中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2) 195 细胞接种于培养板中, 待细胞进入对数生长期进行实验实验分为无血清的阳性对照组紫草素 (1 2.5 和 5μmol L -1 ) 处理组紫草素粉末用细胞用 DMSO 配制成溶液并过滤除

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龈齐
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1 194 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2):194~8 网络出版时间 : :40 网络出版地址 :htp:// 紫草素通过 PI3K/Akt 通路促进人乳腺癌 MCF 7 细胞自噬陈菊英, 刘朝纯, 曾智, 黄文东, 杨永飞, 朱邦豪 ( 中山大学中山医学院药理学教研室, 广东广州 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) 中国图书分类号 :R284.1;R329.25;R 摘要 : 目的研究紫草素 (Shikonin) 对人乳腺癌 MCF 7 细胞自噬的影响及其作用机制方法 CCK 8 法检测紫草素处理人乳腺癌 MCF 7 细胞 24 48h 细胞的存活率,Westernblot 方法检测紫草素处理 24h 和 48h 时 LC3 p62 PI3K Akt p PI3K p Akt 蛋白水平结果 1μmol L -1 紫草素处理细胞 48h 以及 2 5 5μmol L -1 紫草素处理 MCF 7 细胞 24h 和 48h 时,MCF 7 细胞的活力受到明显抑制,LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ 值增加,p62 表达减少, 总 PI3K Akt p PI3K p Akt 均减少结论紫草素促进乳腺癌 MCF 7 细胞自噬, 其作用机制可能与 PI3K/Akt 通路受到抑制有关关键词 : 紫草素 ;MCF 7 细胞 ; 自噬 ;LC3;p62;PI3K;Akt;p PI3K;p Akt 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一, 流行病学调查数据显示近年来乳腺癌呈逐年增长的趋势, 相比西方国家中国属低发区, 但近年来增长趋势明显, 严重威胁到女性的健康与生命自噬 (autoph agy) 是真核细胞内的蛋白质及细胞器的一种自我消化降解的过程研究发现自噬与人类肿瘤神经退行性变心肌肥厚等多种疾病有着密切的关系 [1] 近年来研究表明, 自噬还能导致细胞死亡, 它是不同于凋亡和坏死的另外一种新的细胞程序性死亡方式, 被称为自噬样细胞死亡, 为了与凋亡区别, 被命名为 TypeⅡ 细胞死亡 [1-3] LC3 p62 是自噬的两个标志性蛋白, 自噬发生时,LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ 值会增加, 而 p62 减少 [4] 影响细胞自噬的信号通路尚未完全明确, 研究认为,PI3K/Akt 通路是影响细胞自噬重要的信号通路 [5], 也是治疗乳腺癌的一个重要靶点 [6] 为了寻找更好的治疗肿瘤的药物, 近年来研究收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 粤港关键领域重点突破项目 (No2007A ) 作者简介 : 陈菊英 (1988-), 女, 硕士, 研究方向 : 糖尿病合并症产生机制及防治药物的研发,E mail:chenjuying0203@163. com; 朱邦豪 (1963-), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向 : 糖尿病合并症产生机制及防治药物的研发, 通讯作者,E mail:zhubh@mail.sysu.edu.cn 者从中草药发现并提取出有效成分, 其中紫草素 (Shikonin) 是存在于紫草植物根中的一种萘醌化合 [7-9] 物, 研究表明紫草素可以抑制乳腺癌肝癌人宫颈癌等多种肿瘤细胞的增殖, 诱导肿瘤细胞死亡, 死亡机制包括凋亡和坏死, 但对肿瘤细胞的自噬影响尚未报道本实验对紫草素对人乳腺癌 MCF 7 细胞自噬的影响及其作用机制进行了探讨 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器药品和试剂乳腺癌细胞 MCF 7 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库左旋紫草素 (Fig1)( 广州市药检所 );DMEM 高糖培养基粉末胎牛血清 (FBS)(Gibco 公司 ); 青链酶素双抗二甲基亚砜 (DMSO) 胰蛋白酶 (Sigma 公司 );LC3A/B 抗体 SQSTM1/p62 抗体 PI3K p85 p PI3K p85 Akt p Akt Maker 抗 Maker;(CelSignalingTechnol ogy) 小鼠抗 β actin 抗体山羊抗小鼠抗体 ( 博士德公司 );BCA 蛋白定量试剂 ECL 发光剂一抗稀释液 Western 及 IP 细胞裂解液 ( 碧云天生物科技有限公司 ); 蛋白酶抑制剂 (Merck 公司 ); 脱脂奶粉 (Sig ma);cck 8(CelCountingAsayKit 8)( 广州奕源生物科技有限公司 ) Fig1 ChemicalstructureofShikonin 主要仪器 CO 2 培养箱 ( 美国 Precision 公司 ); 倒置显微镜 ( 重庆光学仪器厂 ); 冷冻超速离心机 ( 美国 Beckman 公司 ); 酶标仪 ( 美国 Bio tek 公司 );Westernblot 及转膜设备 (BioRad 公司 ); 显影机 ( 日本柯达公司 ) 1.2 方法细胞培养分组及药物的配制 MCF 7 细胞培养于含 10%FBS 0 01g L -1 牛胰岛素 1% 青链酶素双抗的 DMEM 高糖培养基中,37 5% CO 2 细胞培养箱内培养,2d 传代 1 次实验时将 MCF 7

