人结肠癌 细胞系为研究对象 抑制物 转染 细胞后 观察 细胞增殖能力及!" 基因表达变化情况 预测及验证靶向调控!" 基因的 #$ 为后续科研以及临床治疗提供新的思路 材料与方法 材料人结肠癌 细胞系 正常结肠上皮组织细胞系 #%&' 细胞系来源于中南大学湘雅医学院医学检验系实验中心 &' 培养液

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1 对人结肠癌细胞系 细胞增殖及 基因表达的影响 林琳 周刘祥 王晓春 中南大学湘雅医学院医学检验系 湖南长沙 摘要 目的 探讨 "$ 对人结肠癌 细胞增殖及 ( 基因表达的影响 方法 运用实时荧光定量 )* 检测 细胞和正常结肠上皮组织 +*, 细胞中 "$ 与 ( "+- 的表达水平 "$ 抑制剂 $/$0$1 转染 细胞后 观察细胞增殖能力 及 "$ ( "+-"$ 表达水平 1 0% 检测 ( 蛋白表达水平 通过在线软件预测靶向 ( 基因的 "$+- 并用双荧光素酶报告基因实验验证 结果,$ 与 ( "+- 在结肠癌 细胞中过表达 ) "$ $/$0$1 组 细胞增殖受到明显抑制 ) 且 ( 基因表达量显下降 )"$ 均上调 其中 "$ 上调最显 ) 双荧光素酶报告基因实验验证 "$ 可靶向调控 ( 基因的表达 结 "$ 抑制剂可阻滞 细胞增殖且通过反馈性上调 "$ 靶向抑制 ( 基因的表达 关键词 "$ 结肠癌 细胞 增殖 ( 基因中图分类号 2 文献标识码 - 文章编号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结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤 其发病机制受多种因素影响 近年研究关注其与微小 +- "$1+-"$+- 的关系 如 "$ 缺失可促 进结肠癌发生 "$ 和 "$ 共同调节结肠 收稿日期 修回日期 基金项目 湖南省自然科学基金 中南大学研究生自主探索创新项目 通讯作者 王晓春!"#$%&''" 癌干细胞等,$ 与肿瘤的发生也存在密切的 关联 研究显示 "$ 可抑制肝细胞肿瘤的增殖 促进前列腺肿瘤的生长 脊椎蛋白 (3$ ( 是一种新型的 通路蛋白 参与调控细胞的增殖 分化以及形态发生 与多种肿瘤的发生发展存在密切联系 研究显示 ( 蛋白可促进肺部肿 瘤侵袭 驱使肠道干细胞肿瘤的发生 本研究以!"#!$

