复旦学报 医学版 年 月 #%- &$"!!& &' #!!-&'# /-& "&" &&'-!" '!"#&' $" ##!!- 6 )!- # ##%- & &! $"&'&'!&"! %"!$ (7 #'!&'&&' $" ##!!- / # & -& "&" & &'-!"&!'!"#&'&

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1 复旦学报 医学版 卵泡刺激素.-2 对卵巢癌 2 细胞系, " 通路及转录因子 - 表达的影响 刘姝蓉 姚晔俪 贾罗琦 陈 奇 丁景新 华克勤 丰有吉 复旦大学附属妇产科医院妇科 上海 浙江大学附属妇产科医院妇产科 杭州 上海交通大学附属第一人民医院妇产科 上海 摘要 目的 研究卵泡刺激素 -!#&&%'!"! 体外对卵巢癌 细胞系!& ' 通路上!& ' 胞内段蛋白 6 ) 转录因子 与靶基因表达以及对转录因子 家族的调节作用 以探讨 促进卵巢癌侵袭的可能机制 方法 体外培养卵巢癌 细胞系 设 73 对照组和 实验组 改良的 3! 小室检测两组细胞侵袭力 9 #& "4!& 检测两组 6 )% 蛋白表达 (7 检测 / 表达 结果 6 可显著增强卵巢癌 细胞系的侵袭能力 相比于对照组 实验组 6 作用 ' 后 6 ) 和 蛋白表达显著上升 6 作用后 ' / 的表达增加 作用 ' 时 / 的表达增加 而 作用后 / 水平无明显变化 6 作用 ' 后 相比于对照组 蛋白表达显著上升 而 % 蛋白的表达无显著变化 结论 可能激活!& ' 信号通路和 转录因子 进而促进卵巢癌细胞的侵袭能力 关键词 卵泡刺激素 卵巢癌!& ' 中图分类号 文献标志码 /, ##. "!$ # #!.-2 #!$, " $!9!$- ""!"!!2 6 '"!% /1 6/!2 8 )6% / 0 2!,, " -.$ $, " % $"&' $! -.$ $, ", " -.$ % $"# /$ %0' # /! -.$ $, " &$ "1$% $" )$! $"!"! (!## ##&'-&!--!#&&% '!"!!!& ' &""! 6 )&"# "$&! - &!"!& '&"% &% -!-!" " &! #&%& &' $!##4 '# 4' '#&& #&' #!!-&'!" "! $1" " #&" &" & 4 6!"73 #!&"!('#!## #$ "-!"4 #%&'!- 3! ' 4 "#6 )%$"!& $" ##! # && 4 9 #& "4!& /$" ##! ##" 4(7!$ $ 6 国家自然科学基金项目 上海市卫生局青年科研基金项目!"" #$!%&'!", #!

2 复旦学报 医学版 年 月 #%- &$"!!& &' #!!-&'# /-& "&" &&'-!" '!"#&' $" ##!!- 6 )!- # ##%- & &! $"&'&'!&"! %"!$ (7 #'!&'&&' $" ##!!- / # & -& "&" & &'-!"&!'!"#&'&&' $" ##!!- / # & -& "&" &&'-!"'!"# '&' $" ##!!- / #!& '% -& "&" &&' /-& "&" &&'-!"'!"#&' $" ##!!-!- # # #%- & &! $"&'&'!&"! %"!$4&&' $" ##!!-% #!& '%( "$ $ &&!& '#% %&"# "$&! - &!" &'#$"!!& &' #!!-!" " # )!%*$ -!#&&%'!"!!" "!& ' $*+* $$! %!,, -"! "!.( /1// 1 177!!$! "!"- 2! &! //// 8 近年来 卵巢癌的高促性腺激素致病学说引起妇科肿瘤研究者的关注 包括腺垂体的促性腺素细胞分泌的卵泡刺激素 -!