2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2) 195 细胞接种于培养板中, 待细胞进入对数生长期进行实验实验分为无血清的阳性对照组紫草素 (1 2.5 和 5μmol L -1 ) 处理组紫草素粉末用细胞用 DMSO 配制成溶液并过滤除菌,-20 避光保存 CCK 8 法检测细胞活力用胰酶消化细胞并用含血清及胰岛素的培养基将细胞制成的单个细胞悬液并计数调整细胞浓度为 10 9 个 L -1, 接种于 96 孔板中, 每孔 100μl 贴壁 24h 后, 换成无血清含 0 01g L -1 的牛胰岛素培养基, 并加药按如下分组 : 无血清阳性对照组 : 更换无血清含胰岛素的培养基 ; 给药组 : 分别给予含和 5μmol L -1 的紫草素 (DMSO 浓度不超过 1 0mmol L -1 ) 的无血清含胰岛素的培养基处理 24h 或 48h 后每孔加入 10μl 的 CCK 8 溶液,2h 后于酶标仪 450nm 处读数细胞活力百分数 =100% -( 对照组 OD 值 - 实验组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100% Westernblot 法检测细胞 LC3 p62 PI3K p PI3K Akt p Akt 蛋白表达细胞用胰酶消化并用含血清及胰岛素的培养基制成单细胞悬液后个细胞 / 皿接种于中皿中, 培养 24h 后, 更换为无血清含胰岛素的培养基并给药 24 48h 后, 用 4 PBS 冲洗细胞 3 次, 预先将蛋白酶抑制剂 cocktail 按加入细胞裂解液 RIPA 中混匀加入适量 RIPA 冰上裂解 30min, 将裂解产物刮下收集于 EP 管,12 000r min -1 4 离心 15min, 吸取上清液,BCA 法蛋白定量后,50~100μg 蛋白经 12% SDS PAGE 胶分离后转移到 PVDF 膜上, 含 5% 牛奶的 TBST 溶液封闭 1h 分别孵育 LC3 p62 PI3K p PI3K Akt p Akt 抗体 4 过夜或常温 2h TBST 洗膜 5min 3 次, 孵育二抗室温 1 5h TBST 洗膜 10min 3 次, ECL 发光底物曝光显影 ImageJ1 39U 分析目的条带的光密度值以 β actin 作为内参, 实验重复 5 次统计学分析数据以 x±s 珋表示, 采用 t 检验法, 应用 SPSS16 0 统计分析软件进行统计分析 2 结果 2.1 紫草素对 MCF 7 细胞活力的影响不同浓度 (1 2 5 和 5μmol L -1 ) 紫草素分别作用 MCF 7 细胞 24 和 48h 时发现, 紫草素对 MCF 7 细胞活力的损伤呈浓度依赖性 (Fig2) 24h 时,1μmol L -1 紫草素对乳腺癌细胞无明显抑制作用, 而紫草素浓度增高为 2 5 和 5μmol L -1 时细胞存活率明显下降 48h 时,1 2 5 和 5μmol L -1 紫草素对 MCF 7 细胞活力均有明显的抑制作用, 且随着浓度的增加细胞存活率下降 2.2 Westernblot 结果紫草素上调 LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ 值, 下调 p62 蛋白水平通过 Westernblot 方法检测 LC3 和 p62 蛋白表达水平, 不同浓度紫草素作用细胞 24h 时, 与无血清阳性对照组相比,2 5 和 5μmol L -1 处理组 LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ 值升高,p62 蛋白表达明显降低 (Fig 3A) 和 5μmol L -1 紫草素作用 MCF 7 细胞 48h, 与对照组比较 LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ 值均升高, p62 降低 (Fig3B) 紫草素下调 PI3K Akt 蛋白的表达不同浓度紫草素处理 MCF 7 细胞结果显示,1μmol L -1 紫草素作用 24h 时 (Fig4A), 对 PI3K Akt 的表达无明显影响 ; 而 48h 时 (Fig4B), 与无血清阳性对照组相比 PI3K Akt 蛋白表达均下降浓度为 2 5 和 5μmol L -1 紫草素作用细胞 24h 和 48h,PI3K 及 Akt 蛋白表达均下调, 且呈浓度的依赖性紫草素降低 PI3K Akt 蛋白的磷酸化水平 Westernblot 方法检测 p PI3K p Akt 蛋白表达结果显示, 紫草素对 p PI3K p Akt 表达的影响呈浓度依 Fig2 EfectofShikoninonMCF 7celviabilityaftertreatedwithshikoninfor24h(A)and48h(B)( 珋 x±s,n=6) P<0 05, P<0 01vscontrol