2 人结肠癌 细胞系为研究对象 抑制物 转染 细胞后 观察 细胞增殖能力及!" 基因表达变化情况 预测及验证靶向调控!" 基因的 #$ 为后续科研以及临床治疗提供新的思路 材料与方法 材料人结肠癌 细胞系 正常结肠上皮组织细胞系 #%&' 细胞系来源于中南大学湘雅医学院医学检验系实验中心 &' 培养液 美国 公司 胎牛血清 杭州四季青生物工程材料公司 "()*( +& +,- 试剂 美国 ( 公司 )!#) 上海吉玛基因 %%/ 美国 ((0 公司 逆转录试剂盒 实时荧光定量 +1% 试剂盒 南京 *,( 公司 $ 普通 % 仪 德国 ""( 公司 ("(-2! 实时荧光定量 % 仪 酶标仪 美国 3 * 公司 染液 美国 * 公司 流式细胞仪 美国 %2-( 公司 兔单克隆抗体 *) 美国 (* 公司 鼠单克隆抗体!" 美国 $3)-*- 公司 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠 北京鼎国公司 % 化学发光液 美国 % 公司 化学发光凝胶成像分析仪 美国 3* 公司 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 美国 (* 公司 方法 44 细胞培养取生长状态良好的结肠癌 细胞 用含 5 胎牛血清 63 的 &' 培养液置于 75 % 饱和湿度培养箱中培养 待细胞融合度达 5 85 时按照 传代 加入含 563 的 & ' 培养液吹打成细胞悬液 并细胞计数 调整细胞浓度为 7 个 9- 在 ' 孔细胞培养板中加入 - 细胞悬液 置于 75% 饱和湿度培养箱中培养用于后续实验 44 细胞转染将带有 % 荧光标记的 #( *( ) - #% 干粉瞬时离心后 用含 :% 的 ; 溶解 吹打混匀 配置成终浓度为 -9 的工作液 1 贮存 取 44 中的细胞 按照 "()*( +& 试剂说明书进行转染 ' 后更换新的 &' 培养液 继续培养用于后续实验 将 转染 细胞后 通过荧光显微镜和普通光学显微镜对比 计算转染效率 44 %%/ 检测细胞增殖将转染后处于对数生长期的 细胞用 479 胰蛋白酶室温消化 用 &' 培养液调节细胞悬液浓度 以 7 个 9 孔接种于 8' 孔板中 分别设置对照组 仅含细胞 培养基 空白组 仅培养基 及实验组 组 #% 组 -" 组 每组各设 ' 个复孔 分别于转染后 8' 每孔加入 - %%/ 溶液 继续培养 后 用酶标仪测定在 7 处的 : 值 计算增殖率 实验重复 次 44 总 #$ 提取及逆转录转染后 细胞融合度达到 85 时 弃掉培养液 按照 +,- 试剂说明书提取总 #$ 通过紫外分光光度计测定 #$ 的纯度和浓度 取吸光度 $'9 为 44 样品按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录 得到 ):#$ 447 实时荧光定量 % 反应体系为 - 包括 (( *!( - 前向引物 4- 后向引物 4- (( ()( ( 4-):#$ 4- 灭菌蒸馏水至 - 循环参数为 !7'! 个循环 87 7!'!87 7! 采用 1% 法计算相对表达量 每个样品设 ' 个复管 实验重复 次 44' (!( - 取上述 细胞接种于 ' 孔板中 于 75 % 培养箱培养 后收集 设置实验组 组 #% 组和 -" 组 根据全蛋白质提取试剂盒和 3%$ 蛋白质提取试剂盒说明书操作提取上述 细胞的总蛋白质并进行定量 按照 7 总蛋白质上样 经 5:1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 冰水浴中 ' 条件下电转移至 :6 膜上 79 脱脂牛奶 +3+ 配制 封闭 分别加入鼠单克隆抗体!" 稀释 兔单克隆抗体 *)7 稀释 过夜 +3+ 洗涤 次 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 和山羊抗兔 均为 7 稀释 温育 +3+!"#!$

3 洗涤 次 经化学发光法 显色 于化学发光凝胶成像分析仪上成像 图像处理软件对条带灰度值进行分析 公式 目的蛋白灰度值!" 灰度值 实验重复 次 ## 双荧光素酶报告基因检测由上海吉玛合成 $%&' $$%&' " $ 重组入双荧光素梅报告基因质粒 &%! 多克隆位点 分别获得野生型和突变型 将 '(' 细胞接种于 ) 孔板 待细胞融合度达 * 左右进行转染 将 的双荧光素酶报告质粒及 +"', 终浓度的!$-+!!% 或阴性对照共转染 '(' 细胞 / 后更换 0)+ 完全培养基 )/ 后检测荧光素酶活性 统计学处理采用 1!!" 统计软件进行 计量数据以 % 表示 两组间的比较用配对检验 以 + 为有统计学意义 结果!$)) 与 $%&' 在结肠癌 '(' 细胞中的表达水平荧光定量 $ 结果显示 '(' 细胞中!$)) 与 $%&' $ 的表达水平均高于正常结肠上皮组织细胞系 )0 2#)-2#- 2# 2#3! - 表明!$)) 及 $%&' 基因可能参与结肠癌的发生发展 $,!( 9&%%!'" ':!$))$%&' $ 转染后!$)) 表达情况!$))!"/!4! ' 转染 '(' 细胞 )/ 后 置于荧光显微镜和普通显微镜下观察 转染效率为 5#*#*63! 7 荧光定量 $ 结果显示!$))!"/!4! ' 组与其他组相比较明显受到抑制 ! 表明转染 )/ 后!$))!"/!4! ' 进入细胞并发挥作用 为后续实验奠定基础 -#+ 5 0 ) - + ' 8 '('!"!#$%%&!$' 检测细胞增殖 )0+,,,!"%!$)) $%&'!$))!"/!4! ' 组与其他两组相比 转染 )/ 时细胞增殖受抑制最明显 且差异具有统计学意义 1!" '&!,!'%'& ; 3,'%"!'%'&!"!# $%% "!! # % " #!"!"#!$

