去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶

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1 第 一 节 细 胞 培 养 的 相 关 技 术 1 细 胞 的 复 苏 概 述 复 苏 细 胞 要 求 快 速 融 化 的 手 段, 这 样 可 以 保 证 细 胞 外 结 晶 在 很 短 的 时 间 内 即 融 化 避 免 由 于 缓 慢 融 化 使 水 分 渗 入 细 胞 内 形 成 胞 内 再 结 晶 对 细 胞 造 成 损 害 用 品 培 养 液 吸 管 离 心 管 培 养 瓶 步 骤 [1] 打 开 水 浴 锅, 将 温 度 调 至 37 ; [2] 从 液 氮 中 取 出 冻 存 的 细 胞 株, 用 镊 子 夹 住 冻 存 管 ( 戴 防 护 面 罩 ), 迅 速 置 入 37 的 水 浴 锅 中, 不 断 振 摇 冻 存 管, 使 之 尽 快 融 化, 要 在 1-2 min 内 完 成 复 温 ; [3] 完 全 融 化 后, 取 出 冻 存 管, 移 至 超 净 工 作 台, 用 75% 酒 精 擦 洗 消 毒, 用 无 菌 吸 管 吸 取 细 胞 悬 液 移 至 无 菌 离 心 管, 加 10 倍 的 含 10% 胎 牛 血 清 的 培 养 液, 用 吸 管 轻 轻 吹 匀 ; [4] 细 胞 悬 液 离 心,1000rpm,5-8min, 小 心 弃 上 清 液 加 入 适 量 含 10% 胎 牛 血 清 的 培 养 液, 接 种 于 培 养 瓶 中, 置 于 37 5% CO 2 饱 和 湿 度 孵 箱 中 培 养 ; [5] 次 日 更 换 培 养 基, 以 后 按 常 规 培 养 方 法 进 行 培 养 如 果 复 苏 时 细 胞 密 度 较 高 及 时 传 代 细 胞 复 苏 时 细 胞 密 度 以 个 /ml 2 细 胞 的 传 代 概 述 培 养 细 胞 传 代 根 据 不 同 的 细 胞 采 取 不 同 的 方 法 贴 壁 生 长 的 细 胞 用 消 化 法 传 代 ; 部 分 贴 壁 生 长 但 粘 附 不 牢 固 的 细 胞 也 可 以 用 直 接 吹 打 传 代 ; 悬 浮 生 长 的 细 胞 可 以 采 用 直 接 吹 打 或 离 心 沉 淀 后 再 分 离 传 代, 或 直 接 用 自 然 沉 降 法 吸 除 上 清 后, 再 吹 打 传 代 用 品 PBS( 或 Hanks 液 ) 0.25% 胰 蛋 白 酶 ( 或 含 EDTA) 培 养 液 吸 管 培 养 瓶 步 骤 贴 壁 细 胞 消 化 传 代 法 : [1] 用 无 菌 吸 管 吸 弃 瓶 内 旧 的 培 养 基 ; [2] 用 PBS 洗 二 遍, 以 防 止 残 留 培 养 液 中 的 血 清 对 胰 蛋 白 酶 的 抑 制 作 用, 向 瓶 内 加 入 ml 胰 蛋 白 酶 ( 以 25cm 2 ), 轻 轻 摇 动 培 养 瓶, 使 胰 蛋 白 酶 流 遍 所 有 的 细 胞 表 面 ; 加 入 的 消 化 液 适 量, 因 为 消 化 液 过 多 对 细 胞 有 损 伤, 同 时 也 需 要 较 多 的 含 血 清 培 养 液

2 去 中 和 ; [3] 消 化 最 好 在 37 培 养 箱 或 室 温 25 以 上 的 环 境 下 进 行 消 化, 消 化 2--5 min 后, 把 培 养 瓶 放 在 显 微 镜 下 观 察, 发 现 胞 质 回 缩 细 胞 间 隙 增 大, 细 胞 变 圆 后, 立 即 将 培 养 瓶 立 起 并 加 入 少 许 含 血 清 的 培 养 液, 终 止 消 化 ; [4] 用 无 菌 吸 管 反 复 吹 打 瓶 壁 细 胞, 吹 打 过 程 按 顺 序 进 行, 从 培 养 瓶 底 部 一 边 开 始 到 另 一 边 结 束, 以 确 保 所 有 底 部 都 被 吹 打 到 ; 吹 打 过 程 中 动 作 要 轻 柔, 尽 可 能 不 要 出 现 泡 沫, 这 些 都 损 伤 细 胞 ; [5] 加 入 新 鲜 含 10% 胎 牛 血 清 的 培 养 液, 然 后 将 原 培 养 瓶 中 的 细 胞 悬 液 吸 出, 分 别 接 种 在 新 的 培 养 瓶 中 悬 浮 细 胞 的 传 代 : 因 为 悬 浮 生 长 细 胞 不 贴 壁, 故 传 代 时 不 用 采 用 消 化 法, 可 直 接 传 代 或 离 心 收 集 细 胞 后 传 代 直 接 传 代 即 让 悬 浮 细 胞 慢 慢 沉 淀 在 瓶 底 后, 将 上 清 洗 掉 1/2 2/3, 然 后 用 吸 管 吹 打 形 成 细 胞 悬 液 后, 再 传 代 悬 浮 细 胞 多 采 用 离 心 方 法 传 代, 即 将 细 胞 连 同 培 养 液 一 并 转 移 到 离 心 管 内, 离 心 r/min,5min, 然 后 去 除 上 清, 加 新 的 培 养 液 到 离 心 管 内, 用 吸 管 吹 打 