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1 复旦学报 医学版 共培养体系中高红色荧光蛋白, 标记结肠癌细胞的检测技术 陈孙霞 王晓庆 徐晓恩 姜英华 刘 锋 复旦大学生物医学研究院 上海 复旦大学化学系 上海 摘要 目的 提高 '$!! 红色荧光蛋白!!"! 在结肠癌细胞中的表达 从而可以通过检测共培养体系中细胞的荧光值来分析结肠癌细胞的增殖 以利于结肠癌肿瘤微环境的研究 方法 用 * 细胞制备 (&'$!! 病毒液 利用多次感染 次 的方法提高 在结肠癌细胞系 -*. 8 + 及 -* 中的表达 经流式细胞仪检测得到不同感染次数细胞 标记的阳性率 并将高阳性表达 的结肠癌细胞 -* 的荧光值与细胞数量关系进行比较 分析评价两者的线性关系 结果 通过优化 荧光标记效率大幅度提高 结肠癌肿瘤成纤维细胞共培养中 荧光值与细胞数量线性关系 该方法成功用于检测共培养体系中单种细胞增殖 结论 在结肠癌细胞和成纤维细胞的共培养体系中 结肠癌细胞的增殖可以通过检测细胞荧光值来分析 关键词 红色荧光蛋白 共培养 细胞增殖 结肠癌 中图分类号 文献标志码 )0""& *" "#'$&#$"$"'#!#, '''##'#'&% -%(& +)( 4&# 4 4& 1)( #&$.1 # )$%!#$%&' #$%&' * '!$!"" $'$!!!!"!!!" $$!!!"$&!""'," '!, '"!#$!""#"$$"",!!! '!!'"""*"!"!$(&'$!!!" $$"" $!" -* **$,#!!"!!'" '!$,# $*$"," $!,#!, '!*$!" -* $$#$, " '! $"$!!"$,,$ ""')! '2$!",# "#! '!)!!! "$,$!" 国家重点基础研究发展计划 计划!!"#$!%&'

2 陈孙霞 等 共培养体系中高红色荧光蛋白 标记结肠癌细胞的检测技术 $ $ 2#$!!!"$&! ""' #'#1&!""'!",!,""$!!!",'"!,#$!!""#" (&)!!"!&!!!!! *")+)!!& ""##'(&$%#"10/..1.0./1...2 肿瘤的生长不仅与恶性肿瘤细胞有关 也与肿瘤微环境中的基质细胞相关 在实体肿瘤组织中 除了肿瘤细胞本身外 肿瘤微环境中还包含成纤维细胞 巨噬细胞 上皮细胞 炎性细胞 内皮细胞 神 经细胞及胞外基质等 而成纤维细胞是肿瘤微环境中最主要的基质细胞 血小板衍生生长因子受体 &!#! $!!!$ 3 及波形蛋白 '81 是成纤维 细胞的标志物 而平滑肌肌动蛋白 $& "' $'"&) 则是成纤维细胞活化 的标志 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一 近 年来在引起死亡的肿瘤中位居第三 对结肠癌微环境的研究逐渐成为热点 将基质细胞与肿瘤细胞共培养 是研究肿瘤微 环境对肿瘤发生发展影响的重要手段 近年来 细胞共培养技术日趋多样化 体外共培养技术包括接触或者非接触 接触培养包括二维 '3 培养或者模拟肿瘤体内微环境的三维 $!'3 培养技术 其中 3 培养技术是将一种细胞接种在另一种细胞之上或者将两种细胞混合后接种 这种培养方法可以检测细胞的增殖 细胞的形态学变化以及细胞迁移等 该类方法操作简单 对于研究早期的肿瘤细胞与肿瘤微环境基质细胞相互作用具有很大意义 例如. 