１９６中国药理学通报ＣｈＰｈｍｇＢｕ２０１３Ｆｂ２９２Ｆｇ３ＥＭＣＦ７ｈｘＬＣ３ＬＣ３ｄ６２ｄｗｈ

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参与细胞器降解与再利用过程细胞正常情况下很少发生自噬当细胞在饥饿生长因子缺乏缺氧细胞内应激或生长发育信号的刺激下自噬大ＱＳＴＭ１６２蛋

3 １９６中国药理学通报ＣｈＰｈｍｇＢｕ２０１３Ｆｂ２９２Ｆｇ３ＥＭＣＦ７ｈｘＬＣ３ＬＣ３ｄ６２ｄｗｈｈｋ２４ｈＡｄ４８ｈＢ珋ｘ± ５ Ⅱ Ⅰ Ｐ００５Ｐ００１ｖ珋± Ｆｇ４ＥＭＣＦ７ｈｘＰＩ３Ｋｄａｋｄｗｈｈｋ２４ｈＡｄ４８ｈＢｘ５Ｐ００５Ｐ００１ｖ赖性２４ｈ时Ｆｇ５ａ１μｍＬ１紫草素处理组ＰＩ３ＫＡｋ与无血清阳性对照组无差异２５和１５μｍＬ紫草素处理组ＰＩ３ＫＡｋ均低于无ｇ５ｂ１２５和５血清阳性对照组而４８ｈ时Ｆ１ｍＬ组与对照组相比ＰＩ３ＫＡｋ均下降 μ ３讨论乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一是导致女性病人死亡的主要的肿瘤近年来自噬被认为是预防和治疗肿瘤的重要靶点１０１１自噬ｕｈｇｙ是生物细胞存在的一种高度保守的自身生物大分子参与细胞器降解与再利用过程细胞正常情况下很少发生自噬当细胞在饥饿生长因子缺乏缺氧细胞内应激或生长发育信号的刺激下自噬大ＱＳＴＭ１６２蛋白是两个标志性蛋大增加ＬＣ３Ｓ白自噬发生时ＬＣ３由胞质型即ＬＣ３ Ⅰ 转位到自噬体膜ＬＣ３６２则会降 Ⅱ 增加而泛素蛋白

