16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 公司 );Matrigel 基质胶 ( 美国 BD 公司 );MTT DMSO AnnexinV PE/7 AAD 试剂盒 ( 美国 Sigma 公司 );CCK 试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒

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祺宰
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1 殏檪檪殏研究报告檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪中国生物工程杂志殏殏 ChinaBiotechnology,2015,35(1):15 20 DOI: /j.cb MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 生物学行为的影响 1 易守会 2 王东林 2 吴志鹃 1 杨文影 2 赵启成 1 陈晓品 (1 重庆医科大学附属第一医院重庆重庆市肿瘤医院重庆 ) 摘要目的 : 观察 MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 增殖侵袭及化疗敏感性的影响方法 : 采用 MUC1 表达阴性的结肠癌细胞株 HCT116, 通过慢病毒转染嘌呤霉素筛选半定量 RT PCR 和 Westernblot 鉴定构建稳定表达 MUC1 的 HCT116 细胞株 ; 实验分空病毒组和 MUC1 病毒组 ;CCK 实验和软琼脂克隆形成实验检测两组细胞的增殖能力,Transwel 侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力 ;MTT 法和流式细胞仪检测两组细胞对奥沙利铂的敏感性, 酶底物法检测 Caspase 3 活性结果 : 获得稳定表达 MUC1 的 HCT116 细胞株 ; 两组细胞贴壁生长无差异 ; 与空病毒组相比, MUC1 病毒组细胞软克隆形成数增加, 穿过小室的细胞数增加 (P<0.05);MUC1 病毒组细胞对奥沙利铂的敏感性降低,MUC1 病毒组 Caspase 3 活性水平低于空病毒组 (P<0.05) 结论:MUC1 与结肠癌的非锚定依赖生长侵袭和化疗敏感性有关关键词 MUC1 结肠癌增殖侵袭化疗敏感性中图分类号 R735.3 结直肠癌 (colorectalcarcinoma,crc) 发病率在肿瘤中居第三位, 且其发病率逐年升高在结直肠癌发病早期,90% 的患者可通过手术治疗痊愈, 但大部分患者在确诊时已是中晚期, 虽经手术和放化疗等综合治疗, 结果仍预后差并且产生肿瘤耐药 [1?2] MUC1 是一个大分子跨膜糖蛋白, 由细胞膜外部分跨膜部分和膜内部分组成, 最先由 Shimizu [3] 于 1982 年从人的乳汁中分离得到, 编码基因位于 lq21 MUC1 正常表达于导管上皮细胞管腔面, 在上皮来源的肿瘤组织中高表达, 异常糖基化, 失去极性, 分布于整个细胞表面 MUC1 的胞外段可作为受体与其配体结合, 或作为配体与其受体相互作用, 胞内段与多条信号通路相互联系, 在肿瘤的增殖侵袭转移和化疗耐药中收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ), 重庆市科委项目 (2011BB5120) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :cxp640910@163.com 起重要作用 [4 5] MUC1 作为一个癌蛋白在乳腺癌的研究中较为深入为了研究 MUC1 在结肠癌中的作用, 本实验以 MUC1 表达阴性的人结肠癌细胞株 HCT116 为主要研究对象, 通过慢病毒转染获得稳定表达 MUC1 的 HCT116 细胞株, 观察 MUC1 对细胞增殖侵袭和化疗敏感性的影响 1 材料与方法 1.1 材料及试剂人结肠癌细胞株 HCT116 由本实验室保存 MUC1 慢病毒表达载体由上海吉凯基因技术有限公司构建 RPMI1640 DMEM 高糖培养基胎牛血清 ( 美国 Hyclone 公司 ); 细胞总蛋白质提取试剂盒 ( 上海贝博公司 ) MUC1 鼠单克隆抗体 ( 美国 SantaCruz 公司 ) β actin 鼠单克隆抗体山羊抗鼠 IgG 抗体 HRP 标记 ( 北京中杉金桥公司 );Trizol 试剂 PCRkit 试剂盒 ( 日本 TaKaRa

