtode tecttheefectofky17onhct116celcycle.fluores cencemicroscopyandflowcytometrywereusedtoana lyzetheapoptosis.westernblotwasusedtodetectthe expresionofapoptoticprotein(parp).q PCRana lyzedtheexpresionofmirna 34a.Results The IC 50 ofky17inmefandhct116celswas27 28 μmol L -1 and9 31μmol L -1,respectively.KY17 inducedhct116celcyclearesting 2 /M phaseand the apoptotic protein PARP cleavage. In addition, KY17up regulatedtheexpresionofp53proteinand mirna 34a.ConclusionsKY17inhibitstheprolifera tionandthecelcycleisaresteding 2 /M,inducing theapoptosisofhct116 cels. The mechanism is probablyrelatedtomirna 34aup regulationandp53 activation. Key words:cimicifuga; Cycloartane triterpeneoid; colorectalcancer;proliferationinhibition;apoptosis; periodicblock;anti tumor