中华乳腺病杂志 ( 电子版 )2007 年 8 月第 1 卷第 4 期 ChinJBreastDis(ElectronicVersion),August2007,Vol.1,No.4 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究

Size: px

Start display at page:

Download "中华乳腺病杂志 ( 电子版 )2007 年 8 月第 1 卷第 4 期 ChinJBreastDis(ElectronicVersion),August2007,Vol.1,No.4 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究"

苍花
5 years ago
Views:

1 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究 5 氮 2 脱氧胞苷 (5 Aza CdR) 对乳腺癌 MDA MB 435S 细胞增殖及抑癌基因 Maspin 表达的影响方法用特异性甲基转移酶抑制剂 5 Aza CdR 处理乳腺癌细胞株 MDA MB 435S8d 后, 采用四唑盐 (MTT) 比色法观察细胞在药物处理前后的生长活性, 应用流式细胞仪进行细胞周期的检测,RT PCR 检测细胞处理前后 MaspinmRNA 的表达结果 5μmol/L5 Aza CdR 处理乳腺癌细胞株 MDA MB 435S8d 后, 与对照组比较能明显抑制肿瘤细胞的生长流式细胞仪检测发现 5μmol/L5 Aza CdR 作用 72h 后可导致 MDA MB 435S 细胞 G2/M 期阻滞, 减少进入有丝分裂期的细胞百分比 RT PCR 显示 MaspinmRNA 在 5μmol/L5 Aza CdR 作用 72h 后重新表达结论在人乳腺癌 MDA MB 435S 细胞中,Maspin 基因可能因高甲基化而导致转录失活, 经特异性甲基转移酶抑制剂 5 Aza CdR 处理可使 Maspin 基因重新表达, 后者能导致该肿瘤细胞 G2/M 期阻滞, 并抑制细胞生长关键词 Maspin 基因 ; 甲基化 ;5 氮 2 脱氧胞苷 ; 乳腺癌中图法分类号 R737.9 文献标识码 A Efectsof5 Aza CdR oncelproliferationinbreastcancercellinemda MB 435Sandexpresionofmaspingene ZHANG Bo,LIU Ke,CHEN Jian ying, WANGGuo bin.departmentofgeneralsurgery,unionhospital,tongjimedicalcol lege,huazhongscienceandtechnologyuniversity,wuhan430022,china Abstract Objective Toinvestigatetheefectsof5 Aza 2' deoxycytidine (5 Aza CdR)ontheproliferationofMDA MB 435Scelsandexpresionoftumorsup presorgenemaspin.methods HumanbreastcancercellineMDA MB 435Swas treatedwith5μmol/l5 Aza CdR,aspecificdemethylatingagentfor0to8days.The growthofmda MB 435ScelswasobservedbyMTTasaybeforeandafter5 Aza CdR treatment,respectively.theexpresionofmaspinmrna wasobservedbyreverse transcription polymerasechainreaction(rt PCR).ThecelcycleofMDA MB 435S celswasanalyzedbyflowcytometry.results MDA MB 435Scelstreatedwith5 基金项目 : 湖北省十一五重大科技攻关项目 (2006AA301A05) 作者单位 : 武汉, 华中科技大学附属协和医院普外科