4 01" %"( '"&& + & /"&& "(")"%, " %$ 01" %"( '* + & /"&& "(")"%, " %$!!"# "$% $ #!$&"#!!"# "$! "% $ #!$&"# +,00 %0"%1"( %12 & 15"( 34 &34 /"&& "(")"%, " '"&& "(")"%,"!!"# "$! " "# $ #!$&"# & & + "'!"#$% & 表明 '"&& 受抑制时可阻滞结肠癌 细胞的增殖 基因表达变化情况 细胞转染 & 后 '"&& "(")"% 组 细胞 '* 表达水平显下降 + ++!"#$% 蛋白表达量受抑制 ++!"#$% 以上结果表明 '"&& 抑制剂可下调 细胞 基因的表达 ' "$"#! 其他内源性 '"* 表达情况 通过荧光定量, 检测 '"&& "(")"% 转染后 '" '" '" 的表达情况 结果显示 当 '"&& 受到抑制时 '" -- 均有不同程 01" %"( '"&&- - - & /"&& "(")"%, %$ /"&& /" /" /"!!"#! "$ %()()(* $ #!$&"# 度的表达上调 其中 '" 过表达最显 +!"#$% 表明 '"&& 受抑制时可反馈性上调 '"!"#!$

5 靶向调控 基因的 预测及验证通过!"#$ %&"" ''"!"#$ ' %&""''#$ '#$'&! %&""''( '' 三大数据库预测发现 ) 可靶向调控 基因 双荧光素酶报告基因实验证明 ) 可特异结合 的 * 而抑制其表达 预测的结合位点突变时 该基因的抑制效应也随即消失 "+,-///)0 1! 表明 )/ 可通过与靶基因 的 * 直接作用下调其表达水平!"2! 1#>!!!2! ) ) ), ) ),!! " 讨 :B"* )B"* -8 :B1"$"* 1 )B1"$"*,, 位于染色体 其表达异常与多种肿瘤发生发展有关 研究显示,, 可以通过靶向调控成纤维细胞生长因子受体 00 抑制血 管瘤细胞的增殖与迁移 在急性骨髓性白血病中,, 通过调控多形性腺瘤基因 - 增加药物治疗的敏感度 以上研究提示,, 不仅促进肿瘤的发生 同时可以作为辅助治疗肿瘤的新型药物 本研究发现 在结肠癌 2 细胞中,, 处于过表达状态 转染,, $&(" 后 2 细胞中,, 表达量显下降 且细胞增殖受到抑制 表明在结肠癌 2 细胞中下调,, 可以有效抑制肿瘤细胞的增殖 为结肠癌的临床治疗提供新的思路 基因编码表达的 蛋白是 蛋白家族的一员 其家族包括, 个成员即, 其中 蛋白受到广泛关注 蛋白与, 配体结合通过 3$" 信号通路调控肿瘤的发生 也可通过 40'0, 信号传导模块调控恶性肿瘤的 6 发展过程 在肠道肿瘤中 5$ 等发现 和 融合可以驱使肠道肿瘤发生并维持肿瘤细胞的生存 蛋白在结肠癌的发生发展中扮演着重要角色 抑制 蛋白的表达水平将有助于结肠癌的预防与治疗 本研究中,, $&(" 转染 2 细胞后 以及蛋白表达量均显下降 而在经典理中 与靶基因的特殊序列结合 诱导靶 的剪切或遏制其翻译达到调控靶基因表达的目的 是一种负向调控 表明在本研究中,, 不能直接靶向调控 基因 而是通过其他 / 途径间接影响其表达 途径一 7&$ 等研究表明 受抑制可导致其他内源性 上调 本研究中,, 受抑制后可导致其他内源性 的反馈性上调 如 8')') 其中 ) 上调最显 并通过预测软件以及实验证明 ) 可以靶向下调 基因的表达 途径二,, 可损害泛素化以激活 9 基因 9 因子 )) 可通过刺激 :"!$$ 的表达影响 3$" 信号通路 蛋白也可通过 :"!$$ 调控 3$" 信号通路 当,, 受抑制时不会激活 9 基因的表达 则 :"!$$ 反馈性上调 因此 蛋白受到反馈性抑制 由此推测,, 的变化可间接影响 蛋白的表达 此方面还需进一步的研究证实 综上所述 本研究结果表明,, 受抑制可阻滞结肠癌 2 细胞的增殖 并通过反馈性上调 ) 靶向下调 蛋白的表达 提示,, 抑制剂可以作为 蛋白高表达性结肠癌的治疗用药 为结肠癌的预防及治疗提供新的方向 参考文献 ;)!1! 7$ ##!$!" # )88!!"$ "! "1!$! $ "&! <=!"&$!'!<"$ 1>"! 1! > #$ #$#! ; AA! -0&$!" ) $ ),8 #!"$ $! 1"$ > #$ #$#! "!!"#!$

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凡临床试验都应在中国临床试验注册中心注册 全球临床试验注册制度由世界各国政府共同决定由 8 领导建立 临床试验注册具有伦理和科学的双重意义 目的是为了尊重和珍惜所有试验参与者的贡献 他们的贡献用于改善全社会的医疗保健 因此 任何临床试验都与公众利益相关 公开临床试验的信息 并将其置于公众监督之下是试验研究者的义务和道德责任 临床试验注册不仅能确保追溯每个临床试验的结果 公开在研试验或试验结果信息还有助于减少不必要的重复研究 中国临床试验注册中心 1(! (!( "( 5(,"1( 为国家卫生计生委 原卫生部 下属的国家临床试验注册中心 是世界卫生组织国际临床试验注册协作网一级注册机构 "2,1 8"5!(A,(!!,"!,(! (!( "( 5(,",(! <,>"4 <"(4 "@ 5(,"8 < <"(4 "@ 5(," 由中国循证医学中心和四川大学华西医院等于 99$ 年 月 $ 日正式成立并运行 1( 的宗旨是联合中国和全球的临床医师 临床流行病学家 统计学家 流行病学家和医疗卫生管理者 严格科学地管理中国临床试验信息 提高其质量 为广大医务工作者 医疗卫生服务消费者和政府卫生政策制定者提供可靠的临床试验证据 让医疗卫生资源更好地服务于中国人民和全人类的健康事业 所有在人体实施的试验均属于临床试验 都应该先注册后实施 凡已注册临床试验都会被授予 8 < 全球统一的唯一注册号 我国众多医学期刊已和中国临床试验注册中心共同建立了临床试验报告发表机制 正在分步实施优先发表 直到只发表具有全球性唯一的注册号的临床试验报告 1( 接受中国地区及全球的临床试验注册申请 还接受获得 8 < 认证的二级注册机构输送的注册资料 并向 8 < 中央数据库输送注册信息供全球检索 除注册临床试验外 1( 以中国循证医学中心 循证医学教育部网上合作研究中心 中国 1"! 中心 英国 1"! 中心 四川大学华西医院国际临床流行病学网华西资源与培训中心为人才和技术支持平台 负责指导临床试验设计 中心随机 文写作 教育培训 推动提高我国临床试验的质量 通过 1( 检索入口网址 666-1(,"-"5 公众可方便地查询已注册临床试验信息 并与 8 全球检索入口链接 可方便地查询全球已注册临床试验!"#!$

7 北京大学学报 医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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