使 之 形 成 细 胞 悬 液, 然 后 传 代 接 种 部 分 贴 壁 生 长 的 细 胞, 不 经 消 化 处 理 直 接 吹 打 也 可 使 细 胞 从 壁 上 脱 落 下 来, 而 进 行 传 代 但 这 种 方 法 仅 限 于 部 分 贴 壁 不 牢 的 细 胞, 如 Hela 细 胞 等 直 接 吹 打 对 细 胞 损 伤 较 大, 导 致 较 大 数 量 的 细 胞 丢 失, 因 此 绝 大 部 分 贴 壁 生 长 的 细 胞 均 需 消 化 后, 才 能 吹 打 传 代 3 细 胞 的 冻 存 概 述 冻 存 细 胞 时 要 缓 慢 冷 冻 因 为 细 胞 在 不 加 任 何 保 护 剂 的 情 况 下 直 接 冷 冻 时, 细 胞 内 外 的 水 分 都 会 很 快 形 成 冰 晶, 冰 晶 的 形 成 将 引 起 一 系 列 的 不 良 反 应 首 先 细 胞 脱 水 使 局 部 电 解 质 浓 度 增 高,pH 值 改 变, 部 分 蛋 白 质 由 于 上 述 因 素 而 变 性, 引 起 细 胞 内 部 空 间 结 构 紊 乱, 细 胞 内 冰 晶 的 形 成 和 细 胞 膜 系 统 上 蛋 白 质 酶 的 变 性, 引 起 溶 酶 体 膜 的 损 伤 使 溶 解 酶 释 放 造 成 细 胞 内 结 构 成 分 的 破 坏, 线 粒 体 肿 胀 功 能 丧 失 并 造 成 细 胞 能 力 代 谢 的 障 碍 胞 膜 上 的 类 脂 蛋 白 复 合 体 在 冷 冻 中 易 发 生 破 坏 引 起 胞 膜 通 透 性 的 改 变 使 细 胞 内 容 物 丧 失 细 胞 核 内 DNA 也 是 冷 冻 时 细 胞 易 受 损 部 分 如 细 胞 内 冰 晶 形 成 较 多, 随 冷 冻 温 度 的 降 低, 冰 晶 体 积 膨 胀 造 成 DNA 的 空 间 构 型 发 生 不 可 逆 的 损 伤 性 变 化, 而 引 起 细 胞 的 死 亡 在 细 胞 冻 存 时 要 尽 可 能 的 均 匀 地 减 少 细 胞 内 水 分, 减 少 细 胞 内 冰 晶 的 形 成 是 减 少 细 胞 损 伤 的 关 键 目 前 多 采 用 甘 油 或 者 二 甲 基 亚 砜 作 为 保 护 剂 这 两 种 物 质 在 深 低 温 冷 冻 后 对 细 胞 无 明 显 毒 性, 分 子 量 小, 溶 解 度 大, 易 穿 透 细 胞, 可 以 使 冰 点 下 降, 提 高 细 胞 膜 对 水 的 通 透

3 性 ; 加 上 缓 慢 冷 冻 方 法 可 使 细 胞 内 的 水 分 渗 出 细 胞 外, 在 胞 外 形 成 冰 晶, 减 少 细 胞 内 冰 晶 的 形 成, 从 而 减 少 由 于 冰 晶 形 成 造 成 的 细 胞 损 伤 用 品 胰 酶 含 血 清 培 养 基 DMSO( 分 析 纯 ) 或 无 色 新 鲜 甘 油 (667.83kPa 蒸 汽 高 压 消 毒 ) 吸 管 离 心 管 冻 存 管 步 骤 [1] 用 无 菌 吸 管 吸 弃 瓶 内 旧 的 培 养 基 ; [2] 加 入 少 量 PBS 冲 洗 二 遍, 用 胰 蛋 白 酶 把 单 层 细 胞 消 化 下 来, 依 据 传 代 的 方 法 把 细 胞 悬 液 收 集 于 离 心 管 中, 离 心 1000 rpm,5-8 min; [3] 小 心 弃 上 清 液, 加 入 配 置 好 的 冻 存 培 养 液, 用 吸 管 轻 轻 吹 打 使 细 胞 均 匀, 然 后 将 含 有 细 胞 的 冻 存 液 转 移 到 无 菌 的 冻 存 管 中, 每 个 冻 存 管 加 液 ml, 细 胞 最 终 密 度 为 (5 10) 10 6 /ml; [4] 冻 存 管 封 口, 做 好 标 记, 按 照 以 下 程 序 冻 存 :4,15min--20 min,-20 30min--40 min, 见 细 胞 悬 液 结 冻 后, 放 入 -80 冰 箱 3h 或 过 夜, 之 后 置 于 液 氮 中 注 意 事 项 [1] 从 增 殖 期 到 形 成 致 密 的 单 层 细 胞 以 前 的 培 养 细 胞 都 可 以 用 于 冻 存, 但 最 好 选 择 对 数 生 长 期 细 胞, 已 经 长 满 的 细 胞 冻 存 复 苏 后 生 存 率 很 低 在 冻 存 前 一 天 最 好 换 1 次 培 养 液 [2] 将 标 记 好 并 装 入 冻 存 管 的 支 架, 从 液 氮 容 器 口 缓 缓 放 入, 按 1 / min 的 降 温 速 度, 在 30-40min 时 间 内 使 其 到 达 液 氮 表 面 再 停 30min 后, 直 接 投 入 液 氮 中 [3] 细 胞 在 首 次 冻 存 后 要 在 短 期 内 复 苏 1 次, 观 察 细 胞 对 冻 存 的 适 应 性 4 细 胞 的 计 数 概 述 细 胞 计 数 法 是 细 胞 培 养 研 究 中 的 一 项 基 本 技 术, 它 是 了 解 培 养 细 胞 生 长 状 态, 测 定 培 养 基 血 清 药 物 等 物 质 生 物 学 作 用 的 重 要 手 段 常 用 的 细 胞 技 术 有 血 球 计 数 板 计 数 法 和 电 子 细 胞 计 数 仪 计 数 法 用 品 血 球 计 数 板 吸 管 胰 酶 培 养 液 显 微 镜 步 骤 [1] 准 备 计 数 板 : 用 无 水 乙 醇 或 95% 乙 醇 清 洁 计 数 板 和 盖 玻 片, 待 干 燥 后, 把 盖 玻 片 覆 在