2 Aza CdRdisplayedaslowgrowthincomparisonwiththecontrolcels,andtheinhibi tionrateincreasedsharplyfromday5today8(35.42% to71.29%).flowcytome tryshowedthat5μmol/l5 Aza CdR couldinduceg2/m celcyclearestandde creasedthepercentageofmitosiscelnumberinthiscelline.maspinmrnawasex presedinmda MB 435Scelsafter5 Aza CdRtreatment,butitwasweaklydetecta blebeforethetreatment.conclusions Maspingenemightbetranscriptionalsilencing byhypermethylationandthere expresionofmaspingeneby5 Aza CdRcaninhibit theproliferationandinducetheg2/m arestofmda MB 435Sbreastcancercels. Keywords Maspin;DNAmethylation;5 Aza 2 deoxycytidine;breastcarcinoma 乳腺癌的发病率在逐年升高早期诊断和早期治疗是提高无病生存率的关键癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤形成和进展的关键机制抑癌基因失活的主要方式有基因的突变缺失和启动子区域的高甲基化等 [1,2] 5 氮 2 脱氧胞苷 (5 Aza CdR) 是一种 DNA 甲基转移酶的抑制剂它通过去甲基化作用能使多种 CpG 岛过甲基化的抑癌基因重新表达, 而恢复抑癌功能 [3] Maspin 基因是近十年发现的抑癌基因, 对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用 [4] 本研究通过 5 Aza CdR 处理人乳腺癌细胞系 MDA MB 435S, 分析肿瘤细胞的生物学改变, 以探讨乳腺癌治疗的新靶点 1 材料与方法 1.1 细胞培养和药物处理 MDA MB 435S 细胞培养于含 10% 胎牛血清 100U/ml 青霉素 100mg/ml 链霉素的 RPMI1640 培养基 (Gibco 公司 ) 5 Aza CdR(Sigma 公司 ) 配制成 0.25mg/ml (1.1mmol/L) 的储存液, 在培养基中稀释成终浓度为 5μmol/L 的工作液 1.2 MTT 法检测细胞增殖活性以每孔个细胞接种于 96 孔板, 各组设 6 个复孔对照组细胞以常规 RPMI1640 培养, 药物处理组以含有 5μmol/L5 Aza CdR 的 RPMI1640 培养待细胞贴壁后, 每隔 24h 测量 1 次每孔加入质量浓度 5g/L 的 MTT20μl, 置培养箱内温育 4h, 小心吸去培养基, 加入 150μl 二甲基亚砜 (DMSO),37 水平摇床振摇 15min, 待晶体充分溶解后, 置全自动酶标仪于 490nm 波长处读取吸光度 (OD) 细胞增殖能力以平均 OD 值分析, 以 OD 值为纵坐标, 时间 (d) 为横坐标, 绘制生长曲线细胞生长抑制率 % =(1- 实验组平均 OD 值 / 对照组平均 OD 值 ) 100% 以抑制率 % 为纵坐标, 时间 (d) 为横坐标, 绘制抑制率曲线 1.3 细胞周期的检测 5μmol/L5 Aza CdR 处理的细胞及对照组细胞均以个接种于 8 个 60mm 培养皿中, 每 24h 用胰蛋白酶消化分别收集对照组和处理组细胞,PBS 洗涤细胞 2 次,70% 乙醇固定细胞检测前离心弃乙醇, 置于 PI 溶液 ( 含 1.5mg/ml 碘化丙锭,10mg/mlRNaseA)37 避光染色 3h, 以流式细胞仪 (BD 公司 ) 进行细胞周期检测 1.4 RT PCR 检测 Maspin 基因的表达细胞总 RNA 的提取参照 RNAiso 试剂盒 (Takara 公司 ) 操作 10μl 逆转录

3 反应体系含 5mmol/LMgCl 2,1mmol/LdNTPs,10URNase 抑制剂,2.5UAMV 逆转录酶,25pmol 随机引物及样本 RNA 逆转录反应条件 :30 10min,42 30min,95 5min 50μlPCR 反应体系含 1.25UTaq 酶, 特异性上下游引物各 25pmol Maspin 基因 PCR 反应条件 :95 15min;94 1min,59 1min, 72 1min,5 个循环 ; 再将退火温度降至 57 进行 32 个循环扩增产物于 2.5% 琼脂糖凝胶电泳分离目的基因 maspin 及内对照 β actin 的引物由 Primer5.0 软件自行设计, 由 Invitrogen 公司合成引物序列如下 :maspin5 GCTTTTGCCGTTGATCTGTTC 3,5 GATCTGACCTTTCGTTTCTTCCA 3, 产物片段长度 369bp β actin5 CGAAACTACCTTCAACTCCATCA 3,5 CGGACTCGT CATACTCCTGCT 3, 产物片段长度 272bp [5] 1.5 统计学处理多样本均数比较采用单因素方差分析,SPSS10.0 统计软件进行处理,P<0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 5μmol/L5 Aza CdR 处理前后 MDA MB 435S 细胞生长曲线和抑制率曲线图 1 的生长曲线显示 5μmol/L5 Aza CdR 处理后 4d 内, 与对照组比较细胞生长速度无显著性差异 (P>0 05), 而从第 5 天开始 5 Aza CdR 明显抑制了细胞的生长图 2 的细胞抑制率曲线显示第 5~8 天的抑制率分别为 35.42% 47.14% 60.53% 和 71.29%(P<0 05) 图 1 5 Aza CdR 处理乳腺癌 MDA MB 435S 细胞前后的生长曲线图 2 5 Aza CdR 处理乳腺癌 MDA MB 435S 细胞后的生长抑制率曲线

2.2 5 Aza CdR 对 MDA MB 435S 细胞周期的影响 5μmol/L5 Aza CdR 处理 24 32 和 72h 后,MDA MB 435S 细胞处于 G0/G1 期的细胞百分比分别为 53.19% 50.50% 和 51.56%, 对照组为 67.34%; 处于 G2/M 期的细胞百分比分别为 26.32% 36.58% 和 33.72%, 对照组为 21.

