207,37(7) 徐安健等 :PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制 3.2 细胞培养转染在六孔板中每孔接种个 /ml 细胞, 并在 37 5% 二氧化碳培养箱中培养 8~24h, 使细胞达到对数生长期, 达到 70% ~80% 的细胞密度将 6 孔板内的含 0% 胎牛血清的

Size: px

Start display at page:

Download "207,37(7) 徐安健等 :PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制 3.2 细胞培养转染在六孔板中每孔接种个 /ml 细胞, 并在 37 5% 二氧化碳培养箱中培养 8~24h, 使细胞达到对数生长期, 达到 70% ~80% 的细胞密度将 6 孔板内的含 0% 胎牛血清的"

遂秉贺
5 years ago
Views:

1 殏檪檪殏研究报告檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪中国生物工程杂志殏殏 ChinaBiotechnology,207,37(7):2 7 DOI: /j.cb PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制徐安健李艳萌李斯文 2 乌姗娜 ( 首都医科大学附属北京友谊医院科研实验中心北京首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心北京 00875) 张蓓黄坚摘要目的 : 在肺癌细胞中沉默 PHP4, 并研究其对肺癌细胞凋亡的影响及其可能机制方法 : 利用 shrna 稳定沉默肺癌细胞株 A549 中 PHP4 的表达, 并利用 AnnexinV PI 双染和流式细胞仪检测细胞在正常培养条件下和凋亡诱导条件下的凋亡情况 ; 通过皮下接种裸鼠, 探讨 PHP4 沉默对肺癌细胞体内成瘤的影响, 并利用 Realtime PCR 和 Westernbloting 检测 PHP4 沉默后凋亡相关基因的表达情况结果 : 成功获得了 PHP4 稳定沉默的肺癌细胞株, 发现 PHP4 沉默可促进肺癌细胞诱导性凋亡, 并抑制肺癌细胞的体内成瘤能力, 并且发现 PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响可能是通过抑制 Bcl 2 表达实现的结论 :PHP4 沉默可促进肺癌细胞诱导性凋亡, 并可能通过抑制 Bcl 2 影响肺癌细胞凋亡关键词 PHP4 细胞凋亡体内成瘤 Bcl 2 中图分类号 Q89 人组氨酸磷酸酶蛋白 PHP4( 也称为 PHPT) 是在脊椎动物中发现的第一个蛋白组氨酸磷酸酶 [ 2] 除 [3] 了 PHP4 的诸多底物如 ATP 循环裂解酶和 G 蛋白 [4] 的 β 亚基被发现外, 还发现其可能与多种分子如 HSP90α 相互作用 [5], 进而可能介导信号转导, 参与疾病如肿瘤的发生和发展我们前期的研究发现, 在肺癌细胞中干预 PHP4 表达, 可以影响肺癌细胞的运动浸润, 甚至体内转移 [6 8] 并且相对于癌旁组织,PHP4 在肺癌组织中高表达, 表明 PHP4 不仅参与了肺癌细胞的运动和转移, 可能还与肺癌成瘤相关 [9] 此外, 我们还发现, 在正常细胞 NIH3T3 细胞中过表达 PHP4 后能赋予 NIH3T3 细胞体外非锚定依赖性生长能力, 表明 PHP4 具有将正常细胞恶性转化的能力 [0] 但 PHP4 在体内是否会影响肿瘤细胞的成瘤能力, 其还影响了肿瘤细胞的哪些细胞特性, 从而在肿瘤中发挥作用, 还有待深入地探讨收稿日期 : 修回日期 : 北京优秀人才培养项目 ( G227) 北京友谊医院院启动项目 (yyqdkt2056) 资助项目电子信箱 :xuanjian98@sina.com 因此, 本文首先在肺癌细胞 A549 中沉默了 PHP4 的表达, 并探讨了其对肺癌细胞凋亡的影响此外, 我们还进一步通过小鼠体内成瘤实验, 检测了 PHP4 沉默对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响, 以及其影响肺癌细胞凋亡的可能机制材料与方法. 细胞试剂和材料 A549 H446 细胞为本实验室保存 ; 包含 PHP4 sirna 序列 CGGACATCTACGACAAAGT 的 shrna PHP4 载体构建如文献 [6] 所述 ;4~6 周龄雌性裸鼠购自维通利华公司 ;Lipofectamine2000 Transfection Reagent 购自 Invitrogen 公司 ; 嘌呤霉素购自 Sigma 公司 ;AnnexinV 凋亡检测试剂盒购自 Abcam 公司 ; 兔抗 Cleaved Caspase 3 单克隆抗体兔抗 Bcl 2 单克隆抗体兔抗 P53 抗体均购自 CelSignalingTechnology 公司 ; 小鼠抗 PHP4 抗体和小鼠抗 GAPDH 单克隆抗体购自 SantaCruz 公司 ; 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠山羊抗兔 IgG 购自北京中杉金桥有限公司其他试剂均为国产分析纯

2 207,37(7) 徐安健等 :PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制 3.2 细胞培养转染在六孔板中每孔接种个 /ml 细胞, 并在 37 5% 二氧化碳培养箱中培养 8~24h, 使细胞达到对数生长期, 达到 70% ~80% 的细胞密度将 6 孔板内的含 0% 胎牛血清的 DMEM 培养基更换为无血清 DMEM 培养基, 并分别将 4μg 已测序验证的 shrna PHP4 表达载体用 Lipofectamine2000 真核转染试剂转染, 然后继续培养 4~6h 在将细胞培养液换成新的含 0% 胎牛血清的 DMEM 培养基后, 放入二氧化碳培养箱中培养 24h 加入 G48 筛选 2 周, 获得稳定克隆.3 AnnexinV 和 PI 双染及流式细胞仪检测细胞凋亡用 0.25% 不含乙二胺四乙酸 (EDTA) 的胰蛋白酶溶液消化细胞, 制成单细胞悬液后移入.5ml 离心管中,2000r/min 离心 5min; 加入 PBS 洗涤细胞沉淀两次, 收集 ~5 0 5 个细胞 ; 加入 500μl 的 Binding bufer 重悬细胞 ; 加入 5μlAnnexinV FITC 混匀, 然后加入 5μlPI, 混匀 ; 室温, 避光反应 5min;h 内进行流式细胞仪检测, 激发波长 488nm, 发射波长 530nm.4 小鼠皮下肿瘤模型将个肿瘤细胞皮下接种到裸鼠的腋下区域 ( 每组 5 只小鼠 ) 然后每 3~5 天测量皮下肿瘤大小, 并计算体积所有动物实验都在动物护理和使用委员会的批准下进行.5 实时荧光定量 PCR(qRT PCR) 根据基因的开放阅读框 (ORF) 序列设计实时荧光定量 PCR 引物,PHP4 上游为 5 TCAGTAGCCGTCGTT AGCC 3, 下游为 5 TGCGACTGTGAGTGTCTGGG 3 ; Bcl 2 上游为 5 GAGGATTGTGGCCTTCTTTG 3, 下游为 5 CCCAGCCTCCGTTATCCT 3 ;GAPDH 内参基因上游引物为 5 GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3, 下游为 5 GACAAGCTTCCCGTTCTCAG 3 用 Trizol 试剂提取各组细胞总 RNA 并反转录成单链 cdna, 以此为模板, 运用 UltraSYBRTwoStepRT qpcrkit 试剂盒进行扩增反应, 利用 2 ΔΔCT 法计算目的基因的相对表达量.6 Westernbloting 收集不同细胞系总蛋白质, 分别取 20~50μg 蛋白质量的细胞总蛋白质样品及蛋白质分子质量 Marker, 将处理好的样品按照预定的顺序加入上样孔中接通凝胶电泳仪的电源, 初始电压 60V; 溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至 60V, 继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘第一抗体封闭 4 振摇过夜 ; 用含 0.% Tween 的 Tris HCl 缓冲盐溶液 (TBST) 洗膜, 第二抗体封闭室温下振摇 60min; 以 TBST 洗膜化学发光与曝光.7 统计学分析实验数据用 x±s 表示, 组间差异采用方差分析, 应用 SPSS7.0 统计软件进行处理 2 结果 2. PHP4 沉默肺癌细胞株的构建为了探讨 PHP4 对肺癌细胞的影响, 我们首先构建了包含 PHP4shRNA 的表达载体, 并稳定转染到肺癌细胞株 A549 中如图所示, 在 A549 中转染 PHP4shRNA 后, 相对于对照细胞,PHP4 的 mrna 和蛋白质水平都显著降低图 PHP4 沉默肺癌细胞株 A549 的构建 Fig. TheconstructionofPHP4 RNAilungcancercels (a)expresionofphp4ina549celsstablyexpresingcontrol RNAiorPHP4 RNAiasdeterminedbyquantitativePCR (b) ExpresionofPHP4inA549celsstablyexpresingcontrol RNAior PHP4 RNAiasdeterminedbyWesternbloting 2.2 PHP4 沉默可促进肺癌细胞诱导性凋亡接下来, 我们通过 AnnexinV FITC 和 PI 双染标记, 经流式细胞仪, 分析了 PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响结果发现 PHP4 并不能直接导致肺癌细胞凋亡然而, 当我们用双氧水 (H ) 诱导肺癌细胞 A549 凋亡时, 发现更多的 PHP4 沉默细胞发生了凋亡 ( 图 2) 表明 PHP4 沉默使肺癌细胞对诱导性凋亡更敏感了

3 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No.7207 图 2 PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响 Fig.2 TheefectofPHP4knockdownonapoptosisoflungcanercels (a)theflowcytometryanalysisofphp4knockdownonapoptosisoflungcanercels (b)thestatisticalanalysisresultsofphp4knockdownon apoptosisoflungcanercels 2.3 PHP4 沉默可抑制肺癌细胞的体内成瘤能力肿瘤细胞在体内的生长与体外培养不同, 在体内, 肿瘤细胞受到体内环境 ( 如各种免疫细胞生长因子凋亡因子等 ) 影响, 会表现出与体外培养不一样的生长特性我们发现, 虽然沉默 PHP4 后, 不能影响 A549 细胞的体外增殖能力, 但显著抑制了 A549 细胞的体内成瘤能力 ( 图 3), 推测可能受体内促凋亡因子作用,PHP4 沉默的肺癌细胞凋亡增多, 导致了其体内成瘤能力降低 2.4 PHP4 沉默影响肺癌细胞凋亡的可能机制为了进一步研究 PHP4 调控肺癌细胞凋亡的可能机制, 我们通过定量 PCR 和 Westernbloting 检测了 PHP4 沉默后 A549 细胞中 Bcl 2 的表达, 以及

4 207,37(7) 徐安健等 :PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制 5 图 3 PHP4 沉默对 A549 体内成瘤能力的影响 Fig.3 KnockdownofPHP4expresioninA549celsinhibitedthexenografttumorgrowthinvivo (a)volumesoftumorsthatwerederivedfromcontrol RNAi(closedcircle)orPHP4 RNAi(closedsquare)celsweremeasuredovertimes (b) Xenografttumorsderivedfromcontrol RNAiorPHP4 RNAion26days (c)expresionofphp4mrnawasexaminedbysemi quantitativepcr oftumorscelsfromxenografttumors Caspase 3 的表达情况结果发现, 在 A549 中沉默 PHP4 后, 显著降低了 Bcl 2 的表达, 但直接导致细胞凋亡的 Caspase 3 的表达没有改变, 这与我们流式细胞仪的检测结果符合, 表明 PHP4 沉默并不能导致 A549 细胞直接凋亡, 但降低了细胞抗凋亡的能力在另一种 P53 缺失的肺癌细胞 H299 中, 我们也得到了同样的结果图 4 PHP4 沉默对凋亡相关基因表达的影响 Fig.4 TheefectofPHP4knockdownontheexpresionofapoptosisrelatedgenes (a)theefectofphp4knockdownontheexpresionofapoptosisrelatedgenesina549 (b)theefectofphp4knockdownontheexpresion ofapoptosisrelatedgenesinh299

5 6 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 讨论凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程 [] 凋亡是多基因严格控制的过程, 这些基因在种属之间非常保守, 如 Bcl 2 家族 Caspase 家族癌基因 ( 如 C myc) 抑癌基因 (P53) 等凋亡过程的紊乱可能与许多疾病, 如肿瘤自身免疫性疾病等的发生有直接或间接的关系许多因素都能诱发细胞凋亡, 如射线药物等 [2 4] 本研究发现, 在肺癌肿瘤细胞 A549 中沉默 PHP4 后, 在诱发细胞凋亡的因素双氧水存在的情况下, 可促进肺癌肿瘤细胞凋亡进一步的机制研究发现,PHP4 沉默可降低肺癌肿瘤细胞中凋亡相关基因 Bcl 2 的表达体内成瘤实验也进一步证实,PHP4 沉默对肿瘤的抑制作用, 显示出降低的体内成瘤能力, 推测 PHP4 沉默可能通过促进肿瘤细胞在体内的凋亡, 从而抑制肿瘤在体内的生长我们以往的研究发现,PHP4 是一个可以促进肺癌细胞运动浸润转移的蛋白质, 并且其还能赋予 NIH3T3 细胞体外非锚定依赖性生长能力, 表明 PHP4 具有将正常细胞恶性转化的能力 [6 0] 通过本文研究, 我们更进一步证实了 PHP4 在肺癌肿瘤发生中的重要作用, 即参与了肺癌肿瘤细胞的体内生长成瘤, 这拓宽了 PHP4 在肿瘤中的重要作用, 也为我们将 PHP4 作为肿瘤抑制或者治疗靶点提供了实验依据参考文献 [] PiaE K,PetersonG,BoE K,etal.Identificationand characterization of a mammalian 4 kda phosphohistidine phosphatase.eurjbiochem,2002,269(20): [2] KlumppS,HermesmeierJ,SelkeD,etal.Proteinhistidine phosphatase:anovelenzymewithpotencyforneuronalsignaling. JCerebBloodFlowMetab,2002,22(2): [3]KlumppS,BechmannG,MaurerA,etal.ATP citratelyaseasa substrateofproteinhistidinephosphataseinvertebrates.biochem BiophysResCommun,2003,306():0 5. [4] MaurerA,WielandT,MeislF,etal.Theb subunitofg proteinsisasubstrateofproteinhistidinephosphatase.biochem BiophysResCommun,2005,334(4):5 20. [5] 徐安健, 蒋单懿, 黄凌云, 等. 人组氨酸磷酸酶 PHP4 的原核表达及其与 Hsp90 的体外互作研究. 中国生物工程杂志, 200,30(7):7. XuAJ,JiangSY,HuangLY,etal.Prokaryoticexpresion, purificationofhuman4 kdaphosphohistidinephosphataseandits interactionwithhsp90invitro.chinabiotechnology,200,30 (7):7. [6] XuA J,HaoJ,ZhangZ,etal.4 kdaphosphohistidine phosphataseand itsrolein human lungcancercel. Lung Cancer,200,67(): [7] Xu A, LiX, LiS, etal. A novelrole for4 kda phosphohistidinephosphatasein lamelipodiaformation. Cel AdhMigr,206,7: 8. [8] Xu A, Li X, Wu S, et al. Knockdown of4 kda phosphohistidinephosphataseexpresionsuppreseslungcancer celgrowthinvivoposiblythroughknockdownofnf kappab signalingpathway.neoplasma,206,63(4): [9]XuAJ,XiaXH,GuJC,etal.ClinicalsignificanceofPHPT inlungcancer.chinesemedicaljournal,200,23(22): [0] 徐安健, 崔永, 赵高潮, 等. 人组氨酸磷酸酶蛋白 PHP4 的过表达及其对 NIH 3T3 细胞体外增殖和非锚定依赖性生长的影响. 中国生物工程杂志,203,33(6):7. XuAJ,CuiY,ZhaoGC,etal.TheoverexpresionofPHP4 anditsefectonnih 3T3celsproliferationinvitroandAnchor IndependentGrowth.ChinaBiotechnology,203,33(6):7. []LiuG,PeiF,YangF,etal.Roleofautophagyandapoptosisin non smal cellungcancer.intjmolsci,207,8(2):367. [2]VasilikosL,SpilgiesLM,KnopJ,etal.Regulatingthebalance betweennecroptosis,apoptosisandinflammationbyinhibitorsof apoptosisproteins.immunolcelbiol,207,95: [3]ZhengJH,ViacavaFolisA,KriwackiRW,etal.Discoveries andcontroversiesinbcl 2protein mediatedapoptosis.febsj. 206,83(4): [4]BeesooR,Neergheen BhujunV,BhagooliR,etal.Apoptosis inducinglead compoundsisolated from marine organismsof potentialrelevanceincancertreatment.mutatres,204,768:

6 207,37(7) 徐安健等 :PHP4 沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制 7 TheEfectofPHP4KnockdownonLungCancerCels ApoptosisandItsMechanism XUAn jian LIYan meng LISi wen WUShan na 2 ZHANGBei HUANGJian (ExperimentalCenter,BeijingFriendshipHospital,Beijing 00875,China) (2ClinicalLaboratoryCenter,BeijingFriendshipHospital,Beijing 00875,China) Abstract Objective:ToknockdownPHP4expresioninlungcancercels,andinvestigatetheefectof PHP4knockdownonlungcancercelsapoptosisanditsmechanism.Methods:UsingshRNAstablyknockdown PHP4expresioninlungcancercelA549;detectedapoptosisofcontrolcelsandPHP4RNAicelsunder normalcultureandapoptosis inducedtreatmentusingdoublestainingofannexinvandpibyflowcytometry; investigatedthetumorgrowthofcontrolcelsandphp4rnaicelsinvivo,anddetectedtheexpresionof apoptosisrelatedgenesbyrealtime PCRandWesternbloting.Results:TheexpresionofPHP4wasstably knockdownsuccesfuly,andknockdownofphp4couldpromoteinduced apoptosis,aswelasthetumorgrowth invivo;furthermore,theefectofphp4 knockdown on lungcancercelsapoptosisposoblyviabcl 2 suppresionwasfound.conclusion:knockdownofphp4couldpromoteinduced apoptosisposoblyviabcl 2 suppresion. Keywords PHPT Apoptosis Tumorgrowthinvivo Bcl 2

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