等将骨髓基质细胞与脐静脉内皮细胞进行 3 共培养 发现 &) 和 促进自组装网络的形 成 与内皮细胞的迁移有关 4 等用微流控芯片 3 共培养技术对肺癌细胞药物敏感性进行了研究 肿瘤细胞的增殖是检测肿瘤微环境的重要指标 之一 在本研究中 我们优化了成纤维细胞与结肠癌细胞共培养体系中细胞增殖情况的检测方法 我们选择性地用红色荧光蛋白!!"! 标记结肠癌细胞 以利用荧光吸收 值检测细胞增殖情况 利用多次标记技术大幅度提高荧光标记效率 同时采用整体荧光检测的方法来检测细胞增殖 优化后的方法缩短了检测时间 提高了检测通量 使检测更加简易可行 减少了原代成纤维细胞的消耗及研究成本 这种方法的应用也使得早期的肿瘤体外研究体系更简单 材料和方法 主要实验仪器 多功能酶标仪!#- 美国伯腾仪器有限公司 流式细胞仪 美国贝克曼库尔特有限公司 荧光倒置显微镜 3 日本奥林巴斯有限公司 材料和试剂 结肠癌细胞系 * 中科院上海生命科学研究院细胞库 -* 细胞系 复旦大学上海市公共卫生临床中心张丽军博士惠赠 感受态 3- 北京天根生化科技有限公司 )"" 普通 孔板 和 +! ' "!!"!# 以下简称 孔黑板 其他试剂包括 转染试剂.' 美国 1!# 公司 6& % 和 :") ' 美国, 公司 13%3% 无酚红 3%-#$#" 和,"!' 美国 - 公司 中抽试剂盒 ( 4! 德国 )-%&()%. 公司 :& '&&$3)1 上海碧云天生物技术有限公司 )!&&, 兔抗 1# 美国 1!# 公司 细胞培养. 8 细胞用 15 培养 + 用 3%5 培养 -*-* 细胞用 :") 培养基 美国, 公司 5 培养 所有的培养基中加入 5 青霉素 链霉素 美国 - 公司 细胞放置在 95 6 的培养箱中培养 质粒!%"& 及!5. 的扩增 (&'$!! 质粒及逆转录辅助质粒.) 由本实验室保存 取 #(&'$!! 及 和

3 复旦学报 医学版 年 月.) 质粒 3() 分别加入到. 的感受态 3- 中 混匀后置于冰上 ' 9 热激后加入. 培养基 于 9 摇床内孵育 待细菌增殖至菌液 为 时 按照 ( 4! 说明书提取质粒 质粒 3() 质量 为!%"& 病毒液制作及感染 将生长良好的 * 细胞 传代到 ' 培养皿中 转染前 $ 换成无双抗的培养基 将 (& '$!! 和.) 两种质粒各 # 混合到. 6*1&% 中 将..' 加到.6*1&% 中 然后将两种溶液混合均匀后静置 ' 加入到 * 细胞中 $ 后 收取病毒上清 # 离心 ' 后用 ' 滤膜过滤 将病毒上清滴加到 -* +. 8 和 -* 细胞中 为提高标记效率 我们采取多次感染的方法 每 $ 更换感染病毒液 重复感染 次 并用 6'"14 荧光显微镜观察及流式细胞仪检查 评估标记效率 4#' 检测 待指数生长期的细胞生长至 5 融合度时 弃去培养基 预冷 洗涤 次 加入 3 裂解液 提取蛋白 根据 ) 法定量蛋白浓度 配置 5 分离胶及 5 浓缩胶后对蛋白进行上样 接着进行电泳及转膜 最后进行抗体免疫反应 化学发光 (- 法检测细胞增殖 将 个生长良好的细胞接种于 孔培养皿中 在 95 6 孵箱中孵育 每天取出 个 孔板加 5 7& 溶液 9 