4 计 数 板 上 面, 使 之 微 微 移 向 一 侧, 露 出 计 数 板 台 面 少 许 ; [2] 用 移 液 枪 在 计 数 板 上 盖 玻 片 的 一 侧 加 微 量 细 胞 悬 液, 加 样 时 不 要 溢 出 盖 玻 片 也 不 能 溢 入 两 侧 的 玻 璃 槽 内, 如 果 产 生 上 述 情 况 需 对 计 数 板 冲 洗 和 拭 干 后 重 新 加 样, 加 样 量 也 不 要 过 少 或 带 气 泡 ; [3] 在 显 微 镜 下, 用 10 物 镜 观 察, 可 见 细 胞 均 匀 分 散 计 数 板 各 处 计 算 四 角 大 方 格 内 注 意 事 项 的 细 胞 数, 压 中 线 者 只 计 算 左 线 和 上 线 者, 右 线 和 下 线 不 计 算 在 内 ( 即 仅 计 算 压 两 个 边 的 细 胞 ), 成 团 细 胞 按 单 个 细 胞 计 算 按 照 下 面 公 式 计 算 细 胞 密 度 : ( 细 胞 悬 液 的 细 胞 数 )/ml=( 四 个 大 格 子 细 胞 数 /4) 稀 释 倍 数 10 4 [1] 消 化 单 层 细 胞 时, 务 求 细 胞 分 散 良 好, 制 成 单 细 胞 悬 液 否 则 会 影 响 细 胞 计 数 结 果 [2] 取 样 计 数 前, 应 充 分 混 匀 细 胞 悬 液 在 连 续 取 样 计 数 时, 尤 其 要 注 意 这 一 点 否 则, 前 后 计 数 结 果 会 有 很 大 的 误 差 [3] 镜 下 计 数 时, 遇 见 2 个 以 上 细 胞 组 成 的 细 胞 团, 应 按 单 个 细 胞 计 算 如 细 胞 团 10% 以 上, 说 明 消 化 不 充 分 ; 或 细 胞 数 少 于 2 个 /mm 2 或 多 于 50 个 /mm 2 时, 说 明 稀 释 不 当, 需 重 新 制 备 细 胞 悬 液 计 数 5 培 养 细 胞 的 运 输 装 运 细 胞 的 方 法 有 两 种, 一 种 为 冷 冻 储 存 运 输, 即 利 用 特 殊 容 器 内 盛 液 氮 或 干 冰 冻 存, 保 存 效 果 较 好, 但 较 麻 烦, 且 不 宜 长 时 间 运 输, 多 需 空 运 另 一 种 简 单 的 方 法 为 充 液 法, 步 骤 如 下 : [1] 选 择 生 长 状 态 良 好 的 细 胞, 可 直 接 根 据 路 程 时 间 来 选 择 接 种 细 胞 数 量, 一 般 以 长 满 1/3 1/2 瓶 底 壁 为 宜, 去 掉 旧 培 养 液, 补 充 新 的 培 养 液 到 达 瓶 颈 部, 保 留 微 量 空 气, 拧 紧 瓶 盖, 瓶 口 用 胶 带 密 封 [2] 妥 善 包 装 运 送, 并 用 棉 花 等 做 防 震 防 压 处 理 4 5 天 可 以 到 达 目 的 地 者 一 般 放 在 贴 身 口 袋 即 可, 到 达 目 的 地 后 倒 出 多 余 的 培 养 液, 仅 保 留 维 持 细 胞 生 长 所 需 液 量 37 培 养, 次 日 传 代 [3] 如 果 距 离 很 近, 如 在 统 一 城 市 内 或 数 小 时 路 程, 也 可 将 细 胞 附 着 面 朝 上, 或 把 培 养 液 全 部 倒 掉 放 在 胸 部 口 袋 进 行 运 送 仅 靠 附 着 于 细 胞 表 面 的 培 养 液, 可 使 细 胞 短 时 间 不 致 受 损 6 多 药 耐 药 细 胞 的 培 养 多 药 耐 药 (Multidrug Resistance, MDR) 是 指 肿 瘤 细 胞 长 期 接 触 某 一 化 疗 药 物, 不 仅 对

5 此 种 化 疗 药 物 产 生 耐 药 性, 而 且 对 其 他 结 构 和 功 能 不 同 的 抗 肿 瘤 药 物 也 产 生 交 叉 耐 药 性 的 现 象, 是 造 成 化 疗 失 败 的 主 要 原 因 耐 药 指 数 (RF)= 某 种 药 物 针 对 抗 药 性 细 胞 的 IC 50/ 某 种 药 物 针 对 敏 感 性 细 胞 的 IC 50 逆 转 指 数 (reverse index, RI)= 不 加 逆 转 剂 时 某 种 药 物 针 对 抗 药 性 细 胞 的 IC 50/ 加 入 逆 转 剂 后 某 种 药 物 针 对 抗 药 性 细 胞 的 IC 50 体 外 低 浓 度 梯 度 递 增 联 合 大 剂 量 间 断 冲 击 方 法 诱 导 肿 瘤 细 胞 对 特 定 细 胞 产 生 耐 药 性 第 二 节 细 胞 培 养 污 染 的 检 测 和 排 除 