2 16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 公司 );Matrigel 基质胶 ( 美国 BD 公司 );MTT DMSO AnnexinV PE/7 AAD 试剂盒 ( 美国 Sigma 公司 );CCK 试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 ( 碧云天 ) SDS PAGE 蛋白质电泳仪蛋白质转膜仪 ( 美国 Bio Rad 公司 );PCR 仪 ( 美国 AppliedBiosysems 公司 ); 凝胶成像系统 ( 美国 Bio Rad 公司 ) 引物采用软件 Primer5.0 设计, 由上海生工技术有限公司合成 1.2 方法细胞培养人结肠癌细胞 HCT116 在含 10% 胎牛血清和双抗 (100U/ml 青霉素和 0.1mg/ml 链霉素 ) 的 RPMI1640(1640,Hyclone) 培养基中于 37 和 5% CO 2 的孵育箱中培养细胞转染在 6 孔板里接种个细胞, 培养 24h 后, 取 MOI 值为 40 将含有 MUC1 表达片段的慢病毒 (LV MUC1) 和空白对照慢病毒 (Vector) 分别感染 HCT116 细胞, 病毒感染的同时加入 5μg/ml 的聚凝胺 (polybrene) 以增加感染效率, 感染第二天去除含病毒的培养基更换为完全培养基,48h 后加入 2μg/ml 的嘌呤霉素筛选, 以后以 1μg/ml 的嘌呤霉素维持培养实验分为 MUC1 病毒组和空病毒组半定量 RT PCR 收集对数生长期的细胞, 采用 Trizol 法提取细胞总 RNA, 通过半定量 RT PCR 分析 MUC1 mrna 表达 MUC1 上游引物为 5 GCACCGACTACTACCA AGAG 3, 下游引物为 5 AAGGAAATGGCATCACT 3, 退火温度 55, 扩增片段大小 258bp;B actin 上游引物 5 TGACGTGGAC ATCCGCAAAG 3, 下游引物 5 CTGGAAG GTGGACAGCGAGG 3, 退火温度 60, 扩增片段大小 205bp Westernblot 实验提取细胞总蛋白质并定量, 调整蛋白质上样量至相同水平进行 SDS PAGE 电泳, 电泳完毕后,200mA 转膜 2h 之后加 5% 脱脂奶粉 37 封闭 1h; 加稀释的 MUC1 抗体稀释的 β actin 抗体,4 过夜 ;TBST 洗涤, 加稀释的二抗,37 孵育 1h,TBST 洗涤后 ECL 发光 CCK 法检测细胞增殖分别消化 MUC1 病毒组细胞和空病毒组细胞, 按 4000 个 / 孔接种于 96 孔板培养, 设置 5 个时间点 (6h 24h 48h 72h 和 96h), 每个时间点设置 5 个孔,37 5% CO 2 孵箱中培养至各时间点,CCK 法检测 450nm 吸光度值, 实验共重复 3 次软琼脂克隆形成实验用蒸馏水制备 1.2% 和 0.7% 的低溶点琼脂糖液, 高压灭菌后,40 水浴保温 1.2% 的琼脂糖与 2 DMEM( 含有 2 抗生素和 20% 的胎牛血清 ) 按 1 1 混匀后,2.5ml/ 孔加入 6 孔板, 室温下冷却 (30min) 至凝固, 作底层琼脂分别消化 MUC1 病毒组细胞和空病毒组细胞, 并计数细胞 ml -1 底层琼脂冷却后, 按 1 1 加入 0.7% 的琼脂糖与 2 DMEM 培养液, 并加入 20μl 细胞悬液混匀后, 1.0ml/ 孔注入铺有底层琼脂的 6 孔板, 每孔含个细胞待上层琼脂凝固后, 放入 37 5% CO 2 孵箱中培养 2 周后, 置于倒置显微镜下观察细胞克隆形成情况, 随机选择 3 个视野进行克隆计数 ( 含有 30 个细胞以上的集落计为 1 个克隆 ), 取其平均值作为克隆的形成数 Transwel 侵袭实验取 50mg/L 的 matrigel, 按 1 8 稀释, 各室加入 100μl, 放入 37 培养箱中, 凝固后取出, 用 1640 洗两遍分别消化 MUC1 病毒组和空病毒组细胞, 用 1640 洗 2 遍, 用 1640 重悬并计数为 /ml, 先向每个 Transwel 小室下室加入 600μl 含 10% 胎牛血清的 1640 培养液, 再向每个小室上室加入 200μl 细胞悬液 ( cels), 将板置于 37 5% CO 2 孵箱中培养 48h, 用无菌棉签擦除上室内细胞, 用 PBS 洗两遍,4% 多聚甲醛固定 30min,0.1% 结晶紫染色, 于倒置显微镜下选取 3 个不同视野计数穿过膜的细胞数, 并采集图像 MTT 法测奥沙利铂 24hIC 50 分别消化 MUC1 病毒组和空病毒组细胞, 并计数细胞, 按 4000 个 / 孔接种于 96 孔板培养, 待细胞长至 70% 密度时, 加入 0μg/ml 2μg/ml 4μg/ml 8μg/ml 和 64μg/ml 奥沙利铂培养 24h,MTT 法检测 490nm 吸光度值每一浓度设置 5 个复空, 实验重复 3 次流式细胞仪检测细胞凋亡分别消化 MUC1 病毒组和空病毒组细胞, 并计数细胞, 按个 / 孔接种于 6 孔板, 待细胞长至 70% 密度时, 加奥沙利铂 (5μg/ml) 培养 36h 后, 按 AnnexinV PE/7 AAD 试剂盒操作手册进行重悬细胞于 50μlBindingBufer 和 5μl 7 AAD 混合液中, 室温避光反应 10min, 加入 450μl BindingBufer 和 1μlAnnexinV PE, 室温避光反应 10min, 流式细胞仪分析 Caspase 3 活性检测分别消化 MUC1 病毒组和空病毒组细胞, 并计数细胞, 按个 / 孔接种于 6 孔板, 待细胞长至 70% 密度时, 加奥沙利铂 (5μg/ml) 培养 36h 后收集细胞加 100μl 裂解液, 冰浴 15min,