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2) 197 Fig5 EfectofMCF 7celsontheexpresionofp PI3K andp Aktaftertreatedwithshikoninfor24h(A)and48h(B)( 珋 x±s,n=5) P<0 05, P<0 01vscontrol 解 [12]

肝癌直肠癌口腔癌膀胱癌皮肤癌等多种肿瘤细胞均有抑制作用本实验观察了不同浓度的紫草素对人乳腺癌 MCF 7 细胞活力的损伤及其自噬的影响, 结果显示紫草素能降低 MCF 7 细胞活力, 上调 LC3 Ⅱ / LC3 Ⅰ 值, 下调 SQSTM1/p62 水平从而促进 MCF 7 细胞的自噬, 与此同时 PI3K Akt 的表达及其磷酸化水平 (p PI3K,p Akt) 也减少因此,

4 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2) 197 Fig5 EfectofMCF 7celsontheexpresionofp PI3K andp Aktaftertreatedwithshikoninfor24h(A)and48h(B)( 珋 x±s,n=5) P<0 05, P<0 01vscontrol 解 [12] 以雷帕霉素蛋白 (mtor) 为靶点的 PI3K/ Akt 介导细胞增殖分化迁移凋亡自噬等多种生理功能, 同时也是调节自噬的重要信号通路 [13] 研究表明当细胞受饥饿缺氧等因素刺激时 PI3K/Akt 通路能够介导 mtor 的表达负性调节细胞的自噬 [14] 紫草素是存在于紫草植物根中的一种萘醌化合物, 既可从紫草根中提取, 也可用植物组织培养法培养而得近年来研究发现其对乳腺癌肝癌直肠癌口腔癌膀胱癌皮肤癌等多种肿瘤细胞均有抑制作用本实验观察了不同浓度的紫草素对人乳腺癌 MCF 7 细胞活力的损伤及其自噬的影响, 结果显示紫草素能降低 MCF 7 细胞活力, 上调 LC3 Ⅱ / LC3 Ⅰ 值, 下调 SQSTM1/p62 水平从而促进 MCF 7 细胞的自噬, 与此同时 PI3K Akt 的表达及其磷酸化水平 (p PI3K,p Akt) 也减少因此, 推测紫草素通过抑制 PI3K Akt 的表达及其磷酸化从而促进细胞自噬, 抑制 MCF 7 的细胞活力, 而目前的研究发现紫草素的抗癌作用机制主要是其促进肿瘤细胞的凋亡及坏死, 本研究首次观察到紫草素能促进肿瘤细胞自噬, 这也可能是其抗癌作用中的重要机制之一, 由于促进细胞发生自噬是多途径共同作用的结果, 因此紫草素促进人乳腺癌 MCF 7 细胞自噬的分子机制有待进一步研究参考文献 : [1] MizushimaN,LevineB,CuervoAM,KlionskyDJ.Autophagy fightsdiseasethroughcelularself digestion[j.nature,2008,451 (7182): [2] LevineB,YuanJ.Autophagyinceldeath:aninnocentconvict [J]?JClinInvest,2005,115(10): [3] KroemerG,LevineB.Autophagicceldeath:thestoryofamisno mer[j].natrevmolcelbiol,2008,9(12): [4] KlionskyDJ,AbeliovichH,AgostinisP,etal.Guidelinesforthe useandinterpretationofasaysformonitoringautophagyinhigher eukaryotes[j].autophagy,2008,4(2): [5] LevineB,KroemerG.Autophagyinthepathogenesisofdisease [J].Cel,2008,132(1): [6] MorgenszternD,McLeodHL.ThePI3 K/Akt/mTORpathwayas atargetforbreastcancertherapy[j].anticancerdrugs,2005,16 (8): [7] HouY,GuoT,WuC,etal.Efectofshikoninonhumanbreast cancercelsproliferationandapoptosisinvitro[j].yakugaku Zashi,2006,126(12): [8] GongK,LiW H.Shikonin,aChineseplant derivednaphthoqui none,inducesapoptosisinhepatocelularcarcinomacelsthrough reactiveoxygenspecies:apotentialnewtreatmentforhepatocelu larcarcinoma[j].freradicbiolmed,2011,51(12): [9] 张亚宏, 甘莹, 郭子华, 谢松强. 紫草素通过 ROS/p38 信号通路诱导人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡 [J]. 中国药理学通报,2011, 27(6): [9] ZhangYH,GanY,GuoZH,XieSQ.InvolvementofROS/p38 signalpathwayinshikonin inducedapoptosisinhelacels[j]. ChinPharmacolBul,2011,27(6): [10] YueZ,JinS,YangC,etal.Beclin1,anautophagygeneesential forearlyembryonicdevelopment,isahaploinsuficienttumorsup presor[j].procnatlacadsciusa,2003,100(25): [11]YangZJ,CheeCE,HuangS,SinicropeFA.Autophagymodula tionforcancertherapycancer[j].biolther,2011,11(2): [12]BjorkoyG,LamarkT,BrechA,etal.p62/SQSTM1formspro teinaggregatesdegradedbyautophagyandhasaprotectiveefect onhuntingtin in ducedceldeath[j].jcelbiol,2005,171(4):