组 织 培 养 细 胞 被 有 害 物 污 染 是 组 织 培 养 工 作 的 大 敌 应 用 组 织 培 养 进 行 研 究 工 作, 除 需 要 好 的 实 验 设 计 和 技 术 方 法 外, 成 败 的 关 键 还 在 于 能 否 避 免 污 染 一 项 好 的 研 究, 或 建 成 的 满 意 细 胞 系, 往 往 由 于 遭 受 污 染 而 前 功 尽 弃 因 此, 一 个 组 织 培 养 工 作 者, 要 始 终 注 意 防 止 污 染 培 养 细 胞 被 污 染, 人 们 最 注 意 的 是 真 菌 细 菌 和 病 毒 等 微 生 物 现 在 看 来 已 经 不 够, 当 前 污 染 一 词 的 概 念 应 该 是, 凡 混 入 培 养 环 境 中 对 细 胞 生 存 有 害 的 成 分 和 造 成 细 胞 不 纯 的 异 物, 都 应 视 为 污 染 从 这 一 概 念 考 虑, 组 织 培 养 污 染 应 包 括 以 下 几 个 方 面 : 微 生 物 : 真 菌 细 菌 支 原 体 和 病 毒 化 学 物 质 : 影 响 细 胞 生 存 的 非 细 胞 所 需 的 化 学 成 分 细 胞 : 非 同 种 的 其 它 细 胞 当 然 在 培 养 中 以 微 生 物 污 染 最 为 多 见, 化 学 污 染 较 少 ; 但 近 年 随 细 胞 种 类 增 多, 不 同 种 细 胞 交 叉 污 染 却 屡 有 发 生, 以 致 在 ATCC 接 受 入 库 细 胞 中 特 设 同 工 酶 检 测 一 项, 目 的 在 于 证 明 是 否 有 HeLa 等 细 胞 的 交 叉 污 染 但 细 胞 交 叉 污 染 只 要 工 作 细 心, 是 容 易 防 止 的, 而 微 生 物 污 染 在 实 际 工 作 中 却 是 最 难 防 止 和 易 发 生 的 1 污 染 途 径 各 种 污 染 主 要 通 过 以 下 途 径 和 媒 介 发 生 : [1] 空 气 空 气 是 扩 散 微 生 物 的 主 要 途 径 由 于 空 气 流 动 性 大, 在 操 作 场 地 与 外 界 隔 离 不 严 和 消 毒 不 充 分 的 情 况 下, 外 界 不 洁 空 气 很 容 易 侵 入 造 成 污 染 因 此, 培 养 设 施 不 宜 置 于 通 风 场 所 现 各 实 验 室 普 遍 应 用 净 化 工 作 台, 能 产 生 无 菌 的 屏 障 气 流, 可 防 止 不 洁 空 气 污 染 净 化 工 作 台 使 用 过 久, 过 滤 层 受 尘 埃 堵 塞 情 况 下, 工 作 时 不 带 口 罩 或 外 界 气 流 过 强 污 染 空 气 均 可 进 入 操 作 野, 导 致 污 染 又 不 同 季 节 和 不 同 地 区 空 气 内 含 菌 数 不 同 ; 炎 热 夏 季 尤 其 南 方 多 雨 地 区 空 气 湿 度 大 含 菌 数 量 多, 工 作 应 特 别 注 意 空 气 是 不 断 流 动 的 ; 虽 用 消 毒 措 施 也 难 以 排 出 空 气 中 所 有 微 生 物, 但 每 立 方 米 内 含 菌 数 不 应 超 过 1--5 个 [2] 器 材 培 养 器 皿 和 容 器 洗 刷 不 净 残 留 污 物 培 养 用 液 灭 菌 不 彻 底 等, 都 可 引 入 有 害 物 [3] 操 作 实 验 操 作 马 虎 动 作 不 准 确 消 毒 观 念 不 强, 使 用 的 吸 管 刀 剪 沾 染 微 生 物 等 ; 或 封 瓶 口 时 不 严, 都 可 发 生 污 染 同 时 培 养 两 种 以 上 细 胞, 操 作 不 慎, 使 用 同 一 吸 管 或 培 养

6 用 液, 可 能 导 致 细 胞 交 叉 污 染 [4] 血 清 血 清 也 是 污 染 细 胞 的 来 源, 有 的 市 售 血 清 制 备 水 平 低 检 测 不 严, 常 已 被 支 原 体 和 病 毒 污 染 [5] 组 织 初 代 培 养 组 织 常 有 污 染 ; 有 的 是 在 手 术 中 污 染, 有 的 本 身 可 能 是 被 污 染 的 组 织 ( 如 已 经 发 生 溃 烂 的 肿 瘤 组 织 ); 手 术 用 碘 酒 消 毒 后, 擦 拭 不 净 可 能 混 入 碘 污 染 2 污 染 对 细 胞 的 影 响 体 外 培 养 细 胞 自 身 没 有 抵 抗 污 染 的 能 力, 而 且 培 养 基 中 加 入 的 抗 生 素 的 抗 污 染 能 力 也 是 很 有 限 的, 培 养 细 胞 一 旦 发 生 污 染 多 数 将 无 法 挽 救 在 细 胞 受 有 害 物 污 染 时 间 短 污 染 程 度 轻 并 能 及 时 排 除 污 染 物 的 情 况 下, 细 胞 有 可 能 恢 复 当 污 染 物 持 续 存 在 于 培 养 环 境 中 时, 轻 者 细 胞 增 殖 生 长 缓 慢 分 裂 相 减 少 细 胞 变 得 粗 糙 细 胞 轮 廓 增 强, 重 者 细 胞 停 止 增 殖, 分 裂 相 消 失, 细 胞 质 中 出 现 