2015,35(1) 易守会等 :MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 生物学行为的影响 17 4 16000 转离心 15min, 收集上清液, 按照 Caspase 3 活性检测试剂盒说明书所示具体步骤操作, 用酶标仪检测 405nm 吸光度值 1.2.11 统计学处理使用 prism5.0 统计软件对结果进行统计分析, 数据用 Mean±SEM 表示, 采用 t 检验, P<0.

1 细胞转染慢病毒转染 HCT116 细胞后经嘌呤霉素筛选在荧光显微镜下观察转染率达 90% 以上 ( 图 1) 半定量 RT PCR 结果表明 MUC1mRNA 在 MUC1 病毒组表达, 在空病毒组不表达 ( 图 2) Westernblot 结果显示, MUC1 蛋白在 MUC1 病毒组表达, 在空病毒组不表达 ( 图 2) 图 2 慢病毒转染 HCT116 细胞 MUC1mRNA 和

3 2015,35(1) 易守会等 :MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 生物学行为的影响转离心 15min, 收集上清液, 按照 Caspase 3 活性检测试剂盒说明书所示具体步骤操作, 用酶标仪检测 405nm 吸光度值统计学处理使用 prism5.0 统计软件对结果进行统计分析, 数据用 Mean±SEM 表示, 采用 t 检验, P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 细胞转染慢病毒转染 HCT116 细胞后经嘌呤霉素筛选在荧光显微镜下观察转染率达 90% 以上 ( 图 1) 半定量 RT PCR 结果表明 MUC1mRNA 在 MUC1 病毒组表达, 在空病毒组不表达 ( 图 2) Westernblot 结果显示, MUC1 蛋白在 MUC1 病毒组表达, 在空病毒组不表达 ( 图 2) 图 2 慢病毒转染 HCT116 细胞 MUC1mRNA 和 MUC1 蛋白表达 Fig.2 ExpresionofMUC1mRNAandMUC1protein inhct116celsaftertransfectedwithlentivirus 1:Controllentivirusgroup β actin;2:controllentivirusgroup MUC1;3:MUC1 lentivirusgroupβ actin;4:muc1 lentivirus groupmuc1;5:maker 图 3 细胞生长曲线 Fig.3 Celgrowthcurve 图 1 慢病毒转染 HCT116 细胞的荧光图片 (100 ) Fig.1 Fluorescencemicroscopcmagesof HCT116celsinfectedwithlentivirus(100 ) (a)controllentivirusgroupwhitelight (b) Controllentivirus groupfluorescence (c) MUC1 lentivirusgroup whitelight (d)muc1lentivirusgroupfluorescence 2.2 CCK 法检测细胞增殖和软琼脂克隆形成实验根据各个时间点所测的 OD 值 (450nm) 绘制细胞生长曲线结果表明,MUC1 病毒组与空病毒组的细胞增殖无差异 ( 图 3); 软琼脂克隆形成实验显示, 与空病毒组相比,MUC1 病毒组软琼脂克隆形成能力明显增强 [(26.0±2.31)vs(5.67±1.45)(P<0.05)]( 图 4) 以上实验表明,MUC1 对细胞的贴壁生长无显著影响, 但能增强细胞的非锚定依赖生长能力 2.3 MUC1 对 HCT116 侵袭的影响通过 Transwel 实验检测 MUC1 对 HCT116 细胞侵袭能力的影响 MUC1 病毒组穿过小室纤维素膜的细胞数与空病毒组相比有明显差异 [(27.3±4.41)vs (81.0±8.14)(P<0.05)]( 图 5) 2.4 MUC1 对化疗敏感性的影响由 MTT 实验所得 OD 值采用 prism5.0 统计软件计算 IC 50, 两组细胞奥沙利铂作用 24h 后人 IC 50 分别为 : 空病毒组 IC 50 为 14.27±0.25,MUC1 病毒组 IC 50 为 26.03±0.20 奥沙利铂(5μg/ml) 处理细胞 36h 后, 流式细胞仪检测两组细胞的凋亡, 凋亡率分别为 26.6± ±1.44( 图 6) 以上结果显示, 转染 MUC1 后细胞对奥沙利铂的敏感性降低 (P<0.05) 奥沙利铂 (5μg/ml) 处理细胞 36h 后, 酶底物反应法检测两组细胞的 Caspase 3 活性, 两组细胞的 Caspase 3 活性 (U) 分别为 16.56± ±0.49(P<0.05)( 图 7) 结果显示,MUC1 降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性