#&&%'!"! 和黄体生成素 &%'!"! 这一致病学说可以很好地解释为何卵巢癌多见于围绝经期和绝经后妇女 以及为何妊娠和口服避孕药 持续低水平 可降低卵巢癌的发病危险 多项体外实验及动物实验也表明 促性腺激素不但可以促进上皮性卵巢癌细胞的增殖及血管生成 抑制 癌细胞凋亡 而且可以促进肿瘤的侵袭和转移 但 促进上皮性卵巢癌侵袭和转移的机制尚不明确 故其已成为妇科肿瘤的研究热点 上皮细胞间充质细胞转化 $&' # ' &"#&!#( 指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力 是上皮来源肿瘤细胞发生侵袭转移的基 础 转录因子 % 家族具有诱发 ( 的作用 通过直接抑制 ' " 表达诱导 ( 诸多信号通路参与了胚胎发育或肿瘤转移过程中 诱发的 ( 调控 其中包括!& ' 信号通 路!& ' 信号通路是一条进化上十分保守的信号传导系统 配体与!& ' 受体的胞外域相结合 在 分泌酶的介导下发生蛋白水解作用 使!& ' 胞内段蛋白!& '&""!6 ) 释放 6 ) 转移至细胞核 与转录因子 结合 激活靶基因 %% 的转录 该通路为经典的 依赖性信号通路 本文主要研究 体外对卵巢癌 细胞 系!& ' 通路上!& ' 胞内段蛋白 6 ) 转录因子 与靶基因表达以及对转录因子 家族的调节作用 以探讨 促进卵巢癌侵袭的可能机制 材料和方法 细胞培养 卵巢癌细胞系 由原美国 ) / "#! 卵巢癌实验室郁茵华教授惠赠 :. 1 条件下培养于含 6 青霉素 % 链霉素及. 胎牛血清 美国! 公司 的 76 培养基 美国 63 1 公司 中 主要试剂 单克隆鼠抗人 抗体及 % 抗体 美国 % %('!!% 公司 单克隆鼠抗人 6 ) 抗体 单克隆山羊抗人 抗体 美国 ;) 公司 单克隆鼠抗人 /7) 抗体 上海碧云天生物技术有限公司 9 #& "4!& 检测试剂盒 美国 7 " 公司 以色列 7"!#$ 公司 规格 6 : 保存 逆转录试剂盒 (2) / 聚合酶及 发光试剂盒 加拿大 36 "&# 公司 及 引物由上海生工生物工程公司设计合成 3! 小室 &"% 购自美国 3) 公司 纤维结合蛋白购自美国 % 公司 侵袭实验 在改良 3! 小室的聚碳脂滤膜 孔径 上 下表面分别铺 % 基质胶及 % 纤维结合蛋白 细胞培养于 73 对照组及 6 实验组培养液 ' 后制备单细胞悬液 细胞数 小室下室加入培养液

3 刘姝蓉 等 卵泡刺激素 对卵巢癌 细胞系!& ' 通路及转录因子 表达的影响 上室中加入 细胞悬液 每组设 个复孔 培养 ' 棉签拭去未穿过滤膜的细胞 73 冲洗 甲醇固定 姬姆萨染色 随机选取 个 倍显微视野 计数细胞 :!$! 检测 细胞培养于 76 培养基中至对数生长期 饥饿 ' 后 加入浓度为 6 的 其溶剂为 73 处理 ' 以仅加 73 为空白对照 提取总蛋白 定量后进行 9 #& " 4!& 检测 用.. 的 ) 7/ 胶电泳 转膜 用含. 脱脂奶粉. ( 的 (3 封闭液室温下封闭 ' 一抗 : 孵育过夜 稀释倍数如下 6 ) 抗体 对照组 6 实验组平均每个 倍视野穿过滤膜的细胞数分别为 个和 个 提示 6 可显著增强卵巢癌 细胞系的侵袭能力 差异有统计学意义.-2 对, " 通路, 6( 蛋白 转录因子 (-; 的调节作用 9 #& "4!& 结果提示 细胞可检测到!& ' 胞内段 6 ) 和转录因子 的阳性表达 相比于对照组 6 作用 ' 后 6 ) 和 蛋白表达显著上升 图 抗体 % /7) 抗体 次日 辣根过氧化物酶 7 标记的二抗 室温下孵育 最后采用 化学发光法进行发光 ' ( 反应 细胞生长至对数生长期 饥饿 ' 后 加入浓度为 6 的 分别处理 及 ' 以仅加 73 为空白对照组 用 ("! 裂解后提取总 / 并用紫外分光光度计检测其浓度 在 (% 酶的参与下进行 7 反应 及 # 循环次数分别为 次 退火温度分别为 : : : /7) 循环 次 退火温度为 :7 产物. 琼脂糖凝胶电泳 并在凝胶成像系统进行分析 的上游引物 / /( / (( /// (/ /( 下游引物 /(( / / / (// (// 的上游引物 / ( ( ( / ( ( (( ( 下游引物 (((/(( ((( (( / ( ( # 的上游引物 / /(( (///( / / ( 下游 图.-2 作用对 2 细胞, " 通路, 6( 及 (-; 蛋白表达的影响.!#".-2, 6((-;, " $ 2 "! $.-2 对, " 通路靶基因表达的调节作用 ( 7 结果提示 细胞可检测到!& ' 靶基因 % % %/ 的阳性表达 6 作用 ' 后 %/ 的表达增加 作用 ' 时 %/ 的表达增加 而 作用后 %/ 水平无明显变化 图 引物 // (( /// / ((/ / 7) 的上游引物 //( //( / ( 下游引物 // /(( /( /((( 统计方法 计量数据以 $ 表示 以统计软件 7 进行 检验 为差异有统计学意义 结 果.-2 对细胞侵袭力的调节 侵袭实验中 73 图.-2 作用对 2 细胞, " 通路靶基因 #, 表达的影响.!#".-2, "!!! #,!9!$ $ 2 "! $

4 复旦学报 医学版 年 月.-2 对转录因子 - 家族 - - 蛋白表达的调节作用 9 #& "4!& 结果提示 细胞可检测到 的弱阳性表达和 % 的阳性表达 相比于对照组 6 作用 ' 后 蛋白表达显著上升 而 % 蛋白的表达无显著变化 图 图.-2 作用对卵巢癌 2 细胞转录因子 - 和 - 表达的影响.!#" !9!$ ""!2 "! $ 讨 论 上皮性卵巢癌是威胁我国妇女生命和健康的主要恶性肿瘤 卵巢癌的转移途径主要通过直接蔓延及腹腔种植 但转移的具体机制仍未明了 研究表明 作用于 01+ 细胞可激活 70/ 和 760 信号通路 使 77 与 (6 7(6 7 比例上升 从而促进肿瘤的侵袭 促性腺激素还可以上调 & %" 和 ) 表达 提高卵巢肿瘤的黏附能力 另外 和 还可促进血管内皮细胞生长因子 #"!&' %"! &'- &!"+ 表达 并具有剂量依赖性 然而 这些资料仅提示 可通过促进 + 整合素 和 ) 表达 并增加 7#(6 7 比例 促进肿瘤的侵袭和转移 但其具体作用机制仍不明确!& ' 是在肿瘤组织中最常被检测到的!& ' 受体家族成员 根据细胞种类和!& ' 突变类型的不同!& ' 信号系统表现为不同的促癌或抑癌作用 失控的!& ' 信号不仅与肿瘤的生长 调控相关 还与肿瘤的侵袭 转移相关 年 7"5 等首次报道了 体外可以上调卵巢癌细胞系 01+ 的 / 及蛋 白表达 针对!& ' 的 / 干扰可以阻断 对 01+ 细胞的侵袭力的上调作用 但 对!& ' 通路中的下游转录因子 及靶基因 % % % 等的调节作用尚未见报道 本研究表明 6 可以上调卵巢癌细胞系 的!& ' 胞内段 6 ) 和转录因子 的表达 还可上调 % % / 的表达 而 作用后 %/ 水平无明显变化 提示 可以激活!& ' 信号通路 并很可能是通过经典的 依赖性信号通路 进而上调靶基因 % % 的表达 转录因子 % 家族具有诱发 ( 的作用 一直被学者所关注 但 对 家族表达的影响目前尚未见报道 本研究首次提示 可以上调卵巢癌 细胞转录因子 的表达 但不影响 % 的表达 研究表明!& ' 具有调控 ( 的作用 在胚胎心脏发育中!& ' 可以通过增加 转录来促进 ( 永生化内皮细胞体外过表达!& ' 可诱发 ( 及致癌性转化 表达上升 ' " 表达下降 提示肿瘤转移中可能存在!& ' 通路的激活 % 也是!& ' 的靶点 对正常乳腺上皮细胞系 / 的研究提示!& ' 配体 %% 激活!