大 量 堆 积 物, 细 胞 变 圆 或 崩 溃 从 瓶 壁 脱 落 但 根 据 污 染 物 的 不 同, 对 细 胞 的 影 响 有 别 有 的 微 生 物 如 支 原 体, 无 致 死 毒 性, 可 与 细 胞 长 期 共 存, 对 细 胞 形 态 和 功 能 的 影 响 是 潜 在 的 而 病 毒 细 菌 和 霉 菌 的 增 殖 迅 速, 能 在 短 时 间 内 在 数 量 上 压 过 细 胞 或 产 生 有 毒 物 杀 死 细 胞 化 学 物, 如 重 金 属 或 其 它 非 培 养 必 需 化 学 试 剂 混 入 培 养 液 中 后, 有 的 毒 性 小, 被 排 除 后, 细 胞 仍 可 生 存 ; 有 的 烃 化 物 如 多 环 芳 烃 有 致 突 变 性, 能 导 致 细 胞 发 生 转 化 [1] 真 菌 污 染 在 微 生 物 污 染 中, 以 真 菌 污 染 最 多, 最 常 见 的 有 : 烟 曲 霉 (Aspergillus Fumigatus); 黑 曲 霉 (Aspergillus Niger); 毛 霉 菌 (Mucor); 孢 子 霉 (Oospora); 白 念 珠 菌 (Candida); 酵 母 菌 (Yeast) 真 菌 种 类 繁 多, 形 态 各 异, 但 污 染 后 均 不 难 发 现, 大 多 呈 白 色 或 浅 黄 色 小 点 漂 浮 于 培 养 液 表 面, 肉 眼 可 见 ; 有 的 散 在 生 长, 镜 下 观 察 呈 丝 状 管 状 或 树 枝 状 菌 丝, 纵 横 交 错 穿 行 于 细 胞 之 间 念 珠 菌 和 酵 母 菌 呈 卵 圆 形 态, 散 在 于 细 胞 周 边 和 细 胞 之 间 生 长 预 防 霉 菌 污 染, 可 在 培 养 基 里 加 3u/ml 的 两 性 霉 素 或 制 霉 菌 素 或 放 线 菌 素 D 或 双 抗 ; 但

7 细 胞 一 旦 污 染, 很 难 挽 救, 制 霉 菌 素 或 放 线 菌 素 D 或 双 抗 都 于 事 无 补, 建 议 舍 弃 该 污 染 细 胞, 将 环 境 彻 底 消 毒 无 菌 室 经 甲 醛 熏 蒸 消 毒 后, 可 用 同 等 量 的 氨 水 喷 洒 中 和, 约 几 小 时 即 可 进 入 操 作 [2] 细 菌 污 染 较 常 见 的 污 染 细 菌 有 大 肠 杆 菌 假 单 孢 菌, 白 色 葡 萄 菌 等 细 菌 污 染 后 大 多 能 改 变 培 养 液 ph 使 培 养 液 变 混 浊, 也 有 的 对 培 养 液 无 肉 眼 可 见 影 响, 只 在 镜 下 观 察 发 现 菌 体 时 才 能 感 知 污 染 细 菌 增 殖 迅 速, 能 消 耗 营 养 液 和 产 生 毒 素 抑 制 细 胞 生 长, 毒 性 大 的 细 菌 很 快 导 致 细 胞 崩 解 死 亡 加 用 抗 生 素 的 培 养 用 液 一 般 可 预 防 和 排 除 个 别 少 量 细 菌 的 污 染 一 旦 发 生 细 菌 污 染 很 易 发 现, 多 数 情 况 下 培 养 液 短 期 内 颜 色 变 黄, 出 现 明 显 污 浊 现 象 细 菌 和 霉 菌 污 染 多 在 传 代 换 液 加 样 等 开 放 性 操 作 之 后 发 生 而 且 由 于 增 生 迅 速, 多 在 发 生 污 染 48h 以 内 就 已 明 显 因 此 在 实 验 的 最 初 两 天 密 切 观 察 实 验 样 本 是 否 有 污 染 发 生, 这 样 可 及 时 采 取 措 施 予 以 补 救 或 排 除 [3] 支 原 体 污 染 支 原 体 是 细 胞 培 养 中 最 常 见 不 易 被 察 觉 和 干 扰 实 验 结 果 的 一 种 污 染 从 年 间, 有 人 检 查 了 54 个 实 验 室 的 9700 个 各 类 培 养 细 胞 时 发 现, 有 11% 的 细 胞 受 到 了 支 原 体 的 污 染 当 前 随 实 验 室 设 备 的 改 善 和 技 术 方 法 的 改 进, 支 原 体 污 染 率 有 所 下 降, 但 尚 未 能 彻 底 杜 绝, 污 染 仍 时 有 发 生 支 原 体 污 染 是 细 胞 培 养 研 究 室 重 点 预 防 对 象 支 原 体 是 一 种 介 于 细 菌 和 病 毒 之 间 的 目 前 所 知 能 独 立 生 活 的 最 小 微 生 物, 它 无 细 胞 壁, 形 态 呈 高 度 多 样 性, 最 小 的 直 径 0.2 微 米, 可 通 过 滤 菌 器 支 原 体 大 小 介 于 0.2~2 微 米 之 间, 约 有 1% 可 通 过 滤 菌 器, 因 此 往 往 难 以 发 现 支 原 体 形 态 多 变, 有 圆 形 丝 状 或 梨 形 : 光 镜 下 难 以 看 清 其 结 构 支 原 体 多 吸 附 于 细 胞 表 面 或 散 在 细 胞 之 间, 横 断 面 很 像 细 胞 微 绒 毛 的 横 断 面 不 同 支 原 体 的 生 物 学 性 状 有 很 大 差 别 所 有 支 