4 2.2 5 Aza CdR 对 MDA MB 435S 细胞周期的影响 5μmol/L5 Aza CdR 处理和 72h 后,MDA MB 435S 细胞处于 G0/G1 期的细胞百分比分别为 53.19% 50.50% 和 51.56%, 对照组为 67.34%; 处于 G2/M 期的细胞百分比分别为 26.32% 36.58% 和 33.72%, 对照组为 21.71%, 即细胞周期出现了 G2/M 期的阻滞 ( 图 3) 图 3 5 Aza CdR 处理乳腺癌 MDA MB 435S 细胞 24~72h 后细胞周期变化 2.3 MDA MB 435S 细胞 maspinmrna 的表达 RT PCR 检测结果显示 : 对照组细胞 maspin 基因的 mrna 表达很弱, 而 5μmol/L5 Aza CdR 作用 72h 后 maspin 基因的 mrna 表达明显增强, 即 5 Aza CdR 诱导了 maspin 基因的重新表达 ;β actin 的表达水平在 5 Aza CdR 作用前后无显著改变 ( 图 4) M: 标记条带 ;a: 对照 ;b:5 Aza CdR 图 4 5 Aza CdR 处理乳腺癌 MDA MB 435S 细胞 72h 后 Maspin 基因的表达 3 讨论乳腺癌和其他恶性肿瘤一样, 其发生和发展是一个多基因多步骤的过程恶性肿瘤的生物学特征主要表现为浸润性生长和转移, 其发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生了异常改变, 即由遗传基因缺陷以及表观遗传改变而引起的 [6,7] 表观遗传通过 DNA 自身化学修饰方式从转录水平影响基因表达, 但不存在 DNA 序列改变的遗传改变 DNA 甲基化是表观遗传修饰的重要方面, 这种

5 修饰反应主要发生在 CpG 二核苷酸的胞嘧啶 CpG 岛是以非甲基化形式存在的, 而启动子非甲基化状态是相关基因特别是肿瘤抑制基因转录的先决条件, 当这些启动子区域的 CpG 岛被异常甲基化或发生了新的甲基化时, 可导致稳定遗传基因的转录沉默 [8,9] 因此,DNA 甲基化在基因表达调控细胞增殖分化发育和基因组印迹等方面起着重要的作用幸运的是, 这种异常的甲基化可以通过 DNA 甲基转移酶抑制剂 (5 Aza CdR) 来逆转 Maspin 基因是一种丝氨酸家族蛋白酶抑制剂它可以抑制乳腺癌细胞的迁徙侵犯和转移, 被认为是抑癌基因在乳腺癌患者中 maspin 基因常常表达缺失, 并表现为肿瘤细胞侵袭能力增强和转移扩散, 同时研究发现该基因的表达缺失与基因重排和丢失无关, 而与该基因启动子区域异常甲基化有关 [10-12] 本研究结果显示 : 人乳腺癌细胞系 MDA MB 435S 中 maspin 基因 mrna 的表达非常微弱, 而经过 5 Aza CdR 处理后的细胞 maspin 基因 mrna 的表达显著增强, 提示在乳腺癌细胞中 maspin 的表达减弱可能是由于启动子区域的 CpG 岛高甲基化所致 5 Aza CdR 是一种脱氧胞苷类似物, 在 DNA 复制过程中与 DNA 分子相结合, 并与 DNA 甲基转移酶 1(DNMT1) 形成共价复合物, 抑制该酶的甲基转移活性, 生成低甲基化子链, 从而实现去甲基化功能本研究发现,MDA MB 435S 细胞经 5 Aza CdR 处理后细胞的增殖明显受到抑制, 其抑制率自第 5 天后从 35.42% 增至 71.29%, 说明 5 Aza CdR 有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用由于 5 Aza CdR 可通过去甲基化作用使一些因启动子区域高甲基化沉默的基因重新表达, 使一些肿瘤抑制基因的功能得以恢复, 因此本研究检测了一些乳腺癌相关肿瘤抑制基因结果显示只有 maspin 基因 mrna 的表达在药物作用前后差异明显, 说明 5 Aza CdR 抑制 MDA MB 435S 细胞的增殖作用与 maspin 基因的功能恢复密切相关 MDA MB 435S 细胞是一种转移性乳腺癌建立的细胞系其恶性程度相当高, 细胞形态已失去上皮细胞特征如果能有效的控制该细胞的生长, 对于研究乳腺癌转移的机制控制乳腺癌的转移具有重要意义 Maspin 基因的功能失活与启动子区域高甲基化相关, 而 5 Aza CdR 可以逆转高甲基化状态并恢复该基因的功能, 这将为转移性乳腺癌提供新的生物学标志和治疗的靶点值得讨论的是,maspin 基因的作用机制是否与其他癌基因和 / 或抑癌基因存在相互作用关系还不十分清楚, 有待于进一步研究 [13,14] 总之, 抑癌基因启动子 DNA 高甲基化沉默是其功能失活的表观遗传机制 DNA 甲基转移酶抑制剂 5 Aza CdR 能够有效的逆转 DNA 高甲基化沉默的抑癌基因重新表达这为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的途径 [15] 参考文献 [1] WeinbergRA.Oncogenesandtumorsuppresorgenes.CACancerJClin,1994,44:

6 [2] GranderD.Howdomutatedoncogenesandtumorsuppresorgenescausecancer?MedOncol,1998,15: [3] SzyfM,PakneshanP,RabbaniSA.DNAmethylationandbreastcancer.BiochemPharmacol,2004,68: [4] LocketJ,YinS,LiX,etal.Tumorsuppresivemaspinandepithelialhomeostasis.JCelBiochem,2006,97: [5] MercataliL,ValentiV,CalistriD,etal.RT PCRdeterminationofmaspinandmammaglobinBinperipheralbloodofhealthy donorsandbreastcancerpatients.annoncol,2006,17: [6] OsborneC,WilsonP,TripathyD.Oncogenesandtumorsuppresorgenesinbreastcancer:potentialdiagnosticandtherapeutic applications.oncologist,2004,9: [7] OliveiraAM,RosJS,FletcherJA.Tumorsuppresorgenesinbreastcancer:thegatekeepersandthecaretakers.AmJClin Patho,2005,124:S16-S28. [8] MunotK,BelSM,LaneS,etal.Paternofexpresionofgeneslinkedtoepigeneticsilencinginhumanbreastcancer.Hum Pathol,2006,37: [9] DulaimiE,HilinckJ,IbanezdeCaceresI,etal.Tumorsuppresorgenepromoterhypermethylationinserumofbreastcancer patients.clincancerres,2004,10: [10] ShengS.Aroleofnovelserpinmaspinintumorprogresion:thedivergencerevealedthroughefortstoconverge.JCelPhysiol, 2006,209: [11] ChenEI,YatesJR.Maspinandtumormetastasis.IUBMBLife,2006,58: [12] BaileyCM,KhalkhaliElisZ,SeftorEA,etal.Biologicalfunctionsofmaspin.JCelPhysiol,2006,209: [13] DokrasA,CofinJ,FieldL,etal.Epigeneticregulationofmaspinexpresioninthehumanplacenta.MolHumReprod,2006, 12: [14] HeranzM,EstelerM.DNAmethylationandhistonemodificationsinpatientswithcancer:potentialprognosticandtherapeutic targets.methodsmolbiol,2007,361: [15] DoleL,DepypereH T,BrackeM E.Anti invasive/anti metastasisstrategies:newroads,newtoolsandnewhopes.cur CancerDrugTargets,2006,6: ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 罗承丽 )

中华乳腺病杂志 ( 电子版 )2007 年 8 月第 1 卷第 4 期 ChinJBreastDis(ElectronicVersion),August2007,Vol.1,No.4 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响 张波刘科陈剑英王国斌 实验研究 摘要 目的研究

中华乳腺病杂志 ( 电子版 )2007 年 8 月第 1 卷第 4 期 ChinJBreastDis(ElectronicVersion),August2007,Vol.1,No.4 5 Aza CdR 对乳腺癌细胞增殖及 Maspin 基因表达的影响张波刘科陈剑英王国斌实验研究摘要目的研究