继续孵育 $ 后 在 ' 处测定吸光度 值 根据 值绘制细胞生长曲线 隔天检测 天 原代成纤维细胞的分离 消化和培养 经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准 收集复旦大学附属中山医院结肠癌手术切除的新鲜癌旁组织 与肿瘤组织间隔 ' 和肿瘤组织于无菌 3&$" 溶液中保存 在超净工作台中 将新鲜组织用 5 乙醇漂洗两次 在无菌 3&$" 液中漂洗 次 用镊子仔细去除坏死组织和血块 用眼科手术剪将组织尽可能剪成小块 视组织大小加 倍体积胶原酶溶液 '.#' 9 水浴消化 待消化溶液变黏稠 加胰酶于 9 继续消化 ' 将细胞悬液过 ' 的细胞筛网 3 后收集 # 离心 ' 沉淀用 3% 培养基洗涤 遍 用含 5 胎牛血清的 3% 培养基 于 95 6 的培养箱中培养 $ 后换液 待细胞密度 55 时传代 细胞免疫荧光 将生长状态的成纤细胞种植在 孔板内的细胞免疫荧光爬片上 置于 95 6 的培养箱中培养 $ 后去除细胞培养基 用 洗 次后先对细胞进行固定 洗 次后再用通透液孵育 ' 洗去通透液 用 5 ) 对细胞进行封闭 一抗 9 孵育过夜 二抗室温孵育 $ 细胞核染色用 :&'&& $3)1 染色 ' 最后用荧光倒置显微镜对细胞进行荧光拍照 成纤维细胞与结肠癌细胞共培养 本实验采取细胞混合培养方法 检测结肠癌相关成纤维细胞与结肠癌细胞的共培养对肿瘤细胞增殖的影响 将单层培养的成纤维细胞和荧光标记后的结肠癌细胞分别消化 按比例直接混合后接种于细胞培养皿中 孔黑板 单独培养的荧光标记肿瘤细胞作为对照 共培养荧光细胞的计数检测 将转染 次病毒液的细胞按相同的体积及条件消化后 加入 '. 取 '. 过细胞筛网后 用流式细胞仪检测其阳性标记率 对照为未标记细胞 共培养细胞荧光信号的整体检测 将不同数量的细胞种植在普通 孔板或 孔黑板中 用多功能酶标仪!#- 检测不同细胞数对应的荧光值 在共培养体系中 将成纤维细胞与肿瘤细胞混合培养于 孔黑板中 分别检测荧光值 检测时根据文献报道及实验调整 激发光为 ' 发射光为 ' 狭长设置为 ' 温度为 9 扫描采用 )!" 法或者 *! 法 统计学方法 对照组成纤维细胞的生长与实验组成纤维与肿瘤细胞共培养后的细胞生长差异采用 软件进行统计学分析 组间比较采用 检验 差异显著性检验水平设为双尾 为差异有统计学意义 结 果!%"& 病毒液感染标记结肠癌细胞用 (&'$!! 病毒液 分别感染结肠癌细胞系 -*+. 8 及 -* 以进行荧光蛋白标记 在 (&'$!! 首次标记后 荧光信号比较低 显微镜视野中大多数为未标记的细胞 图 ) 如果进行再次标记 标记效率有所提高

4 陈孙霞 等 共培养体系中高红色荧光蛋白 标记结肠癌细胞的检测技术 图 而在感染第 次时 结肠癌细胞的标记效率大幅提高 显微镜视野下几乎大部分的细胞均为 标记细胞 图 这些结果提示 多次标记可以提高 (&'$!! 病毒液的感染效率 图. 重复感染!%"& 病毒提高结肠癌细胞的标记效率 :,$.!##)"!%"&#''#$#&'##''#: 荧光标记效率的检测 我们用流式细胞仪检测不同标记次数的结肠癌细胞阳性标记率 同时检测标记效率是否能够随着感染次数增多而持续增高 检测结果表明 随着 (&'$!! 病毒液感染次数增加 细胞的 标记率明显提高 在 -* 和 -* 细胞中甚至接近 5 图 图 下为细胞用 (&'$!! 病毒液感染 次后的阳性标记率 我们发现第 次感染对于进一步提高细胞的标记效率几乎没有效果 这些结果表明 (& '$!! 病毒液感染以上 种结肠癌细胞 经过 次标记即可达到较高的 标记率 我们对高标记的细胞多次传代 间隔 个月后对高标记率的 -* 细胞进行检测 结果显示细胞的阳性标记率几乎没有改变 图 生长曲线分析表明多次标记对细胞生长没有显著影响 图 细胞形态没有发生明显变化 图 3 荧光信号与细胞增殖的关系 检测共培养体系中的单种细胞通常使用流式细胞仪 但耗时长 对细胞需求量大 对细胞标记率要求高 在本研究中 为监测共培养体系中结肠癌细胞的增殖状态 我们检测共培养体系中的整体荧光值 对不同给定数量的荧光细胞的荧光值做标准曲线 我们采用两种 孔板进行细胞培养和检测 结果表明普通 孔板荧光值与细胞数量之间未呈现对应关系 而 孔黑板的荧光检测值与细胞数量呈线 性关系 结果较稳定 图 ) 对于酶标仪的读取方法 选用面积扫描 图 读取的荧光值与细胞量的线性关系优于点读取 图 3 图 中 对于低标记的细胞 '-* 代表 -* 细胞经过一次标记 其细胞的荧光数值增长十分缓慢 不能客观地代表细胞增殖曲线 而高标记的细胞 '-* 代表 -* 细胞经过 次标记 中 细胞的增殖数值偏向正常值 图 采用上述综合方法 可以得到荧光值与细胞的线性关系为 并且将 '-* 与结肠癌正常成纤维细胞混合共培养后 其线性关系也可达到 图 3% 以上结果显示 在共培养体系中 可以用细胞整体荧光值检测单种细胞的增殖量 原代结肠癌成纤维细胞的鉴定 我们从新鲜结肠癌组织及癌旁组织中分离出一对成纤维细胞 正常结肠成纤维细胞!',!,""(" 来自于癌旁正常组织 结肠癌肿瘤相关成纤维细胞!"",!,"")" 来自于结肠癌肿瘤组织 免疫荧光实验显示 (" 及 )" 的 &) 及 8'81 染色结果为完全阳性 图 ) 而上皮细胞标志物 %&$! 免疫荧光显示为完全阴性 数据未展示 +"!, 实验检测成纤维细胞标志物 &)8' 及 3 在成纤维细胞均有表达 图

5 复旦学报 医学版 年 月 图 红色荧光蛋白阳性率及高标记荧光细胞的生物学特征,$#,''#$&')&%# "'$'""$"''#$' )!#.,#!, '!*$.,#! '-*,)$""#, '"!! -*'-*3!$# -*'-*'#, 结肠癌成纤维细胞对 *1 细胞增殖的影响将成纤维细胞与结肠癌细胞 混合后共培养 第 天的检测结果表明 正常成纤维细胞 ( 及肿瘤成纤维细胞 *) 显著抑制共培养中结肠癌细胞 -* 的增殖 图 在 的比例混合共培养 中 正常成纤维细胞 ( 对 -* 细胞的增殖起到了显著的抑制作用 所以我们可以初步判断体外共培养体系中 正常结肠癌成纤维细胞对 -* 细胞的增殖起到了抑制作用 而肿瘤相关成纤维细胞对 -* 的作用则有待于我们进一步研究

6 陈孙霞 等 共培养体系中高红色荧光蛋白 标记结肠癌细胞的检测技术 图 / 荧光值与细胞数量的关系,$/*"'#"!)#'# #'#' 图 原代结肠癌成纤维细胞标志物的检测,$*"7!#%%#'!#%+# "!%&' )*$''!" 81&)$","$!'!,!,"!"3 ",!,"'!!!""# +"!,)3- """#!

7 复旦学报 医学版 年 月 图 9 结肠癌成纤维细胞对 *1 细胞增殖的影响,$9*"#'#'#'#*1' 讨 论 肿瘤的发生发展与肿瘤微环境之间的相互作用及影响 近年来逐渐成为人们研究的热点 由于肿瘤微环境的复杂性 肿瘤微环境一直是研究的难点和热点 过去的十多年中已经认同了肿瘤微环境对肿瘤发生及发展有着显著的影响 肿瘤与微环境之间的!"" 很大程度上影响着肿瘤细胞的增殖 侵袭 及转移能力 肿瘤细胞的增殖是检测肿瘤微环 境的重要指标之一 我们将肿瘤细胞进行荧光蛋白标记 通过检测共培养中的荧光信号 分析肿瘤细胞的增殖情况 提高检测效率的关键是提高标记效率 本实验利用多次感染的方法来提高 (& '$! 对结肠癌细胞的标记效率 且这种标记效率能保持至少一个月以上的稳定期 该检测结果与已有 文献报道一致 且在生物学特性上没有明显改变 我们发现 经过 次感染 标记效率达到最高值 -* 及 -* 细胞的标记率均从首次标记的 5 和 5 分别提高到 5 和 5+ 及. 8 细胞则达到 55 高效标记省去流式细胞仪筛选富集的步骤 提高了荧光检测效率 共培养方法包括传统的 3 培养方法及近几年 的热点 3 培养 但是由于 3 培养技术复杂并且价钱相对昂贵 对于肿瘤微环境共培养体系的初步研究中我们仍然选择 3 法进行研究 3 共培养包括非接触及接触式培养 前者利用 *!" 平板共培养 一般采用锥虫蓝计数法检测细胞增 殖 后者检测细胞增殖一般采用流式细胞仪法 统计细胞数量 但其价格高 操作繁琐 不便于通量检测 本实验采用高标记的细胞监测共培养体系中单种细胞的增殖 首先 需要对细胞的荧光值与 细胞数量的线性关系进行研究 我们利用!#- 对 -* 不同的细胞量 进行了荧光值检测 高标记的荧光值不仅与细胞数量呈线性关系 数值的绝对值也与真实的细胞数量增速接近 而低荧光标记的细胞两项表现都较差 所以 细胞的荧光标记率达到一定的值 荧光值可以很好地代表细胞的增殖速度 荧光标记率越高越好 其次 我们需要验证共培养体系中这种荧光值代表单种细胞增殖的关系是否仍然存在 因此我们选择了正常的结肠癌细胞与 '-* 细胞进行直接接触的混合培养 结果显示 在 ' 的读数与共培养中细胞的数量呈线性关系 提示该方法可以用于早期 3 共培养体系中单种细胞增殖的检测 简便了共培养体系的检测方法 高荧光标记的细胞不仅可应用于共培养体系细胞增殖检测 也可用于该体系中的细胞形态观 察 例如在 3 培养体系中可以实时监测标记 细胞的形态变化 还可用于小鼠体内实验的研 究等 最后 我们运用该方法将 '-* 与一对结肠癌成纤维细胞 (*) 进行了共培养 并用上述方法检测共培养体系与单培养体系中 -* 细胞的增殖量 通过实验 我们看到在 -* 与 ( 或 时 正常成纤维细胞显著抑制肿瘤细胞的生长 而在与 *) 的共培养中由于

8 陈孙霞 等 共培养体系中高红色荧光蛋白 标记结肠癌细胞的检测技术 成纤维细胞与 -* 的比例不同 则出现了不同的 结果 该结果与 等的报道一致 关于这项研究还有待深入探讨 综上所述 高 标记的细胞可以应用于接触式的 3 共培养体系中单种细胞增殖情况的检测 这一方法的应用 简化了对早期共培养体系中肿瘤细胞与肿瘤微环境的基质细胞相互作用的研究 也为我们后续的研究提供了基础及方向 参 考 文 献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收稿日期 编辑 王蔚

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