原 体 都 需 要 固 醇, 部 分 需 要 精 氨 酸, 有 的 需 氧 葡 萄 糖, 有 的 有 DNA 酶 活 性 溶 血 作 用 和 凝 集 作 用 ; 有 的 缺 乏 或 全 无 某 一 特 性, 因 此 支 原 体 对 培 养 细 胞 的 影 响 是 多 方 面 的 大 多 数 支 原 体 适 于 偏 碱 条 件 下 生 存 (ph ), 对 酸 耐 受 性 差, 对 热 比 较 敏 感 ; 对 青 霉 素 普 遍 有 抗 药 性 ; 青 霉 素 作 用 主 要 抑 制 细 菌 细 胞 壁 的 形 成, 支 原 体 无 细 胞 壁, 故 不 受 影 响 细 胞 受 支 原 体 污 染 后, 个 别 严 重 情 况 下, 加 之 细 胞 敏 感, 可 使 细 胞 增 殖 缓 慢 部 分 细 胞 变 圆 从 瓶 壁 脱 落 但 多 数 细 胞 受 污 染 后, 无 明 显 变 化, 或 有 微 细 变 化 却 由 于 传 代 和 换 液 而 被 缓 解 在 观 察 不 够 细 心 和 缺 乏 经 验 时, 外 观 上 往 往 给 人 以 正 常 的 感 觉, 实 则 污 染 细 胞 会 受 到 多 方 面 潜 在 的 影 响 [4] 细 胞 交 叉 污 染 细 胞 培 养 中, 细 胞 间 交 叉 污 染 并 不 罕 见, 多 是 由 于 在 培 养 操 作 过 程 中 各 种 细 胞 同 时 进 行, 混 杂 使 用 所 用 器 具 或 液 体 所 致, 这 种 污 染 能 使 细 胞 的 生 长 特 性 形 态 特 征 等 发 生 变 化, 有 些 变 化 较 轻 微 不 易 察 觉, 有 些 则 可 能 由 于 污 染 的 细 胞 具 有 生 长 优 势 最 终 压

8 过 原 来 细 胞 而 导 致 细 胞 的 生 长 抑 制, 最 终 死 亡 常 用 观 察 细 胞 形 态 分 析 生 长 特 性 和 核 型 检 测 细 胞 的 标 记 物 等 方 法 检 测 交 叉 污 染 的 细 胞 3 污 染 的 检 测 [1] 细 菌 真 菌 污 染 的 检 测 肉 眼 观 察 细 菌 真 菌 污 染 常 在 传 代 换 液 加 样 等 开 放 性 操 作 之 后 发 生, 而 且 增 生 迅 速, 若 有 污 染, 在 48 小 时 内 可 明 显 观 察 到, 例 如 培 养 液 变 混 浊, 或 略 加 振 荡 有 很 多 漂 浮 物 漂 起 接 种 观 察 采 用 普 通 肉 汤 接 种 或 用 未 加 双 抗 药 物 的 培 养 液 接 种, 也 可 发 现 是 否 有 污 染 镜 下 观 察 在 倒 置 显 微 镜 的 高 倍 镜 下 可 见 培 养 液 中 有 大 量 圆 球 状 颗 粒 漂 浮, 即 为 细 菌 污 染 若 细 胞 之 间 有 丝 状 管 状 树 枝 状 或 卵 形 的 物 质 常 为 真 菌 污 染 [2] 支 原 体 污 染 的 检 测 相 差 显 微 镜 观 察 直 接 取 少 许 培 养 液 滴 在 载 物 片 上, 再 盖 上 盖 片 观 察, 支 原 体 在 镜 下 呈 暗 色 微 小 颗 粒, 多 位 于 细 胞 与 细 胞 之 间, 有 时 可 见 类 似 于 布 朗 运 动 的 表 现 应 注 意 与 细 胞 破 碎 溢 出 的 内 容 物 如 线 粒 体 等 相 区 别 荧 光 染 色 法 观 察 用 荧 光 染 料 Hoechst33258, 此 染 料 能 与 DNA 特 异 地 结 合, 可 使 支 原 体 内 的 DNA 着 色, 荧 光 显 微 镜 下 支 原 体 呈 绿 色 小 点, 散 在 于 细 胞 周 围 或 附 于 细 胞 表 面 电 镜 检 测 若 条 件 许 可, 可 用 扫 描 电 镜 或 透 射 电 镜 观 察 一 般 在 细 胞 培 养 48~72 小 时, 细 胞 接 近 汇 合 前, 用 胰 酶 消 化 细 胞 制 成 细 胞 悬 液 后 进 行 固 定 包 埋 切 片 后 才 能 进 行 观 察 培 养 检 测 将 细 胞 悬 液 5mL 加 入 45mL 支 原 体 肉 汤 培 养 基, 培 养 14 天 后 观 察 肉 汤 培 养 有 无 雾 状 沉 淀, 然 后 取 0.5ml 加 入 已 冷 却 到 50 的 培 养 基 中, 再 用 琼 脂 培 养 基 做 分 离 培 养, 37 培 养 3 天 观 察 有 无 荷 包 蛋 菌 落 出 现 [3] 病 毒 的 检 测 应 用 电 镜 技 术 快 速 诊 断 动 物 病 毒 病 逆 转 录 _ 聚 合 酶 链 反 应 RT-PCR 检 测 病 毒 4 污 染 的 预 防 防 止 污 染, 预 防 是 关 键, 预 防 措 施 应 贯 穿 于 整 个 细 胞 培 养 的 始 终 培 养 细 胞 的 污 染 一 旦 明 确, 多 数 将 无 法 救 治, 如 果 污 染 的 细 胞 不 是 具 有 重 要 的 价 值, 一 般 发 现 污 染 后 应 尽 快 弃 之, 以 防 污 染 扩 大 影 响 其 他 细 胞 因 此, 应 尽 力 预 防 污 染 的 发 生 防 止 的 关 键 在 严 格 无 菌 操 作, 把 好 每 一 关 口, 尽 可 能 禁 止 其 他 污 染 的 物 品 进 入 培 养 操 作 环 节 [1] 器 皿 准 备 中 的 预 防 用 于 细 胞 培 养 的 器 皿 应 严 格 清 洗, 做 到 真 正 洁 净 ; 应 该 无 菌 的 物 品, 要 做 到 消 毒 严 格, 真 正 无 菌 ; 器 皿 在 运 输 贮 藏 过 程 中, 要 严 格 操 作, 谨 防 污 染

9 [2] 开 始 操 作 前 的 预 防 主 要 包 括 以 下 方 面 : 应 当 按 厂 家 规 定, 定 期 清 洗 或 更 换 超 净 工 作 台 的 空 气 滤 网, 请 专 职 人 员 定 期 检 查 超 净 工 作 台 的 空 气 净 化 标 准 ; 检 查 培 养 器 皿 是 否 有 消 毒 标 志, 有 条 件 的 实 验 室 应 尽 可 能 使 用 一 次 性 无 菌 器 皿 ; 检 查 新 配 制 的 培 养 液, 确 认 无 菌 方 可 应 用 ; 操 作 前 提 前 半 小 时 启 动 超 净 工 作 台 及 紫 外 消 毒 灯 ; 操 作 者 应 消 毒 双 手 和 戴 口 罩 [3] 操 作 过 程 中 的 预 防 主 要 包 括 : 在 超 净 工 作 台 面 放 置 的 所 有 培 养 瓶 瓶 口 不 能 与 超 净 工 作 台 的 风 向 相 逆, 不 允 许 用 手 触 及 器 皿 的 无 菌 部 分, 如 瓶 口 和 瓶 塞 内 侧 ; 在 安 装 吸 管 帽 开 启 或 封 闭 瓶 口 操 作 时 要 经 过 火 焰 烧 灼, 并 在 火 焰 附 近 工 作 ; 吸 取 培 养 液 细 胞 悬 液 等 液 体 时, 应 专 管 专 用, 防 止 污 染 扩 大 或 造 成 培 养 物 之 间 的 交 叉 污 染 ; 使 用 培 养 液 前, 不 宜 过 早 开 瓶 ; 开 瓶 后 的 培 养 液 应 保 持 斜 位, 避 免 直 立 ; 不 再 使 用 的 培 养 液 应 立 即 封 闭 瓶 口 ; 培 养 的 细 胞 在 处 理 之 前 勿 过 早 暴 露 于 空 气 中 ; 操 作 时 不 要 交 谈 咳 嗽, 以 防 唾 沫 和 呼 出 气 流 引 发 污 染 ; 操 作 完 毕 后 应 将 工 作 面 整 理 好, 并 消 毒 擦 拭 工 作 面, 关 闭 超 净 工 作 台 [4] 其 他 方 面 的 预 防 主 要 有 : 为 了 确 保 培 养 物 的 安 全, 应 及 早 冻 存 有 价 值 的 培 养 物 ; 购 入 的 未 灭 活 血 清 应 采 取 56 水 浴 灭 活 30 分 钟 的 措 施 以 使 血 清 中 的 补 体 和 支 原 体 灭 活 ; 对 新 引 进 的 细 胞 株 应 加 强 观 察, 防 止 外 来 的 污 染 源 ; 超 净 台 的 风 机 不 能 过 大, 风 机 到 6-8 格 否 则 也 可 能 能 致 霉 菌 污 染 ; 孵 箱 应 定 期 清 洁 (2 月 左 右 ), 尤 其 在 多 雨 的 季 节, 培 养 箱 清 洗 方 法 是 : 用 84 液 擦 洗 - 清 水 擦 洗 -75% 酒 精 擦 洗 - 紫 外 灯 照 定 期 打 扫 无 菌 室 : 每 周 打 扫 一 次, 先 用 自 来 水 拖 地 擦 桌 子 超 净 工 作 台 等, 然 后 用 3 来 苏 尔 或 者 新 洁 尔 灭 或 者 0.5% 过 氧 乙 酸 擦 拭 5 污 染 的 排 除 培 养 的 细 胞 一 旦 被 微 生 物 污 染, 应 及 时 处 理, 防 止 其 他 细 胞 被 污 染 通 常 选 高 压 灭 菌 被 污 染 的 细 胞, 然 后 弃 掉 如 果 有 价 值 的 细 胞 被 污 染, 并 且 污 染 程 度 比 较 轻, 可 通 过 及 时 排 除 污 染 物, 挽 救 细 胞 恢 复 正 常 常 用 的 排 除 微 生 物 污 染 方 法 有 如 下 几 种 : [1] 抗 生 素 排 除 法 抗 生 素 是 细 胞 培 养 中 杀 灭 微 生 物 的 主 要 手 段 各 种 抗 生 素 性 质 不 同, 对 各 种 微 生 物 的 作 用 也 不 同, 联 合 应 用 比 单 用 效 果 好, 预 防 性 应 用 比 污 染 后 使 用 好 ; 如 果 发 生 微 生 物 污 染 后 再 使 用 抗 生 素, 常 难 以 根 除 有 的 抗 生 素 对 细 菌 仅 有 抑 制 作 用, 而 无 杀 灭 效 应 反 复 使 用 抗 生 素 还 能 使 微 生 物 产 生 耐 药 性, 且 对 细 胞 本 身 也 有 一 定 影 响, 因 此 有 人 主 张 尽 量 不 用 抗 生 素 处 理, 当 然, 一 些 有 价 值 的 细 胞 被 污 染 后, 仍 需 用 抗 生 素 挽 救, 在 这 种 情 况 下, 可 采 用 5~10 倍 于 常 用 量 的 冲 击 法, 加 入 高 浓 度 抗 生 素 后 作 用 小 时, 再 换 入 常 规 培 养 液 有 时 可 能 奏 效 抗 生 素 的 参 考 用 量 和 效 果 列 于 表 表 常 用 抗 生 素 及 推 荐 用 量 抗 生 素 抗 菌 谱 细 菌 真 菌 支 原 体 常 用 浓 度

10 青 霉 素 链 霉 素 庆 大 霉 素 G+ G- 100IU/ml 100μg/ml 200μg/ml 四 环 素 G+/G- + 10μg/ml 卡 那 霉 素 G+/G- + 50μg/ml 两 性 霉 素 制 霉 菌 素 G+/G μg/ml 25μg/ml [2] 加 温 除 菌 根 据 支 原 体 耐 热 性 能 差 的 特 点 有 人 将 受 支 原 体 污 染 的 细 胞 置 于 41 中 作 用 5~10 小 时 ( 最 长 可 达 18 小 时 ) 以 杀 灭 支 原 体 但 41 对 培 养 细 胞 本 身 也 有 较 大 影 响, 故 在 处 理 前, 应 先 进 行 预 试 验, 确 定 出 最 大 限 度 杀 伤 支 原 体 而 对 细 胞 影 响 较 小 的 处 理 时 间 [3] 动 物 体 内 接 种 受 微 生 物 污 染 的 肿 瘤 细 胞 可 接 种 在 同 种 动 物 皮 下 或 腹 腔, 借 动 物 体 内 免 疫 系 统 消 灭 污 染 的 微 生 物, 肿 瘤 细 胞 却 能 在 体 内 继 续 生 长, 待 一 定 时 间 后, 从 体 内 取 出 再 进 行 培 养 繁 殖 [4] 与 巨 噬 细 胞 共 培 养 在 良 好 的 体 外 培 养 条 件 下 巨 噬 细 胞 可 存 活 天, 并 可 分 泌 一 些 细 胞 生 长 因 子 支 持 其 他 细 胞 的 克 隆 生 长 与 体 内 的 情 况 相 似, 巨 噬 细 胞 在 体 外 培 养 条 件 下 仍 然 可 吞 噬 微 生 物 并 将 其 消 化 利 用 96 孔 培 养 板 将 极 少 量 的 培 养 细 胞 与 巨 噬 细 胞 共 培 养, 可 以 在 高 度 稀 释 培 养 细 胞 极 大 地 降 低 微 生 物 污 染 程 度 的 同 时, 更 有 效 地 发 挥 巨 噬 细 胞 清 除 污 染 的 效 能 本 方 法 与 抗 生 素 联 合 应 用 效 果 更 佳 主 要 参 考 文 献 : [1] 薛 庆 善 主 编. 体 外 培 养 的 原 理 与 技 术. 北 京 : 科 学 出 版 社,2001 [2] 陈 瑞 铭 主 编, 动 物 组 织 培 养 技 术 及 其 应 用. 第 二 版. 北 京 : 科 学 出 版 社,1998 [3] 鄂 征 主 编. 组 织 培 养 和 分 子 细 胞 学 技 术. 第 二 版. 北 京 : 北 京 出 版 社,1997 [4] 薛 庆 善 主 编. 体 外 培 养 的 原 理 与 技 术. 北 京 : 科 学 出 版 社,2001 [5] 章 静 波 主 编, 组 织 和 细 胞 培 养 技. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2002 [6] 张 卓 然 主 编, 实 用 细 胞 培 养 技 术. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,1999

11 附 : 主 要 试 剂 的 配 制 [1] McCoy s 5a 培 养 基 配 制 1000 ml 培 养 基 : 称 取 青 霉 素 0.08g, 链 霉 素 0.1g,NaHCO g,hepes2.38g 和 McCoy s 5a 干 粉 一 袋, 放 入 已 消 毒 的 1000ml 烧 杯 中, 加 适 量 超 纯 水, 充 分 搅 拌 溶 解, 混 匀 定 容 至 1000 ml, 在 超 净 台 中 用 0.22 µm 微 孔 滤 膜 的 过 滤 除 菌,4 保 存 [2] 胰 蛋 白 酶 (trypsin) 液 (0.25%) 精 密 称 取 胰 蛋 白 酶 0.25 g, 溶 于 100 ml PBS 缓 冲 液 中, 用 0.22 μm 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌, 小 瓶 分 装,4 保 存 [3] 细 胞 冻 存 培 养 液 ( 含 10% 二 甲 基 亚 砜 ) 配 制 10 ml 细 胞 冻 存 液 : 取 9 ml 胎 牛 血 清 于 无 菌 离 心 管 中, 加 入 1 ml 二 甲 基 亚 砜, 混 匀, 4 保 存 [4] 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 称 取 NaCl 8.5 g KCl 0.2 g Na 2 HPO 4 12H 2 O 2.85 g KH 2 PO g, 在 1000 ml 超 纯 水 中 溶 解, 于 高 压 灭 菌 器 中 121 灭 菌 25 min,4 保 存