18 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No.12015 图 4 软克隆形成实验 (40 ) Fig.4 Softagarcolonyformationasay(40 ) (a)controllentivirusgroup (b)muc1lentivirusgroup (c)histogram 图 6 流式细胞仪检测细胞调亡 Fig.

5 Transwelmigrationasay(200 ) (a)controllentivirusgroup (b)muc1lentivirusgroup (c)histogram 与 Caspase 3 活性相关 MUC1 作为一个癌蛋白与肿瘤的发生发展及耐药密切相关为了研究 MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 的影响, 我们通过慢病毒转染嘌呤霉素筛选半定量

4 18 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 图 4 软克隆形成实验 (40 ) Fig.4 Softagarcolonyformationasay(40 ) (a)controllentivirusgroup (b)muc1lentivirusgroup (c)histogram 图 6 流式细胞仪检测细胞调亡 Fig.6 Flowcytometryapoptosis (a)controllentivirusgroup (b)muc1lentivirusgroup (c)histogram 图 7 Caspase 3 活性 Fig.7 Caspase 3activity 3 讨论图 5 Transwel 实验 (200 ) Fig.5 Transwelmigrationasay(200 ) (a)controllentivirusgroup (b)muc1lentivirusgroup (c)histogram 与 Caspase 3 活性相关 MUC1 作为一个癌蛋白与肿瘤的发生发展及耐药密切相关为了研究 MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 的影响, 我们通过慢病毒转染嘌呤霉素筛选半定量 RT PCR 和 Westernbblot 鉴定, 获得稳定表达 MUC1 的 HCT116 细胞株 CCK 法检测细胞增殖结果显示, 空病毒组细胞与 MUC1 病毒组细胞的增殖无差异 ; 软琼脂克隆形成实验结果显示,MUC1 病毒组的克隆形成数大于空病毒组以上实验表明 MUC1 对 HCT116 细胞的贴壁生长没有影响, 但能显著增强 HCT116 细胞的非锚定依赖生长能 [6] 力 Tamada 等使用 MUC1 基因转染 ES 2 透明腺癌

