490 焦 静, 等. Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 Proto-oncogene proteins pim-3; Apoptosis; Apoptosis regulatory proteins [Tumor, 2011, 31(6): ] 舌鳞状

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1 肿瘤 2011 年 6 月第 31 卷第 6 期 Tumor Vol. 31, June DOI: /j.issn Basic Research 基础研究 Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 焦静 1, 刘红涛 2 3, 李沙 1. 郑州人民医院口腔科, 郑州 ;2. 郑州大学生物工程系, 郑州 ;3. 郑州大学第一附属医院口腔科, 郑州 [ 摘要 ] 目的 : 研究 Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响, 并探讨其凋亡的相关分子机制 方法 : 将 Pim-3 sirna 和对照 sirna 分别转染舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞, 另设未处理组 利用实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法分析转染前后 3 组细胞中 Pim-3 mrna 和蛋白的表达, 利用 CCK-8 试剂分析转染前后细胞增殖能力的变化, 并进一步采用 FCM 法检测 Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞凋亡的影响 最后, 利用蛋白质印迹法分析转染前后细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2 Bax Bad pbad 112 pbad 136 和 pbad 155 表达的变化 结果 : Pim-3 sirna 能有效下调舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 mrna 和蛋白的表达 Pim-3 表达的下调能明显抑制 Tca8113 细胞的增殖并诱导其凋亡 此外,Pim-3 表达下调能显著上调 Bax 蛋白的表达和下调 Bcl-2 和 pbad 112 的表达 (P < 5), 但不改变总的 Bad 蛋白和其他 Bad 磷酸化形式 (pbad 136 和 pbad 155 ) 蛋白的表达 结论 : Pim-3 表达下调诱导的细胞凋亡可能与 Bax 表达水平上升及 Bcl-2 和 pbad 112 表达水平下降密切相关, 因而 Pim-3 有望成为舌鳞状细胞癌治疗的分子靶点 [ 关键词 ] 舌肿瘤 ; 基因表达调控, 肿瘤 ;RNA 干扰 ; 原癌基因蛋白质 pim-3; 细胞凋亡 ; 凋亡调控蛋白类 [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2011) Effect of down-regulation of Pim-3 expression on apoptosis of tongue squamous-cell carcinoma and its molecular mechanism JIAO Jing 1, LIU Hong-tao 2, LI Sha 3 1. Department of Stomatology, Zhengzhou People s Hospital, Zhengzhou , China; 2. Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou , China; 3. Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou , China [ABSTRACT] Objective: To investigate the effect of down-regulation of Pim-3 expression mediated by RNA interference on apoptosis of tongue squamous-cell carcinoma, and to explore its molecular mechanism. Methods: Pim-3 sirna and single sirna were transfected into tongue squamous-cell carcinoma Tca8113 cells, respectively. The expressions of Pim-3 mrna and protein were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. The change of cell proliferation capability was analyzed using CCK-8 kit. The effect of down-regulation of Pim-3 expression on apoptosis of Tca8113 cells was examined by flow cytometry. Finally, the expression changes of apoptosis-related proteins such as Bcl-2, Bax, Bad, pbad 112, pbad 136 and pbad 155 were investigated by Western blotting. Results: Pim-3 sirna could effectively down-regulate the expressions of Pim-3 mrna and protein in Tca8113 cells. The down-regulation of Pim-3 expression obviously inhibited the cell proliferation and induced the apoptosis of Tca8113 cells. Furthermore, the down-regulation of Pim-3 expression could significantly elevate the expression of Bax protein and decrease the expressions of Bcl-2 and pbad 112 proteins (P<5), but the expression levels of total Bad protein and the phosphorylated types of Bad (pbad 136 and pbad 155 ) were not changed. Conclusion: The apoptosis induced by down-regulation of Pim-3 expression may be tightly associated with the increase of Bax expression and decrease of Bcl-2 and pbad 112 expressions. Pim-3 may become a molecular target in the therapy for tongue squamous-cell carcinoma. [KEY WORDS] Tongue neoplasms; Gene expression regulation, neoplastic; RNA interference; Correspondence to: LI Sha ( 李沙 ) lisha700602@126.com

2 490 焦 静, 等. Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 Proto-oncogene proteins pim-3; Apoptosis; Apoptosis regulatory proteins [Tumor, 2011, 31(6): ] 舌鳞状细胞癌是口腔癌中较为常见的恶性肿瘤之一, 其恶性程度高 生长快 浸润性强, 并常发生早期淋巴结转移 目前, 在临床上主要采用手术为主以及放疗和化疗为辅的综合治疗方法, 但术后转移率和复发率均较高, 综合治疗后 5 年生存率仅为 50% 左右 [1] 因此, 寻找新的分子靶点治疗舌鳞状细胞癌具有十分重要的意义 Pim 激酶家族最早是在研究莫罗尼鼠白血病病毒 (Moioneymurine leukemia virus,mmlv) 的前病毒插入点过程中被发现的, 它是一组与钙 / 钙调蛋白调节激酶相关的蛋白激酶家族 目前的研究发现,Pim 激酶家族在细胞增殖 细胞周期及细胞凋亡等多种不同的肿瘤生物学中发挥重要作用 [2] Pim-3 作为 Pim 家族的成员之一, 近几年来发现其与肿瘤的发生 发展密切相关 [3-5] 与 Pim 家族的另外 2 个成员一样,Pim-3 在肿瘤细 [6, 胞增殖 细胞周期及细胞凋亡中发挥重要作用 7] 然而, 迄今为止, 国内外尚未见 Pim-3 在舌鳞状细胞癌中的研究报道 因此, 本研究利用 RNA 干扰技术下调舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 mrna 和蛋白的表达, 观察 Pim-3 表达下调对 Tca8113 细胞增殖和细胞凋亡的影响, 并探讨其凋亡改变的分子机制, 旨在为以 Pim-3 为靶点的舌鳞状细胞癌的基因治疗提供理论依据 1 材料与方法 1.1 实验材料 Pim-3 sirna( 产品编号为 sc-61353) 和对照 sirna( 产品编号为 sc-37007) 以及兔抗人 Bcl-2 Bax Bad pbad 112 pbad 136 pbad 155 及 β-actin 抗体均购自美国 Santa Cruz 公司 ; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ;LipofectAMINE TM 2000 和 TRIzol 试剂购自美国 Invitrogen 公司 ; Annexin Ⅴ -FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自美国 BD Biosciences 公司 ;CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司 ;RPMI 1640 培养液 胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国 Gibco 公司 ; 实时荧光定量 PCR 试剂盒购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ; 蛋白裂解液购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 1.2 细胞培养及转染舌鳞状细胞癌细胞株 Tca8113 由郑州大学第一附属医院口腔科保存, 从液氮中取出后, 复苏在含有 10% 胎牛血清 100 U/mL 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养液中, 并置于 37 CO 2 体积分数为 5% 且相对饱和湿度的培养箱中培养 取处于对数生长期的细胞用于实验 细胞分为 3 组 : 未处理组 ( 不进行任何处理 ) 对照 sirna 组 ( 转染对照 sirna) 和 Pim-3 sirna 组 ( 转染 Pim-3 sirna) 当 Tca8113 细胞生长至大于 90% 融合时, 利用 LipofectAMINE TM 2000 用 Pim-3 sirna 和对照 sirna 分别转染 Tca8113 细胞, 转染后 48 h 进行后续实验 1.3 CCK-8 计数法检测细胞增殖分别收集未处理组和转染 及 96 h 的 Tca8113 细胞, 应用 CCK-8 试剂检测细胞增殖情况 在测定生长速率的时候, 加入含 10% CCK-8 的等量新鲜培养液于 37 培养 3 h 左右, 然后用酶标仪检测波长为 450 nm 处的吸光度 (D) 值 具体步骤按照试剂盒说明书进行 实验重复 3 次 1.4 FCM 检测细胞凋亡分别收获培养 48 h 的未处理组和转染组 Tca8113 细胞, 用预冷的 PBS 洗涤后, 按 个 /ml 的细胞密度重悬 然后取 100 μl 细胞置于流式管中, 加入 Annexin Ⅴ -FITC 和碘化丙啶各 5 μl, 避光孵育 15 min 后, 上流式细胞仪检测 个细胞的凋亡情况 具体步骤按照试剂盒说明书进行 最后采用 CellQuest 软件分析 3 组细胞凋亡的差异 实验重复 3 次 1.5 实时荧光定量 PCR 检测 Pim-3 mrna 的表达分别收获培养 48 h 的未处理组和转染组 Tca8113 细胞, 使用 TRIzol 试剂从 3 组细胞中提取总 RNA 设计 Pim-3 上游引物为 5 -CCCGG- TGAAGATCCTGCAGCCAG -3, 其下游引物为 5 -CCCACTCGGTCACCCGCTCCTTC-3, 产物大小为 176 bp; 内参 β-actin 的上游引物为 5 - CACTGTGCCCATCTACGAGGGGT- ATG-3, 下游引物为 5 -TCTCCTTAATGTCA- CGCACGATTTCCC-3, 产物大小为 161 bp 然后按 Quant 一步法 RT-PCR 试剂盒的操作说明书进行实验 首先配制如下反应液 :10 RT-PCR Buffer 2.5 µl dntp Mixture 1 µl 5 RT- PCR enhancer 5 µl RNasin 0.25 µl Hotmaster Taq 聚合酶 1.25 µl Quant RTase 0.25 µl 上下游特异性引物各 1.5 µl 和总 RNA 模板 10 ng ~

3 焦静, 等. Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 µg, 然后补水至 25 µl PCR 在 ABI 7300 仪器上进行 反应程序 : 反转录反应 min, PCR 初始变性 94 2 min, 然后 s s 65 延伸 30 s, 共 35 个循环 每个样品重复实验 3 次,Pim-3 mrna 的相对表达量采用 2 Ct 方法进行计算和分析 [8] 1.6 蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达分别收获培养 48 h 的未处理组和转染组 Tca8113 细胞, 用裂解法提取细胞总蛋白后, 进行蛋白质印迹法分析 具体操作程序如下 : 首先利用裂解液提取总蛋白, 然后进行 SDS-PAGE 分离目的蛋白 ; 电泳结束后, 取下凝胶电转移到硝酸纤维素膜上 ; 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 液封闭硝酸纤维素膜 2 h, 分别加入 Bcl-2 Bax Bad pbad 112 pbad 136 pbad 155 和 β-actin 一抗 ( 工作液稀释比例为 1 : 200),4 摇床孵育过夜 ; 加入相应二抗 ( 工作液稀释比例为 1 : 6 000), 室温孵育 1.5 h; 将硝酸纤维素膜置于增强化学发光试剂中反应 1 ~ 3 min, 暗室中经 X 线片曝光, 常规方法显影 定影, 显示出特异的蛋白信号 蛋白表达的灰度值采用 Gene Tools 软件进行分析 目的蛋白的相对表达量以目的蛋白条带灰度值与内参 β-actin 条带灰度值的比值予以表示 1.7 统计学方法应用 SPSS 13.0 统计学软件进行实验结果的统计学分析 结果数据用 ± s 表示, 两样本的均数比较采用 t 检验, 多个样本的均数比较应用单因素方差分析 以 P < 5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 Pim-3 sirna 转染舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞后 Pim-3 mrna 表达下调 Pim-3 sirna 转染舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞后, 用实时荧光定量 PCR 分析未处理组 对照 sirna 转染组及 Pim-3 sirna 转染组中 Pim-3 mrna 的表达情况 结果 ( 图 1A) 表明,Pim-3 sirna 组中 Pim-3 mrna 的表达水平显著下降 (P < 5), 大约是未处理组的 1/6; 然而, 未处理组和对照 sirna 组中 Pim-3 mrna 的表达量差异无统计学意义 (P > 5) 结果提示,Pim-3 sirna 转染能明显下调舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 mrna 的表达 2.2 Pim-3 sirna 转染后舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 蛋白表达下调分别收集转染后 48 h 的 3 组 Tca8113 细胞, 利用细胞裂解液提取总蛋白后, 采用蛋白质印迹法检测 3 组细胞中 Pim-3 蛋白的表达情况 结果 ( 图 2B ~ C) 表明, 与未处理组和对照 sirna 组相比,Pim-3 sirna 组中 Pim-3 蛋白的表达水平显著下降, 且差异具有统计学意义 (P < 5) 结果提示,Pim-3 sirna 转染能明显下调舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 蛋白的表达 A B C Relative Level of Pim-3 mrna Relative Level of Pim-3 protein Control sirna Pim-3 sirna Control sirna Pim-3 sirna Control sirna Pim-3 sirna Pim-3 β-actin F ig. 1 Expressions of Pim-3mRNA and protein in Tca8113 cells (tongue squamous cell carcinoma) transfected with Pim-3 sirna. Tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells were divided into three groups, including untreated group, control sirna group and Pim-3 sirna g roup. In the latter two g roups, control sirna and Pim-3 sirna were stably transfected into Tca8113 cells, respectively. After transfection for 48 h, the expression levels of Pim-3 mrnas in three groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and analyzed by 2 Ct method (A). At the same time, the expression levels of Pim-3 proteins were detected by Western blotting (B) and semi-quantificationally analyzed (C). β-actin was the internal control. P < 5, vs untreated group and control sirna group (n = 3). 图 1 Pim-3 sirna 转染后舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 mrna 和蛋白的表达情况 2.3 Pim-3 表达下调对 Tca8113 细胞增殖的影响分别收集未处理和转染后 和 96 h 的 3 组 Tca8113 细胞, 采用 CCK-8 试剂进行 3 组

4 492 焦 静, 等. Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 细胞的增殖分析 结果 ( 图 2A) 显示, 未处理组和对照 sirna 组之间相比, 细胞的增殖能力没有变化 (P > 5); 然而与未处理组和对照 sirna 组相比, 舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞在转染 Pim-3 sirna 后 24 h 以及其后各个时间点的细胞增殖均受到明显抑制 (P < 5) 2.4 Pim-3 表达下调对 Tca8113 细胞凋亡的影响分别收集未处理和转染后 和 96 h 的 3 组 Tca8113 细胞, 采用 FCM 进行细胞凋亡分析 结果 ( 图 2B 和表 1) 表明, 与未处理组和对照 sirna 组相比,Pim-3 sirna 组中细胞早期凋亡率显著升高 (P < 5), 而活细胞的比率显著降低 (P < 5); 然而, 未处理组和对照 sirna 组在早期细胞凋亡率和活细胞比率之间差异均无统计学意义 (P > 5) 表 1 转染 Pim-3 sirna 48 h 后 3 组 Tca8113 细胞的凋亡变化 Table 1 Changes of apoptosis of Tca8113 cells after transfection for 48 h in three groups (n = 3, ± s / %) Group n Early phase apoptosis rate Viable cell rate Untreatment ± ±3.23 Control sirna ± ±2.96 Pim-3 sirna ± ±2.37 P < 5, vs untreated group and control sirna group A D 450 nm Control sirna Pim-3 sirna FL2 B Control sirna Pim-3 sirna % 3.13% 0.59% 3.79% 4.43% 10.77% % 10.68% % 10.69% % 23.53% t/h FL1 Fig. 2 Effect of down-regulation of Pim-3 expression on cell proliferation of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells. Cell proliferation (A) and apotosis (B) of Tca8113 cells in the untreated group, control sirna group and Pim-3 sirna group after transfection for 48 h were detected by CCK-8 kit and flow cytometry, respectively. P < 5, vs untreated group and control sirna group (n = 3). 图 2 Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞增殖和凋亡的影响 2.5 Pim-3 表达下调对凋亡相关蛋白表达的影响为了进一步探讨 Pim-3 表达下调介导舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞凋亡的分子机制, 分别收集未处理和转染后 和 96 h 的 3 组 Tca8113 细胞, 并提取其总蛋白, 利用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白 Bcl-2 Bax Bad pbad 112 pbad 136 和 pbad 155 蛋白的表达情况 结 果 ( 图 3) 表明,Pim-3 sirna 组中 Bcl-2 及 pbad 112 的表达水平显著低于未处理组和对照 sirna 组 (P < 5); 相反, 转染 Pim-3 sirna 后 Bax 蛋白的表达显著上升 (P < 5); 而总的 Bad pbad 136 及 pbad 155 蛋白的表达水平在 3 组之间差异无统计学意义 (P > 5) A Bcl-2 Bax Bad pbad 112 pbad 136 pbad 155 β-actin B Relative level of protein Control sirna Pim-3 sirna Bcl-2 Bax Bad pbad 112 pbad 136 pbad 155 Fig. 3 Effect of down-regulation of Pim-3 expression on apoptosis-related protein expression in tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells. Protein expressions of Bcl-2, Bax, Bad, pbad 112, pbad 136 and pbad 155 in the untreated group (1), control sirna group (2) and Pim-3 sirna group (3) after transfection for 48 h were detected by Western blotting (A) and semiquantificational analysis (B). β-actin was the internal control. P < 5, vs untreated group and control sirna group (n = 3). 图 3 Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

5 焦静, 等. Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 讨论 Pim 属于丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族, 主要由 3 个成员组成, 包括 Pim-1 Pim-2 和 Pim-3 [9] 其中,Pim-3 作为 Pim 激酶家族的新成员, 与肿瘤的发生 发展关系十分密切 [7] 研究表明,Pim-3 选择性地在人和鼠肝癌中表达, 但是在正常肝组织中不表达 ; 进一步利用 RNA 干扰技术下调肝癌细胞中 Pim-3 的表达能明显抑制肝癌细胞增殖, 并促进其凋亡 [7] 另有研究发现, 胰腺癌患者的腺上皮组织中 Pim-3 表达的阳性率为 100%, 而正常人的胰腺小岛或非小岛中 Pim-3 不表达 [10] 以上研究结果提示,Pim-3 作为原癌基因在大多数肿瘤细胞中发挥作用 因此, 本研究利用 RNA 干扰技术将 Pim-3 sirna 转染舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞, 结果表明, 转染 Pim-3 sirna 后舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞中 Pim-3 mrna 和蛋白的表达均显著下调 (P < 5); 这一结果为进一步研究 Pim-3 在舌鳞状细胞癌中的功能提供了一定的理论基础 越来越多的研究显示,Pim-3 在肿瘤细胞增殖和细胞凋亡中发挥重要作用 研究表明, 利用转基因小鼠在肝中选择性过表达 Pim-3,80% 能发展成肝癌, 提示 Pim-3 的过表达能加速肝癌的发展 [3] 此外, 在胰腺癌中,Pim-3 能够通过磷酸化 Bad 来阻断 Bad 介导的细胞凋亡 [10] ; 而且 Pim-3 在结肠癌中也能阻止 Bad 介导的细胞凋亡 [6] 上述研究结果提示,Pim-3 在肿瘤发生 发展中的作用与其调控细胞增殖及细胞凋亡密切相关 本研究首先采用 CCK-8 试剂检测 Pim-3 表达下调对细胞增殖的影响, 结果表明与未处理组和对照 sirna 组相比, 转染 Pim-3 sirna 后 和 96 h 时舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞的增殖均受到明显抑制 进一步采用 FCM 检测转染 Pim-3 后 48 h 时舌鳞状细胞癌 Tca8113 细胞凋亡的变化, 结果表明, 转染 Pim-3 sirna 后其早期细胞凋亡率为 (21.38±2.15)%, 显著高于未处理组 [(9.17± 1.51)%] 和对照 sirna 组 [(9.31±1.38)%], 提示 Pim-3 表达下调能明显抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其发生凋亡 目前,Bcl-2 作为抑凋亡因子和 Bax 作为促凋亡因子是凋亡分子机制研究中的 2 个最为重要的靶蛋白 Bax 蛋白可与 Bcl-2 形成异二聚体, 对 Bcl-2 产生阻抑作用 研究发现,Bax 与 Bcl-2 蛋白含量之间的比例关系是决定细胞凋亡抑制作 [11, 用强弱的关键因素 12] 此外, 蛋白 Bad 的功能主要受自身 112 位点 136 位点或 155 位点 Ser 残基磷酸化的调控 Bad 磷酸化后, 其功能失活 未磷酸化的 Bad 可以通过 BH3 结构域结合到 Bcl-2 家族存活因子 Bcl-xL 和 Bcl-2 上, 并使之失活, 从而促进细胞凋亡 [13-15] 为了阐明 Pim-3 表达下调介导舌鳞状细胞癌细胞凋亡发生的分子机制, 本研究观察了 Pim-3 转染前后 Bcl-2 Bax Bad 蛋白以及不同磷酸化形式的 Bad 蛋白表达情况, 结果发现 Pim-3 表达下调能显著上调 Bax 蛋白的表达并下调 Bcl-2 和 pbad 112 的表达 (P < 5), 但不改变总的 Bad 蛋白和其他磷酸化形式 (pbad 136 和 pbad 155 )Bad 蛋白的表达 该研究结果提示,Pim-3 在舌鳞癌中主要针对 Bad 蛋白的丝氨酸 112 位点磷酸化 当下调 Pim-3 表达时, 由于 Bad 在 112 位点的丝氨酸磷酸化水平下降, 未磷酸化的 Bad 蛋白增多, 因而促使细胞发生凋亡 总之, 本研究结果表明,Pim-3 表达下调能明显抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导细胞凋亡, 其凋亡的发生可能与 Bax 蛋白表达上调以及 Bcl-2 和 pbad 112 表达下调密切相关 进一步研究 Pim-3 