5 [13] MarteliAM,EvangelistiC,FoloM Y,etal.Targetingthephos phatidylinositol3 kinase/akt/mammaliantargetofrapamycinsig nalingnetworkincancerstemcels[j].curmedchem,2011,18 (18): [14] SinghBN,KumarD,ShankarS,SrivastavaRK.Rotlerininduces autophagywhichleadstoapoptoticceldeaththroughinhibitionof PI3K/Akt/mTORpathwayinhumanpancreaticcancerstem cels [J].BiochemPharmacol,2012,84(9): ShikoninpromotesautophagyofMCF 7humanbreastcancercels throughpi3k/aktpathway CHENJu ying,liuzhao chun,zengzhi,huangwen dong,yangyong fei,zhubang hao (DeptofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat SenUniversity,Guangzhou ,China) Abstract:Aim Toexploretheefectofshikoninon theautophagyofmcf 7humanbreastcancercelsand itsmechanism.methods Thecelviabilitieswereex aminedbycck 8asay.AndtheexpresionsofLC3, p62,pi3k,akt,p PI3K,p Aktweretestedbywestern blotasay.results ThecelviabilitiesofMCF 7cels weresignificantlyinhibited,thevaluesoflc3 Ⅱ /LC3 Ⅰ wereelevated,andtheproteinlevelsofp62,pi3k, Akt,p PI3K,p Aktwerealdecreasedaftertreatedwith 1μmol L -1 shikonin48hand2 5,5μmol L -1 shikonin24h,48h.conclusions Shikonincanpro motetheautophagyofmcf 7cels,andtheposible mechanismisrelatedtothepi3k/aktsignalingpath way. Keywords:shikonin;MCF 7cels;autophagy;LC3; p62;pi3k;akt;p PI3K;p Akt

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2) 195 细胞接种于培养板中, 待细胞进入对数生长期进行实验 实验分为无血清的阳性对照组 紫草素 (1 2.5 和 5μmol L -1 ) 处理组 紫草素粉末用细胞用 DMSO 配制成溶液并过滤除

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2013Feb;29(2) 195 细胞接种于培养板中, 待细胞进入对数生长期进行实验实验分为无血清的阳性对照组紫草素 (1 2.5 和 5μmol L -1 ) 处理组紫草素粉末用细胞用 DMSO 配制成溶液并过滤除