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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 对胃癌 细胞合成及分泌炎症因子的影响 师阿盟 史海涛 董 蕾 许绍娴 郭晓燕 王 婷 西安交通大学第二附属医院消化内科 陕西省胃肠动力疾病研究重点实验室 陕西省胃肠疾病临床研究中心 陕西西安 # 摘要 目的 探讨 $%&' 对胃癌 $' 细胞合成及分泌炎症因子的影响及其机制 方法 采用 的 () 慢病毒表达载体感染人胃癌 $' 细胞 "*+',-". 及 /""0 +1 检测 -() 和蛋白表达 应用 $%&' 干预 分为 # 组 阴性对照组 '()'('()'($%&' 组 沉默组 '()' '()'$%&' 组 采用 "*+',-". 检测炎症因子 (&'' '' 的 -() 表达 采用 2$) 检测细胞上清液 (&'' '' 的蛋白含量 采用 /""0 +1 检测 (&'3 通路的变化 结果 "*+',-". 及 /""0 +1 结果提示 沉默组 $' 细胞 -() 及蛋白的表达水平较阴性对照组显著降低 均 阴性对照组与空白对照组间无明显差异 与 '()'( 组相比 '()' ($%&' 组 ' 及 ' 的 -() 表达及分泌明显增加 '()' 组 ' 及 '-() 表达及分泌减少 4 与 '()'($%&' 组相比 '()'$%&' 组 ' 及 ' -() 表达及分泌明显减少 而 (&' 及 ' 的 -() 表达及分泌在 # 组间无明显差异 (&'34 核内表达 '3 及 '3 表达在 # 组间均无明显差异 结论 $%&' 可能通过 促进 $' 细胞合成及分泌炎症因子 ' 及 ' 但不依赖于 (&'3 通路 关键词 胃癌 趋化因子受体 基质细胞衍生因子 '$%&' 炎症因子 (&'3 中图分类号 4 文献标志码 ) 4!""#$#%&''&!"!"$##!$ &#!$"#$#(&!$ &# % $5)'-"6$55*,'*1%7(",8$*1',* 87,*1'* /)(,6 %"*0-"19*01""01+16"$"1 )9,+,*"51,*+19,:* ;,*11 68,"0, $**,"*10*1019*01,",*+1,+,%,10"0$**,+,,*+ ""*0""019*01,",*+%,"*",:* #,* )*+)+#$()) #*" ####$+#&($+#,#"- ('. #"/0(,"#" 1-"()(&, 0,%('.'%('.'$%('.("%('.($ 0&()(,""#)('./0'"&$.," "#0'"#0&1-," "#0/0'0, & #$+#,(('. #"# "#"/0(-)('."0 && )0",%('.'0 ")('./0"0 #0,#" %('.'$0 &""#" %('. (0 &4&)0",%('.'$0 /0" 收稿日期 4 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 '& 国家星火计划项目 '&+.4 西安交通大学第二附属医院院基金 '& 2'4# $00"- ''$##"'&'$0*) '&+.4 ""$#"."30 '&2'4#& 通讯作者 董蕾 &)"44&#) 优先出版 0,,,&#*&*#)"&&(&&&&)!"!