5 2015,35(1) 易守会等 :MUC1 对人结肠癌细胞 HCT116 生物学行为的影响 19 细胞系得到表达 MUC1 的 ES 2 细胞系和不表达 MUC1 的对照细胞系, 经过体外和体内实验发现,MUC1 对 ES 2 细胞的体外生长无影响, 但是能促进 ES 2 细胞的 [7] 体内生长 Li 等的研究发现, 大鼠 3Y1 细胞过表达人 MUC1 能够诱导细胞发生恶性转化, 并增加其软琼脂克隆形成能力 Transwel 的实验结果显示,MUC1 病毒组穿过小室纤维素膜的细胞数明显多于空病毒组, 表明 MUC1 能增强结肠癌细胞的侵袭能力研究发现,MUC1 与肿瘤的侵袭转移有关, 在患者的转移灶和循环肿瘤细胞中发现高水平 MUC1 的表达 [8] [9] Hom 等的研究发现, 小鼠乳腺肿瘤细胞 DA3 转染 MUC1 后, 细胞间质标志物表达水平升高, 上皮标志物表达水平降低, 细胞通过 [10] 基质胶的能力增强 Chen 等发现,PI3K/Akt/mTOR 途径的激活可通过诱导 MMP9 的表达, 降解细胞外基质, 利于肿瘤细胞的侵袭和转移已往的研究表明, MUC1 与 PI3K Akt 信号通路有关,MUC1 CY 20 HPM 区酪氨酸 (Tyr 20) 的磷酸化使 MUC1 C 和 PI3Kp85 调节亚基的 Src 同源区 2(SH2) 结构域相互作用, 阻止 PI3Kp85 亚单位对 P110 催化亚基的抑制, 激活 PI3K Akt 信号通路 [11 12] 此外,MMP 9 的启动子区含有 NF κb 的结合位点 [13],MUC1 C 与 NF κb 信号通路有关, 其可以直接和 IKKβ IKKγ 复合体相互作用, 诱导 IκBα 降解, 释放 RelA 进入细胞核, 从而激活 NF κb 信号通路 [14] 但是 MUC1 促进侵袭转移的具体机制还不是很清楚, 需要进一步的研究转移性结肠癌最主要的治疗方式是化疗, 奥沙利铂是转移性结肠癌一线治疗的主要用药, 但随着其在临床的运用, 耐药问题逐步凸现出来研究报道, MUC1 的过表达阻止基因毒性抗癌药物诱导的细胞凋亡 [15 16] [17] Deng 等用 sirna 抑制胃癌细胞 MUC1 表达, 使胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性增加研究表明, 合并使用 MUC1 C 的胞内段抑制剂 GO 201/203 和化疗药物, 可以增加化疗药物的敏感性, 增加肿瘤细胞的凋亡 [18] 本研究发现, 转染 MUC1 后, 奥沙利铂作用细胞 24h 后 IC 50 显著升高 (P<0.05); 奥沙利铂 (5μg/ml) 处理细胞 36h 后, 空病毒组细胞的凋亡率约为 MUC1 病毒组细胞的 1.5 倍, 提示 MUC1 可降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性以往的研究发现,MUC1 阻止药物诱导的 DNA 损伤导致的细胞凋亡可能通过以下机制 :1MUC1 C 定位于线粒体外膜, 减弱线粒体细胞色素 c 的释放 [19],MUC1 C 直接与 Bax 相结合阻断 Bax 激活线粒体凋亡途径的功能 [20] ;2 在细胞质中黏蛋白与 c Abl 相结合, 阻止 c Abl 入核从而抑制细胞凋亡 [16] 本研究发现,MUC1 可以显著降低奥沙利铂作用细胞后 Caspase 3 的活性, 提示 MUC1 降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性与 Caspase 3 活性相关本实验通过慢病毒转染获得稳定表达 MUC1 的人结肠癌细胞株 HCT116, 发现转染 MUC1 后, 细胞的软琼脂克隆形成能力明显增高侵袭能力增强对奥沙利铂的化疗敏感性降低初步探讨 MUC1 耐药机制发现这可能与 Caspase 3 的活性相关但对于引起 Caspase 3 活性下降的具体机制需要进一步的研究总的来说, 本研究为结肠癌的治疗提供了一个新思路, 有可能通过抑制 MUC1 促进结肠癌细胞凋亡抑制结肠癌细胞侵袭提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性, 从而抑制结肠癌的发展参考文献 [1]JemalA,BrayF,CenterM M,etal.Globalcancerstatistics. CACancerJClin,2011,61(2): [2] SiegelR,DeSantisC,VirgoK,etal.Cancertreatmentand survivorshipstatistics,2012.cacancerjclin,2012,62(4): [3]ShimizuM,YamauchiK.Isolationandcharacterizationofmucin like glycoprotein in human milk fatglobule membrane. J Biochem,1982,91(2): [4]NathS,MukherjeeP.MUC1:amultifacetedoncoproteinwitha keyroleincancerprogresion.trendsmolmed,2014,20(6): [5]KufeD W.MUC1 Concoproteinasatargetinbreastcancer: activation ofsignaling pathwaysand therapeutic approaches. Oncogene,2013,32(9): [6] TamadaY, TakeuchiH, SuzukiN, etal. Biologicaland therapeuticsignificanceofmuc1withsialoglycansinclearcel adenocarcinomaoftheovary.cancersci,2007,98(10): [7]LiYQ,LiuD,ChenDS,etal.HumanDF3/MUC1carcinoma asociatedproteinfunctionsasanoncogene.oncogene,2003,22 (38): [8] Horm T M, SchroederJA. MUC1 and metastaticcancer expresion,functionandtherapeutictargeting.celadhesmigr, 2013,7(2): [9] HornG,GazielA,WreschnerD H,etal.ERK andpi3k regulate diferentaspects ofthe epithelialto mesenchymal transitionofmammarytumorcelsinducedbytruncatedmuc1. ExpCelRes,2009,315(8):