& ' 通路后 激活靶基因 % 而非 % 进而直接激活 % 而非 诱导 ( 最终抑制 ' " 表 达 上调 & 促进细胞的增殖和转移 提示不同细胞或不同配体作用下!& ' 通路的信号传导机制不尽相同 本研究中 6 可以上调转录因子 蛋白的表达 但不影响 % 的表达 提示 促进卵巢癌细胞转移很可能通过转录因子 而不是 % 本研究表明 6 不仅可以上调卵巢癌细胞系 的!& ' 胞内段 6 ) 和转录因子 的表达 还可上调 % % / 以及转录因子 的表达 但不影响 % 的表达 提示 可能激活!& ' 信号通路 并很可能是通过经典的 依赖性信号通路 进而上调靶基因 % % 的表达 再进一步激活下游 转录因子 进而促进卵巢癌细胞的侵袭能力 但 调控卵巢癌侵袭的具体信号传导机制还有待于进一步研究

5 刘姝蓉 等 卵泡刺激素 对卵巢癌 细胞系!& ' 通路及转录因子 表达的影响 参 考 文 献 '! 9!%/% "!!&"!$#!" " %" '4&#!" " $!$&!## 4 $" % &% #"! " % &%7) ) ) "! '! '! 0 / "#$ "% "!!&"!$# && $"!&!## " # #!&'"!%'$"!& 5# / $'!#$'&!#&! 5# $&'# '$&'!" " #! $ %! / 5 35 ( "$&' #' #'$&' &"#&!# "! $"!%" ##! )!" $ " 3""!!/&! / (' # %# # "#!-! &#"$&!#!$& "" 7" ) 3 #5 +"!"! " $ &&' "$ "#5!- $&'!" ")! 7"50!% 3"! " #&&% '!"!'#!& '$" ##! 01+!" " # ), "-" &9 44 " $ " #&"!% # " &"#5- &!"-!"&'!$&!- "-"!!&"!##, "-", "5 (0&!5 0" /4#!- #&"!% " $&!" $'$" ##!'!" "! "!! $" &'!" # "!#!&"!!#! "!* ) '" 收稿日期 编辑 王蔚 上海市垂体瘤研究中心在复旦大学附属华山医院成立 由复旦大学附属华山医院牵头 经市卫计委批准的一个专门针对垂体瘤的多学科合作新平台 上海市垂体瘤研究中心于 年 月 日在华山医院正式成立 研究中心首任主任为中国工程院院士 华山医院神经外科主任周良辅院士 副主任为华山医院神经外科李士其教授 中心内部按照专业设置细分成 个专业组 分别聘请著名专家学者担任组长和首席治疗专家 此外 中心还联合了 家高校科研院所的高端实验室平台 复旦大学医学神经生物学国家重点实验室 复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室 上海交通大学 3!* 中心 以深入开展相关的转化医学研究 增强上海医学界在国内外垂体瘤研究领域的学术竞争力 该研究中心成立后 将成为目前国内外临床规模最大的垂体瘤研究中心 通过研发诊疗新技术 建立垂体瘤多学科联合会诊平台 开展临床多中心研究和制定不同类型垂体瘤的诊治规范切实提高患者的临床疗效 华山医院神经外科为教育部国家重点学科 上海市 重中之重 临床医学中心 也是全球临床规模最大的神经外科中心 科研及临床水平居国内领先 国际先进 同时 该学科也是国内最早开展垂体瘤的临床诊疗和基础研究的单位之一 年手术量突破千例 居世界同类报道第一 建立了完善的垂体瘤临床资料数据库 血标本和肿瘤组织库 治疗效果获得国际广泛认可 华山医院内分泌科 瑞金医院内分泌科 妇产科医院生殖内分泌科和眼耳鼻喉科医院眼科等均已在各自的学科领域对垂体瘤及相关内分泌代谢疾病展开较深入的研究 其作为重要的合作单位加盟上海市垂体瘤研究中心 复旦大学附属华山医院

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