2 期 师阿盟 史海涛 董 蕾 等 $%&' 对胃癌 $' 细胞合成及分泌炎症因子的影响 4 )('."0#0,# #",%('.($ 0 &&3,/0'" )('. "0# 0,# #"- $"(('.& 0/0#' 04"0/-"#"#)0& $( #0)"#)) #*"###$+# '"0"0, &,-. ### ($)) #*' 炎症是生物体抵御外来病原体入侵的重要的保护机制 越来越多的证据表明炎症与肿瘤也具有密切的关系 炎症微环境在肿瘤的发生 发展及恶性转化 中均具有重要的作用 胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤 幽门螺杆菌 5"+,1*"0+10,5 引起的慢性炎症是胃癌发病的一个重要原因 众多研究表明 5 感染引起的炎症因子 如肿瘤坏死因子 '!-10 "01,9*10'(&' 白介素 ',"0' +"!,' ' 白介素 ',"0+"!,'' 白介素 ',"0+"!,'' 一氧化氮,0,1," (7 环氧合酶 '+116"*"7' 及氧自 由基等的释放均与胃癌的发生及进展有关 趋化因子及其受体在感染 炎症 组织损伤及恶性肿瘤等疾病中发挥重要作用 趋化因子通过结合其受体 不仅可以直接调节肿瘤的生长 凋亡及转移 还可通过释放血管生成因子 炎症因子并诱导白细胞迁移 在肿瘤周围形成炎症微环境 为肿瘤细胞的生长和进展创造有利条件 趋化因子配体 "-1,"'' -1,9+,6* 又称为基质细胞衍生因子 '01-*+"+'"0,"9*10'$%&' 和它的受体 趋化因子受体 #"-1,"'' -1,9 0""10## 及 趋化因子受体 "-1',"'' -1,90""10 是目前研究最多的趋化因子 受体之一 研究已发现其在包括肝癌 结肠癌 肺癌 乳腺癌 前列腺癌等多种恶性肿瘤 的生长 转移及预后中发挥重要作用 $%&'' # 生物轴参与胃癌的发生及进展已有较多研 # 究 而 在胃癌中的作用尚不完全清楚 前期研究发现 在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织 且在 $' 细胞中呈高表达 提示其 4 在胃癌发生发展中具有重要作用 本研究主要探讨 $%&' 对胃癌 $' 细胞炎症通路的影响 旨在从炎症角度阐明 在胃癌中的作用 为胃癌的诊断及防治提供新的靶点 材料与方法 / 主要试剂 重组人 $%&'% 美国.#5+1" 美国 胎牛血清 &3$ 杭州四季青有限公司 中国 %$7$,6-* 美国 () &* 上海飞捷生物有限公司 中国 %' () 逆转录试剂盒 *** 日本 $3.0"-, 2*** 日本 兔抗人 抗体.01"," 美国 鼠抗人 '*, $**0!< 美国 兔抗人 *-, 3 抗体 3,110+ 美国 兔抗人 (&'34'3 及 '3 抗体 $ 美国 5. 标记山羊抗兔 山羊抗鼠二抗 $ 美国 2$) 试剂盒 % 美国 慢病毒载体 根据 " 3* 中的人 基因的核苷酸序列 ( 设计 条,() 靶点序列,()'4=')' ))))'=,()'4='' ))'= 由赛业生物科技公司 *6" 美国 合成 () 以 ",'!01' 8'"&. 为载体包装慢病毒 另外还包装一个阴性对照慢病毒 /0 细胞培养及慢病毒感染 实验所用 $' 中分化腺癌细胞购自中科院上海细胞库 由西安交通大学医学院中心实验室保存 胃癌细胞于含 -&3$ 的.# 培养基中 置于 > 含 4-7 饱和湿度培养箱中培养 取对数生长期细胞分为 # 组 空白对照组 101+ 不予任何处理 阴性对照组 '()'( 采用阴性对照慢病毒感染细胞 实验组 采用 的 () 慢病毒表达载体感染细胞 分为 '()'' 组及 '()'' 组 感染前 将细胞接种于 孔细胞培养板 待细胞长至 4? 密度时根据 7 值加入相应的病毒液和 1+0"" 观察细胞状态 如无明显变化 # 更换新鲜培养基 培养 后 在荧光显微镜下检测感染率 提取细胞总 () 及蛋白 采用 "*+',-". 检测 -() 表达 采用 /""0 +1 检测 蛋白表达 将 沉默效率较高的一株细胞及阴性对照细胞应用 6- 的嘌呤霉素进行筛选 维持扩大培养 '()'( 和 '()' 稳定感染细胞应用 $%&' 6- 干预 实验分为 # 组 '()'('()'($%&'' ()' 和 '()'$%&' 组!"!