6 20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No [10]ChenJS,WangQ,FuXH,etal.InvolvementofPI3K/PTEN/ AKT/mTORpathwayininvasionandmetastasisinhepatocelular carcinoma:asociationwithmmp 9.HepatolRes,2009,39 (2): [11]RainaD,KharbandaS,KufeD.TheMUC1oncoproteinactivates theanti apoptoticphosphoinositide3 kinase/aktandbcl x(l) pathwaysinrat3y1fibroblasts.jbiolchem,2004,279(20): [12]RainaD,KosugiM,AhmadR,etal.DependenceontheMUC1 Concoproteininnon Smalcellungcancercels.MolCancer Ther,2011,10(5): [13]KimY,KangH,JangSW,etal.Celastrolinhibitsbreastcancer celinvasion viasuppresion ofnf kappab mediated matrix metaloproteinase 9Expresion.CelPhysiolBiochem,2011,28 (2): [14] AhmadR, RainaD, TrivediV, etal. MUC1 oncoprotein activatestheikappabkinasebetacomplexandconstitutivenf kappabsignaling.natcelbiol,2007,9(12):u1419 U1146. [15]RenJ,AgataN,ChenD S,etal.HumanMUC1carcinoma asociated protein confers resistance to genotoxic anticancer agents.cancercel,2004,5(2): [16]RainaD,AhmadR,KumarS,etal.MUC1oncoproteinblocks nucleartargetingofc Ablin theapoptoticresponsetodna damage.emboj,2006,25(16): [17]DengM,JingDD,MengXJ.EfectofMUC1siRNAondrug resistanceofgastriccancercelstotrastuzumab.asianpacj CancerPrev,2013,14(1): [18]RainaD,UchidaY,KharbandaA,etal.TargetingtheMUC1 C oncoprotein downregulates HER2 activation and abrogates trastuzumabresistanceinbreastcancercels.oncogene,2014, 33(26): [19]RenJ,RainaD,ChenW,etal.MUC1oncoproteinfunctionsin activation offibroblastgrowth factorreceptorsignaling. Mol CancerRes,2006,4(11): [20]AhmadR,AlamM,RajabiH,etal.TheMUC1 Concoprotein bindstothebh3domainofthepro apoptoticbax proteinand blocksbax function.jbiolchem,2012,287(25): EfectofMUC1onBiologicalBehaviourofHuman ColorectalCancerCelHCT116 YIShou hui 1 WANGDong lin 2 WUZhi juan 2 YANGWen ying 1 ZHAOQi cheng 2 CHENXiao pin 1 (1DepartmentofOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing ,China) (2DepartmentofOncology,ChongqingCancerHospital,Chongqing ,China) Abstract Objective:ToinvestigatetheefectofMUC1onproliferation,invasionandchemosensitivityof humancolorectalcancercellinehct116.methods:thehct116humancoloncancercelsweretransfected withlentiviralvectorswithandwithoutmuc1,thenselectedbypuromycin.theexpresionofmuc1was detectedbysqrt PCRandWesternblot.Thereweretwogroupsinourexperiment:MUC1lentivirusgroupand controllentivirusgroup. CCK method and softagarcolony formation method were used to detectcels proliferation,transwelmembraneasaytodetectcelsinvasion,mttmethodandflowcytometrytodetectcels sensitivitytooxaliplatinandthecolorimetricmethodtodetectcaspase 3activity.Results:HCT116cellinewith stableexpresionofthemuc1wasacquired.comparedwithcontrollentivirusgroup,thenumberofsoftagar coloniesinmuc1lentivirusgroupwasincreasedsignificantly(p<0.05),thenumberofinvasivecelswas increasedsignificantly(p<0.05).chemosensitivitywasdecreasedinthemuc1lentivirusgroup(p<0.05). Caspase 3activitywassignificantlylowintheMUC1lentivirusgroup(P<0.05).Conclusion:MUC1isrelated totheanchorage independentgrowth,invasionandchemotherapyofcolorectalcancer. Keywords MUC1 Colorectalcancer Proliferation Invasion Chemotherapysensitivity

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot