胃肠病学 2017 年第 22 卷第 3 期 139 cels,anditsmechanismisrelatedtotheregulationofcaspase 3andPARPexpresion. Keywords ColonicNeoplasms; Ras RelatedNuclearProte

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豁服赵
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1 138 论著 sirna 沉默 Ran 基因对结肠癌细胞株凋亡和 Caspase 3 PARP 表达的影响汪鑫耿蕾孙丽娜孙利慧卢瑗瑗王新第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室 (710032) 背景 : 结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一本课题组前期研究发现结肠癌特异性抗原类硫氧还蛋白 2 (Txl 2) 的亚型之一 Txl 2b 可与 Ras 相关核蛋白 (Ran) 相互作用, 但 Ran 在结肠癌发病过程中的作用和机制鲜有报道目的 : 以 RNA 干扰技术靶向沉默结肠癌细胞株 Ran 基因, 观察该方法对细胞凋亡和半胱天冬酶 3(caspase 3) 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (PARP) 表达的影响方法 : 设置 si 1 si 2 si 3 以及阴性对照 (NC) 组, 分别将终浓度为 nmol/L 的 Ran 小干扰 RNA(siRNA) 1 sirna 2 sirna 3 以及 NCsiRNA 转染结肠癌细胞株 HCT116 DLD 1 采用蛋白质印迹法检测 sirna 干扰效率以及 caspase 3 PARP 表达的变化 ; 采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况结果 :20nmol/LsiRNA 1 sirna 2 抑制 Ran 表达的效果最佳 si 1 组 HCT116 DLD 1 细胞的早期凋亡率较 NC 组显著增加 (19.37% ±7.57% 对 4.83% ±1.72%;16.53% ±3.38% 对 6.27% ±3.13%;P 均 <0.05) si 1 组 si 2 组 HCT116 DLD 1 细胞的晚期凋亡率较 NC 组显著增加 (15.97% ±3.31% 16.33% ±5.40% 对 6.40% ± 1.05%;22.93% ±1.57% 11.50% ±0.70% 对 6.20% ±0.98%;P 均 <0.05) si 1 组 si 2 组 DLD 1 细胞与 NC 组相比, 被切割的 caspase 3( 活性形式 ) 和被切割的 PARP( 非活性形式 ) 表达水平显著升高结论 : 沉默 Ran 基因能明显促进结肠癌细胞凋亡, 其机制与调控 caspase 3 PARP 表达有关关键词结肠肿瘤 ; Ras 相关核蛋白 ; RNA, 小分子干扰 ; 细胞凋亡 ; 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3; 聚 ADP 核糖聚合酶类 EfectofSilencingRanGenebysiRNA onapoptosisandexpresionsofcaspase 3andPARPinColonCancer CelLines WANGXin,GENGLei,SUN Lina,SUN Lihui,LU Yuanyuan,WANGXin.XijingHospitalofDigestive Diseases&StateKeyLaboratoryofCancerBiology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian(710032) Background:Coloncancerisoneofthecommonmalignanttumorsofdigestivesystem.Inourpreviousstudy,ithas beendemonstratedthatcoloncancerspecificantigenthioredoxinlike 2b(Txl 2b)caninteractwithRas relatednuclear protein(ran).however,therearefewreportsabouttheroleandmechanism ofranintumorigenesisofcoloncancer. Aims:ToinvestigatetheefectofRan targetingrna interferenceon apoptosisand expresionsofcaspase 3 and poly(adp ribose)polymerase(parp)incoloncancercellines.methods:20,40and60nmol/lsirna 1(si 1 group),sirna 2(si 2group),siRNA 3(si 3group)targetingtoRangeneandnormalcontrolsiRNA(NCgroup)were transfectedintocoloncancercellinehct116anddld 1,respectively.TheinterferenceeficiencyofsiRNAsand expresionsofcaspase 3andPARPweredetectedbyWesternbloting.Celapoptosiswasdeterminedbyflowcytometry. Results:20nmol/LsiRNA 1andsiRNA 2hadthebestefectoninhibitingexpresionofRan.Earlyapoptosisratesof HCT116andDLD 1celsinsi 1groupweresignificantlyhigherthanthoseinNCgroup(19.37% ±7.57% vs.4.83% ± 1.72%;16.53% ±3.38% vs.6.27% ±3.13%;Pal<0.05).LateapoptosisratesofHCT116andDLD 1celsinsi 1andsi 2groupsweresignificantlyhigherthanthoseinNCgroup(15.97% ±3.31%,16.33% ±5.40% vs.6.40% ± 1.05%;22.93% ±1.57%,11.50% ±0.70% vs.6.20% ±0.98%;Pal<0.05).ComparedwithNCgroup, expresionsofcleavedcaspase 3(activeform)andcleavedPARP(inactiveform)weresignificantlyincreasedinDLD 1 celsofsi 1andsi 2groups.Conclusions:SilencingRangenecansignificantlypromotetheapoptosisofcoloncancer DOI: /j.isn 基金项目 : 国家自然科学基金 ( )

2 胃肠病学 2017 年第 22 卷第 3 期 139 cels,anditsmechanismisrelatedtotheregulationofcaspase 3andPARPexpresion. Keywords ColonicNeoplasms; Ras RelatedNuclearProtein; RNA,SmalInterfering; Apoptosis; Caspase3; Poly(ADP ribose)polymerases 结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一, 发病 [1] 机制尚未完全明确本课题组前期研究采用分离自结肠癌转移淋巴结的癌细胞免疫 BALB/c 小鼠, 以淋巴细胞杂交瘤技术制备了一组抗结肠癌单克隆抗体, 命名为结肠癌单克隆抗体 (monoclonal antibodies,mcs) 系列其中,MC3 所识别的抗原 MC3 Ag 在结肠癌组织中的阳性率达 90% 以上 [2], 且表达水平与结肠癌 TNM 分期肿瘤转移密切相关 [3] 其后本课题组进一步采用蛋白质组学研究方法鉴定并验证了 MC3 Ag 为硫氧还蛋白家族新成员类硫氧还蛋白 2(thioredoxinlike 2,Txl 2) [4] Txl 2b 是 Txl 2 的一种亚型 [5], 酵母双杂交和免疫共沉淀实验结果表明,Txl 2b 可与 Ras 相关核蛋白 (Ras relatednuclearprotein,ran) 相互作用 [6] Ran 为 Ras 超家族成员, 是细胞中含量最丰富的小 G 蛋白, 相对分子质量为 25kDa(1Da=0.9921u) Ran 具有两种形式, 即 GDP 状态下的非活性形式和 GTP 状态下的活性形式 [7] Ran 在生物体基本生理过程中发挥重要作用, 如在分裂间期调节大分子物质的核质转运 [8] 在分裂前期促进纺锤体形成在 [9] 分裂末期参与核膜再组装等近年研究指出, Ran 在诸多恶性肿瘤中呈高表达, 包括结直肠癌 [10] 胰腺癌 [11] 胃癌 [12] 乳腺癌 [13] 卵巢癌 [14] 神经母细胞瘤 [15] [16] 非小细胞肺癌等, 且与肿瘤的恶性表型和不良预后密切相关, 可促进肿瘤细胞增殖 [11] 侵袭和转移 [17] [13], 抑制肿瘤细胞凋亡等然而, 目前尚无研究证实 Ran 是否影响结肠癌细胞凋亡本研究通过合成 Ran 特异性小干扰 RNA (sirna) 抑制结肠癌细胞 Ran 表达, 旨在探讨 Ran 对结肠癌细胞凋亡的影响材料与方法一细胞株和主要试剂结肠癌细胞株 HCT116 DLD 1(ATCC 细胞库 ) DMEM 培养基 0.25% EDTA 胰蛋白酶胎牛血清 Opti MEM TM 无血清培养基 (Gibco 公司 ); DharmaFECT TM 1 转染试剂 (GEHealthcare 公司 ); sirna 寡核苷酸 ( 上海吉玛制药技术有限公司 ); RIPA 细胞裂解液 ( 碧云天生物技术研究所 );BCA 蛋白定量试剂盒 (Thermo 公司 );Ran 单克隆抗体 AnnexinV FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 (BD Biosciences 公司 ); 半胱天冬酶 3(caspase 3) 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (PARP) GAPDH 单克隆抗体 (CelSignalingTechnology 公司 );β actin 单克隆抗体 (Sigma 公司 ); 山羊抗鼠抗兔 HRP 标记 IgG 抗体 ( 北京中杉金桥生物技术有限公司 ) 二方法 1. 细胞培养 :HCT116 DLD 1 细胞培养于含 10% 胎牛血清 1% 青霉素链霉素双抗的 DMEM 培养基中, 置于 37 5% CO 2 培养箱培养 2.siRNA 转染 : 取对数生长期 HCT116 DLD 1 细胞接种至 6 孔板, 以含 10% 胎牛血清 1% 青霉素链霉素双抗的 DMEM 培养基培养第 2d 待细胞贴壁且密度达到 30% 时, 每孔更换为 1600μLOpti MEM TM 无血清培养基设置 si 1 si 2 si 3 以及阴性对照 (NC) 组, 分别将终浓度为 nmol/L 的三种不同序列片段的 RansiRNA(siRNA 1 sirna 2 sirna 3) 以及 NCsiRNA( 表 1) 与 200μLOpti MEM TM 无血清培养基混合将 5μLDharmaFECT TM 1 转染试剂与 200μLOpti MEM TM 无血清培养基混合, 室温孵育 5min 将稀释后的 sirna 与稀释后的 DharmaFECT TM 1 转染试剂混合, 室温孵育 20min 每孔加入 400μLsiRNA 与 DharmaFECT TM 1 转染试剂混合液混匀,24h 后更换为完全培养基,72h 后收集细胞进行后续实验 sirna sirna 1 sirna 2 sirna 3 NCsiRNA 表 1 3 种 RansiRNA 和 NCsiRNA 序列信息核苷酸序列 5 CGUCAUUUGACUGGUGAAUTT 3 5 GAGUUACUUACAAGAAUGUTT 3 5 GGAGACCCUAACUUGGAAUTT 3 5 UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3 3. 蛋白质印迹法检测 sirna 干扰效率 : 收集细胞, 提取总蛋白行蛋白定量, 变性, 行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜, 非特异封闭, 加入 Ran 单克隆抗体 ( 滴度 )4 孵育过夜, 洗膜后加入二抗

140 ( 滴度 1 4000), 室温孵育,ECL 显影, 灰度分析, 筛选最佳 sirna 干扰序列实验重复 3 次 4. 流式细胞仪检测细胞凋亡 : 将筛选出的 sirna 序列按优化浓度再次转染 HCT116 DLD 1 细胞 ( 实验步骤同前 ),72h 后离心消化,PBS 清洗 2 遍, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况, 操作步骤参照试剂盒说明书实验重复 3 次 5.

0 统计软件, 计量资料以 x±s 珋表示, 两组间均数的比较采用两独立样本 t 检验 ; 多组间均数的比较采用单因素方差分析, 多重比较采用 Dunnet t 检验 P<0.

3 140 ( 滴度 ), 室温孵育,ECL 显影, 灰度分析, 筛选最佳 sirna 干扰序列实验重复 3 次 4. 流式细胞仪检测细胞凋亡 : 将筛选出的 sirna 序列按优化浓度再次转染 HCT116 DLD 1 细胞 ( 实验步骤同前 ),72h 后离心消化,PBS 清洗 2 遍, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况, 操作步骤参照试剂盒说明书实验重复 3 次 5. 蛋白质印迹法检测 caspase 3 PARP 表达变化 : 将筛选出的 sirna 序列按优化浓度再次转染 DLD 1 细胞 ( 实验步骤同前 ),72h 后离心消化, 收集细胞提取总蛋白, 以蛋白质印迹法检测 caspase 3 PARP 表达 ( 实验步骤同前 ) 三统计学分析应用 SPSS17.0 统计软件, 计量资料以 x±s 珋表示, 两组间均数的比较采用两独立样本 t 检验 ; 多组间均数的比较采用单因素方差分析, 多重比较采用 Dunnet t 检验 P<0.05 为差异有统计学意义结果一 RansiRNA 对 HCT116 DLD 1 细胞 Ran 表达的抑制效率 sirna 转染 HCT116 DLD 1 细胞后, nmol/Lsi 1 si 2 si 3 组的 Ran 蛋白表达水平均显著低于 NC 组 (P<0.05), 其中以 20nmol/Lsi 1 si 2 组的抑制效果最佳, 抑制率均 >50%, 显著高于其他浓度组以及 si 3 组 (P 均 <0.01)( 图 1 图 2) 故选择 20nmol/LsiRNA 1 sirna 2 进行后续实验二 RansiRNA 对 HCT116 DLD 1 细胞凋亡的影响 NC 组 si 1 组 si 2 组 HCT116 细胞早期凋亡率分别为 4.83% ±1.72% 19.37% ±7.57% 和 21.10% ±13.46%,si 1 组早期凋亡率较 NC 组显著增加 (P<0.05); 三组晚期凋亡率分别为 6.40% ± 1.05% 15.97% ±3.31% 和 16.33% ±5.40%,si 1 组 si 2 组晚期凋亡率均较 NC 组显著增加 (P< 0.05)( 图 3) NC 组 si 1 组 si 2 组 DLD 1 细胞早期凋亡率分别为 6.27% ±3.13% 16.53% ±3.38% 和 10.57% ±0.85%,si 1 组早期凋亡率较 NC 组显著增加 (P<0.05); 三组晚期凋亡率分别为 6.20% ± 0.98% 22.93% ±1.57% 和 11.50% ±0.70%,si 1 组 si 2 组晚期凋亡率均较 NC 组显著增加 (P< 0.01)( 图 4) 三 RansiRNA 对 DLD 1 细胞 caspase 3 PARP 表达的影响 si 1 组 si 2 组 DLD 1 细胞与 NC 组相比, 未被切割的 caspase 3( 非活性形式, 位于 35kDa 处 ) 表达无明显变化, 被切割的 caspase 3( 活性形式, 位于图 1 HCT116 细胞中 3 种 RansiRNA 对 Ran 表达的抑制效率 ( 蛋白质印迹法 ) 图 2 DLD 1 细胞中 3 种 RansiRNA 对 Ran 表达的抑制效率 ( 蛋白质印迹法 )

胃肠病学 2017 年第 22 卷第 3 期 141 图 3 RansiRNA 对 HCT116 细胞凋亡的影响 ( 流式细胞分析 ), P<0.

图 5 RansiRNA 对 DLD 1 细胞 caspase 3 PARP 蛋白表达的影响 ( 蛋白质印迹法 ) 讨论细胞凋亡涉及一系列基因的激活和表达调控 Caspases 家族是细胞凋亡过程中的关键元件, 其激活和异常表达均可引起细胞凋亡 Caspases 家族成员按其在凋亡中发挥的作用可分为启动型效应型和炎症型三种类型 Caspase 3 属于效应型, 正常情况下,

修复基因完整性有关, 是 caspase 3 最主要的切割底物细胞凋亡发生时,PARP 被剪切成小片段, 不能发挥正常功能, 导致 DNA 裂解, 细胞凋亡 [18] 本研究结果表明, 以 sirna 抑制 Ran 表达后, 结肠癌细胞株 HCT116 DLD 1 细胞凋亡明显增多 ; 进一步的研究发现, 细胞中被切割的 caspase 3 和被切割的 PARP

4 胃肠病学 2017 年第 22 卷第 3 期 141 图 3 RansiRNA 对 HCT116 细胞凋亡的影响 ( 流式细胞分析 ), P<0.001 图 4 RansiRNA 对 DLD 1 细胞凋亡的影响 ( 流式细胞分析 ) 17kDa 和 19kDa 处 ) 表达水平显著升高 si 1 组 si 2 组 DLD 1 细胞与 NC 组相比, 未被切割的 PARP ( 活性形式, 位于 116kDa 处 ) 表达有所下降, 被切割的 PARP( 非活性形式, 位于 89kDa 处 ) 表达水平显著升高 ( 图 5) 图 5 RansiRNA 对 DLD 1 细胞 caspase 3 PARP 蛋白表达的影响 ( 蛋白质印迹法 ) 讨论细胞凋亡涉及一系列基因的激活和表达调控 Caspases 家族是细胞凋亡过程中的关键元件, 其激活和异常表达均可引起细胞凋亡 Caspases 家族成员按其在凋亡中发挥的作用可分为启动型效应型和炎症型三种类型 Caspase 3 属于效应型, 正常情况下, 胞质中的 caspase 3 以无活性的酶原形式存在, 当细胞发生凋亡时,caspase 3 被启动型 caspases 切割成小片段, 成为有活性的 caspase 3, 进而剪切细胞骨架蛋白和核蛋白, 如 PARP DNA 裂解因子 (DNA fragmentationfactor,dff) 核纤层蛋白 A(laminA) 等 PARP 属于 DNA 修复酶, 与 DNA 修复基因完整性有关, 是 caspase 3 最主要的切割底物细胞凋亡发生时,PARP 被剪切成小片段, 不能发挥正常功能, 导致 DNA 裂解, 细胞凋亡 [18] 本研究结果表明, 以 sirna 抑制 Ran 表达后, 结肠癌细胞株 HCT116 DLD 1 细胞凋亡明显增多 ; 进一步的研究发现, 细胞中被切割的 caspase 3 和被切割的 PARP 表达水平均显著升高, 提示抑制 Ran 表达可通过诱导 caspase 3 活化和 PARP 失活促进结肠癌细胞发生凋亡目前关于下调 Ran 引起细胞凋亡的机制尚未 [13] 明确, 相关研究数量有限 Yuen 等的研究发现, 快速生长的肿瘤细胞在 Ran 下调后更易发生凋亡, 可能与 PI3K/Akt/mTORC1 Ras/MEK/ERK 通路激活有关 Ran 下调可影响细胞的核质转运过程, 导致转录因子核质定位异常, 进而影响特定基因的转录和表达, 最终导致肿瘤细胞恶性表型发生 Schnepp [15] 等的研究表明,LIN28B 可作为 RanmRNA 的结合蛋白促进 Ran 转录和翻译, 进而引起肿瘤细胞功能改

5 142 [19] 变此外,Guvenc 等的研究发现,Ran 对细胞凋亡的调控机制与存活素 (survivin) 表达下调有关, survivin 表达下调可导致凋亡抑制蛋白表达下调, 促进 caspase 3 激活, 从而引起细胞凋亡综上所述, 本研究结果显示, 沉默 Ran 基因可通过诱导 caspase 3 活化和 PARP 失活促进结肠癌细胞发生凋亡这一发现为临床治疗结肠癌提供了新思路, 但下调 Ran 引起肿瘤细胞凋亡的调控机制仍需进一步研究参考文献 1 樊代明, 张学庸, 陈希陶, 等. 结肠癌单克隆抗体 MC 的制备及其相应抗原免疫组化定位的研究 [J]. 细胞与分子免疫学杂志,1986(3): 樊代明, 张学庸, 陈希陶, 等. 抗结肠癌细胞单克隆抗体的制备及相应抗原免疫组化鉴定 [J]. 第四军医大学学报,1988,9(2): He FT, Nie YZ, Chen BJ, etal. Expresion and identificationofrecombinantsolublesingle chainvariable fragmentofmonoclonalantibody MC3[J]. World J Gastroenterol,2002,8(2): Lu Y, Wang X, Liu Z, etal. Identification and distributionofthioredoxin like2 astheantigen forthe monoclonalantibodymc3specifictocolorectalcancer[j]. Proteomics,2008,8(11): Sadek CM, Jiménez A, Damdimopoulos AE, etal. Characterization ofhuman thioredoxin like2. A novel microtubule bindingthioredoxinexpresedpredominantlyin theciliaoflungairwayepitheliumandspermatidmanchete andaxoneme[j]. JBiolChem, 2003, 278 (15): LuY,ZhaoX,LiK,etal.Thioredoxin likeprotein2is overexpresedincoloncancerandpromotescancercel metastasisbyinteractionwithran[j].antioxidredox Signal,2013,19(9): MatsuuraY.Mechanisticinsightsfrom structuralanalyses ofran GTPase drivennuclearexportofproteinsandrnas [J].JMolBiol,2016,428(10PtA): LuiK, Huang Y. RanGTPase: A key regulator of nucleocytoplasmictraficking[j]. MolCelPharmacol, 2009,1(3): KalabP,HealdR.TheRanGTPgradient agpsforthe mitoticspindle[j].jcelsci,2008,121(pt10): FanH,LuY,QinH,etal.HighRanleveliscorelated withpoorprognosisinpatientswithcolorectalcancer[j]. IntJClinOncol,2013,18(5): DengL, Lu Y, ZhaoX, etal. Ran GTPaseprotein promotes human pancreatic cancer proliferation by deregulatingthe expresion ofsurvivin and celcycle proteins[j].biochem BiophysResCommun,2013,440 (2): 范红伟, 卢瑗瑗, 吴琼, 等.Ran 在胃癌中的表达及其临床意义 [J]. 现代生物医学进展,2012,12 (8): YuenHF,ChanKK,GrilsC,etal.Ranisapotential therapeutictargetforcancercelswithmolecularchanges asociatedwithactivationofthepi3k/akt/mtorc1and Ras/MEK/ERKpathways[J].ClinCancerRes,2012,18 (2): Cáceres GoritiKY,CarmonaE,BarèsV,etal.RAN nucleo cytoplasmictransportandmitoticspindleasembly partnersxpo7andtpx2arenewprognosticbiomarkersin serousepithelialovariancancer[j].plosone,2014,9 (3):e SchneppRW,KhuranaP,AtiyehEF,etal.ALIN28B RAN AURKA SignalingNetworkPromotesNeuroblastoma Tumorigenesis[J].CancerCel,2015,28(5): NingJ,LiuW,ZhangJ,etal.RanGTPaseinducesEMT andenhancesinvasioninnon smalcellungcancercels throughactivationofpi3k AKTpathway[J].OncolRes, 2013,21(2): DengL,ShangY,GuoS,etal.RanGTPaseprotein promotesmetastasisandinvasioninpancreaticcancerby deregulatingtheexpresionofarandcxcr4[j].cancer BiolTher,2014,15(8): BudihardjoI,OliverH,LuterM,etal.Biochemical pathwaysofcaspaseactivationduringapoptosis[j].annu RevCelDevBiol,1999,15: GuvencH,PavlyukovMS,JoshiK,etal.Impairmentof gliomastemcelsurvivalandgrowthbyanovelinhibitorfor Survivin Ranproteincomplex[J].ClinCancerRes,2013, 19(3): ( 收稿 ; 修回 )