3 西安交通大学学报 医学版 第 卷 /1.!#%"! 检测 *!* 及 * 的表达 按蛋白提取试剂盒操作说明分别提取核蛋白及总蛋白 加上样缓冲液 在聚丙稀酰胺凝胶中电泳 将蛋白电转移至.%& 膜上 46 脱脂奶粉封闭后分别与抗 '*, 抗 抗 *-, 3 抗 (&'3 抗 '3 抗 3 多克隆抗体孵育 再与相应二抗反应 阳性条带用化学发光法检测 结果用 "+'01 分析软件进行分析 计算目的蛋白与相应内参的吸光度比值 /&%!$'2 检测 +3 3 及 34') 的表达 采用 &* 试剂盒提取细胞总 () 按照 *** 逆转录试剂盒操作说明合成 %() 以 (3" 3* 中提供的基因序列行 (&'' '' 及 '*, 的引物设计 由北京奥科生物工程有限公司合成 表 "*+',-". 反应体系包括模板 %() 上游引物 下游引物 $3.0"-, 2 7 "9"0"" %" # 5 7 置于荧光定量. 仪中进行扩增 反应条件为 预变性 4>. 反应 4> 4 > 共 # 个循环 融解 4> 4 > -, 4> 4 *@ A 内参基因 * 分别代表两组样本 其中 代表阴性对照组 为根据扩增曲线确定的扩增循环数 表 &%!$'2 所用基因引物序列 *.0,-"0"B!""910"*+',-". 基因序列基因序列号 '*, (&' ' ' ' 上游 4='))))))))'= 下游 4='))))))))'= 上游 4=')))))))'= 下游 4='))))'= 上游 4=')))'= 下游 4='))'= 上游 4=')))))))'= 下游 4='))))))'= 上游 4='))))))))'= 下游 4='))))))'= 上游 4='))))'= 下游 4=')))))'= ( ( (4# (4 (# (4# /3) 法检测细胞上清 +3 3 及 34 蛋白的含量 胃癌细胞接种于 孔板 按分组处理 # 后 终止培养 收集细胞培养液上清 0-, 离心 4-, 收集上清 按照试剂盒说明书进行操作 检测蛋白含量 / 统计学分析 所有数据采用 $.$$ 统计软 件进行分析 数据采用均数 C 标准差 C 表示 多个独立组比较采用单因素方差分析 组间比较采用 $%' 检验 4 为差异有统计学意义 0 结 果 0/35) 对胃癌 细胞 表达的影响 '()'''()' ' 感染后 $' 细胞内 -() 及蛋白水平均较阴性对照组明显降低 差异有统计学意义 均 其中 '()'' 组的 -() 及蛋白水平下降较明显 在后续的实验中使用 '()'' 稳定感染的 $' 细胞 图 空白对照组与阴性对照组的 表达无明显差异 0/0 对胃癌细胞内 +3 3 及 34 的 ') 表达及分泌的影响 与 ' ()'( 组相比 '()'($%&' 组的 ' 及 ' 的 -() 表达及分泌明显增加 '()' 组的 ' 及 '-() 表达及分泌明显减少 4 与 '()'( $%&' 组相比 '()'$%&' 组的 ' 及 ' -() 表达及分泌明显减少 而 (&' 及 ' 的 -() 表达及分泌在 # 组间无明显差异 图 表 0/1 对胃癌细胞内 * 通路的影响 由图 可以看出 # 组之间 (&'34 核内表达 '3 及 '3 表达均无明显差异 提示 $%&' 及 对 (&'3 通路的活化无明显影响 1 讨 论 近年来 慢性炎症与胃癌的关系已成为研究热点之一 大量研究证实 胃癌患者的组织及血清中存在炎性因子的释放 包括 (&'' ' 及 ' 这些炎症因子导致慢性炎症的持续存在 在启动 维 ' 持及促进胃癌生长中发挥重要作用 (&' 可以诱导细胞生长 分化 抑制细胞凋亡 同时可以促进炎症细胞浸润 血管生成 肿瘤细胞侵袭及迁移 ' 是一种前炎性细胞因子 可以抑制 4 的表达 促进癌细胞侵袭 血管生成 诱导粘附因子及其他炎症因子的作用 ' 能够促进细胞的增殖和分化 与肿瘤浸润 血管生成密切相关 ' 具有促进细胞黏附 迁移 血管生成等作用 (&'3 是联系炎症反应与癌症的重要中介分子 (&'3 通路在静息状态下 3' 与 (&'344 两个亚单位以无活性状态存在于细胞质中 当外界刺激激活 3 激酶复合体!"!