在舌鳞状细胞癌中的功能有望为舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据 [ 参考文献 ] [1] PRINCE S, BAILEY B M. Squamous carcinoma of the tongue: review[j]. Br J Oral Maxillofac Surg, 1999, 37(3): [2] BRAULT L, GASSER C, BRACHER F, et al. PIM serine/threonine kinases in the pathogenesis and therapy of hematologic malignancies and solid cancers[j]. Haematologica, 2010, 95(6): [3] W U Y, W A N G Y Y, N A K A M O T O Y, e t a l. A c c e l e r a t e d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a development in mice expressing the Pim-3 transgene selectively in the liver[j]. Oncogene, 2010, 29(15): [4] ZHENG H C, TSUNEYAMA K, TAKAHASHI H, et al. Aberrant Pim-3 expression is involved in gastric adenoma-adenocarcinoma sequence and cancer progression[j]. J Cancer Res Clin Oncol, 2008, 134(4): [5] LI Y Y, WU Y, TSUNEYAMA K, et al. Essential contribution of Ets-1 to constitutive Pim-3 expression in human pancreatic cancer cells[j]. Cancer Sci, 2009, 100(3):

6 494 焦 静, 等. Pim-3 表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究 [6] POPIVANOVA B K, LI YY, ZHENG H, et al. Protooncogene, Pim-3 with serine/threonine kinase activity, is aberrantly expressed in human colon cancer cells and can prevent Bad-mediated apoptosis[j]. Cancer Sci, 2007, 98(3): [7] FUJII C, NAKAMOTO Y, LU P, et al. Aberrant expression of serine/threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines[j]. Int J Cancer, 2005, 114(2): [8] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 C(T) Method[J]. Methods, 2001, 25(4): [9] AMARAVADI R, THOMPSON C B. The survival kinases Akt and Pim as potential pharmacological targets[j]. J Clin Invest, 2005, 115(10): [10] LI Y Y, POPIVANOVA B K, NAGAI Y, et al. Pim-3, a proto-oncogene with serine/threonine kinase activity, is aberrantly expressed in human pancreatic cancer and phosphorylates bad to block bad-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cell lines[j]. Cancer Res, 2006, 66(13): [11] RAISOVA M, HOSSINI A M, EBERLE J, et al. The Bax/Bcl-2 ratio determines the susceptibility of human melanoma cells to CD95/Fas-mediated apoptosis[j]. J Invest Dermatol, 2001, 117(2): [12] GROSS A, MCDONNELL J M, KORSMEYER S J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis[j]. Genes Dev, 1999, 13(15): [13] Y A N G E, Z H A J, J O C K E L J, e t a l. B a d, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death[j]. Cell, 1995, 80(2): [14] CHEN L, WILLIS S N, WEI A, et al. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function[j]. Mol Cell, 2005, 17(3): [15] KELEKAR A, CHANG B S, HARLAN J E, et al. Bad is a BH3 domain-containing protein that forms an inactivating dimer with Bcl-XL[J]. Mol Cell Biol, 1997, 17(12): [ 收稿日期 ] [ 本文编辑 ] 张俊彦

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