4 期 师阿盟 史海涛 董 蕾 等 $%&' 对胃癌 $' 细胞合成及分泌炎症因子的影响 图 ) 对胃癌细胞内 ') 及蛋白表达的影响 &,629"19'()1 -()*01", "0",119, 6*0,*"0"+ ) 慢病毒感染细胞 后的荧光图 3 的蛋白表达 % 的 -() 表达 与 '()'( 比较 表 0 对胃癌细胞培养上清 +3 3 及 34 蛋白水平的影响 *29"19$%&'1 01", +""+19(&'' '*', "!+!0"!"0**196*0,*"0 "+ C 0 ) 炎性因子 '()'( '()'($%&' '()' '()'$%&' (&' 4C 4C 444C 4C ' #C# 4C 4C4 #4C# ' C# C #C4 4C ' C 4C C# 4C 与 '()'( 比较 4 与 '()'($%&' 比较 图 0 对胃癌细胞内 +3 3 及 34 的 ') 表达的影响 &,629"19$%&'1 -()"0",119 (&'' '*', 6*0,*"0"+ 与 '()'( 比较 4 与 '()' ($%&' 比较 图 1 对胃癌细胞内 * 信号通路的影响 &,629"19$%&'1 (&'3,6*+,6*' *, 6*0,*"0"+ )'()'( 组 3'()'($%&' 组 '' ()' 组 %'()'$%&' 组!"!

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷 3,*" 后 活化的 会泛素化 磷酸化并降解 3' 使得 (&'3 两个亚单位从失活状态活化 并从细胞质转移到细胞核内 尤其是 4 亚单位 调控 (&'' '' 活性氧 7' 等炎症因子的合成 这些细胞因子在肿瘤周围形成的 微环境促进肿瘤的进一步发展 是近年新发现的除 # 以外 $%&' 的另一受体 多项研究已发现 在多种肿瘤组织及细胞中高表达 并参与肿瘤的发生 发展等生物学行为 并与肿瘤的预后密切相关 目前关于 ' 与胃癌的研究较少 国外尚未见报道 国内许 ' 统俭 张娜等发现 在胃癌组织中的表达明显高于正常胃组织 且与肿瘤直径 浸润深度 淋巴结转移和临床分期有关 同时还发现 与促肿瘤生长及血管生成相关因子 如与 5&' 2& 等的表达呈正相关 关于 在胃癌发 生发展中的机制研究同样较少 王隽等采用重组腺病毒技术靶向沉默 ' 胃癌细胞中 的表达 发现其可抑制细胞的增殖和迁移活性 并可 通过 **"' 促进胃癌细胞凋亡 赵东文等采用慢病毒介导的 '() 转染人胃癌细胞株 $' 后发现细胞增殖能力明显减低 综上所述 作为 $%&' 的另一新受体 在胃癌中的研究仍处于起步阶段 本课题组前期研究发现 ' 在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织 但与其分化程度无关 不同分化程度胃癌细胞之间 ' 表达有差异 在中分化腺癌细胞系 $' 中表达最高 但 $%&' 及 与胃癌局部炎症微环境的关系尚未见研究 研究表明 肿瘤细胞的迁移和炎性细胞一样 受到趋化因子及其受体的调控 肿瘤微环境中的炎性细胞因子可以通过上调癌细胞上趋化因子受体的表达 #'4 从而提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力 同样 趋化因子及趋化因子受体也可通过促进炎性细胞因子分泌 促进肿瘤细胞的恶性生长及侵袭 )( 等发现 $%&'# 可通过激活下游信号通路包括 2.)(&'3 等促进口腔鳞癌细 胞 ' 的合成及分泌 D5)( 等发现 $%&' # 激活 &)') 及 2 通路增加胰腺癌细胞 '' 的表达及分泌 进而抑制胰腺癌细胞 凋亡 /)( 等研究表明 $%&' 可促进前列腺癌中 ' 及 2& 的分泌 但目前关于趋化因子 $%&' 对胃癌细胞炎症微环境的影响 以及 是否介导这种作用尚未见研究报道 本研究主要探讨 $%&' 对胃癌细胞合 成及分泌炎症因子 (&'' ' 和 ' 的影响以及 (&'3 信号通路在其中的作用 结果发现 $%&' 可明显促进 '' 的合成及分泌 但对 (&' 及 ' 无明显影响 且这种作用不依赖于 (&'3 通路 $%&' 促炎症因子合成分泌的作用可能是其促进胃癌进展的机制之一 本研究结果为进一步阐明 在胃癌中的作用提供了新的实验依据 但 $%&' 对 '' 合成及分泌的促进作用是否与 2 及.) 等其他信号通路有关 以及这种促炎作用如何介导胃癌细胞的恶性行为还需要深入的研究 参考文献 +(%''45%$+(' (4.('!&)) ))"##&#& 4.53!& )#,*" ))$'#-#0#0 ##"####&# & $' 3'+ +3.5!&(# (#)*/"##0&#! (#& #35&(#/" ##)0####&330 44& 4 师阿盟 董蕾 史海涛 等 & 趋化因子受体 在胃癌组织及细胞中的表达及意义 & 南方医科大学学报 ## #& ('.'$%5('.5..& )"))##"0) &5#(444#& 4435'.&3#-#0" *###&1"+ #4& ''(.3 4.('!&)) )##, ' )#)*&')) 4& 许统俭 符炜 徐为 等 &( 与 %+ 在胃癌组织中的表达及临床意义 & 江苏医药 4#4& 张娜 辛琪 杨艳 等 & 胃癌组织 (3 及 %+ 的表达及意义 & 山东医药 & 张娜 辛琪 杨艳 等 &( 对胃癌生长 黏附及侵袭的影响 & 天津医药 ##& 王隽 符炜 & 重组腺病毒 (('. 对人胃癌细胞增殖及迁移的影响 & 徐州医学院学报 & 赵东文 李谌 王海龙 等 & 慢病毒载体介导的 (('. 联合重楼总皂苷对胃癌细胞 $+ 特异性靶向干预的实验研究 & 中国生化药物杂志 ##4& 下转第 # 页!"!

6 期 张晓威 吕 梦 冯华夷 等 $)5) 对胃癌 ' 细胞增殖与周期及凋亡的影响 # )&)- '##4 ## &!!45'+4.' 1$&3"# 000)6 )## "#) 0/)&)4###&!$+(5%..5'.((.5+3& #0###&'(# 444&.'+ +!1.'+ 3$73.'+ &3"# -"# 0)# ) 0###0& #) 0.#& 庄涵虚 &('. 干扰沉默胃癌 3. 基因表达的实验研究 & 福建 福建医科大学 & $3$3.(!..1 3& #"#) # -) ($"0" "-.4# "#"- 0) #0!.4"(4"0"0, &)4 #& 4.1.!.. '3'45( 3&$-" "/)##" $.3.00 ##)# )0)#&" & # 聂建云 刘馨 金从国 等 & 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌细胞株! 增殖周期的影响 & 中国综合临床 4 &#) 0()) & ' 2&.#)0# ##,* ""#&+4#& 邹琛 周俊 陆国平 & 组蛋白去乙酰化酶抑制剂与细胞周期和凋亡关系的研究进展 & 中国病理生理杂志 # #&.. 4.$+..$&(-# 0##"" &$-##)#& $(!&#0)#'. ))" )"#)0&'( +# & 白娟 刘继彦 郑玲 & 组蛋白去乙酰化酶抑制抗肿瘤的研究进展 & 现代肿瘤医学 #& +577'.(5%. 5$.(. & " "##" ##) 0-# #-"# #) "*)-&#(# 44& $$5 53$!&00 ##0"0&#( #& #+.3( $.. $'+( &! #& # "# )##&' 4 15'.&!#)#)$. +#& 3.0##")/ 4 韩艳 张美花 金铁峰 等 &3. 和 3. 蛋白过表达在卵!-###&!"$# 巢浆液性癌中的临床病理学意义 & 临床与实验病理学杂志 & ##& '53 $&#0 -,)" 编辑 国 荣 "## " +! 上接第 页 $)(#(4" '*0 #73 3.' &)# 00,"0)#) #0, #) ###&###& *#0#/0 -)#"#" - 73.' '&#$ )##&!!"44# )" # $ +! #)# 4& #00#####& 4$'+3 (454$31.( &"#) 5#444& *#0 ()+( 0) 1.'+$ '+& 0##,&#( ((#)*#0 $ & 0##&)###&.'+ 33.'+5'+ &"" 编辑 卓选鹏!"!

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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