第期孙笑竹等 : 抑制剂 # #% 联合 4%4>> 对肝癌细胞 %. 的体外抗癌作用. 血小板源生长因子受体而发挥作用 # #% 可通过同时抑制 9 > 和 ) % 来克服 &84 抗 / 性 # #% 可用于多种肿瘤的治疗包括急性粒细胞性白血病 5 4) 慢性淋巴性白血病 > 5 多发

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丁逻麻
5 years ago
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1 浙江理工大学学报自然科学版第卷第期年月 #%&' # ) *+.%/ ) 抑制剂 8 联合 55 % 对肝癌细胞 *# 的体外抗癌作用孙笑竹吕春伟秦云韩建翠王毅刚浙江理工大学生命科学学院杭州 / 摘要通过 *: 抑制剂 # #% 联合 4*%4>> 处理肝癌 %. 细胞以探究两者联合作用的体外抗癌作用采用 )&& 法分别检测 # #%4*%4>> 以及 # #% 与 4*%4>> 联合对肝癌细胞株 %. 生长的抑制作用利用染色观察所处理细胞的凋亡形态学变化采用流式细胞术对凋亡进行量化检测凋亡相关蛋白表达情况结果表明 )+ 的 4*%4>> 联合的 # #% 处理后 %. 细胞的存活率仅为 2 而 )+ 的 4*%4>> 和 # #% 分别单独处理后细胞存活率为 2 和 /2 染色流式检测及结果表明联合处理组细胞凋亡现象更明显实验结果证明 # #% 联合 4*%4>> 能有效的抑制肝癌细胞 %. 生长并诱导其凋亡关键词 *: 抑制剂 # #%4*%4>> 肝癌体外抗癌作用中图分类号 D 文献标志码 4 文章编号.%/%%. 引用页码. 引言抗肿瘤研究的难点是如何找到一种治疗手段在杀伤癌症细胞的同时对正常组织产生的影响尽量小然而常用的放化疗手段都会对正常机体产生很大的毒副反应因此新的治疗手段成为癌症治疗方向的研究热门近年来中科院刘新垣院士提出的肿瘤的靶向基因 % 病毒治疗策略 % % > 已经成为一个研究热点该课题组利用基因工程技术对型腺病毒进行改造得到的病毒称作 * % 本课题所使用的病毒由等提供其将 * 的 4 区启动子改造为肝癌特异性启动子甲胎蛋白启动子 49 并由其启动插在处外源基因 4>> 的表达成为产物 4* >> 改造后的病毒简称为 4*%4>> 体内实验及体外实验结果均表明携带抑癌基因的重组腺病毒 4*%4>> 具有更高的抗肿瘤效应和更低的毒副作用 4>> 是一种可以特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞不产生影响的蛋白其通过在细胞中定位不同来诱导细胞凋亡 4>> 蛋白主要定位于肿瘤细胞的细胞核中正常细胞的细胞质中 4>> 可不依赖于基因诱导肿瘤细胞凋. 亡并且其诱导肿瘤细胞的凋亡不受 % 家族影响而是受线粒体释放的细胞色素和激活的 > % 和 > %. 影响 / 有研究认为该机制是通过调节鞘磷脂 % 神经酰胺的作用来实现的尽管 4>> 诱导细胞凋亡的机制还不是完全清楚但其自身特性和低毒性使其成为理想的肿瘤基因治疗药物一些研究表明 4>> 有良好的 % 抗癌效果和安全性 # #% 是一种对细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 *: 有抑制作用的新型胺噻唑化合物其主要通过抑制 *:. 发挥作用这种化合物因其选择性抑制 65 活性及较低的蛋白结合能力而进入临床研究在恶性血液细胞中其通过抑制收稿日期 00/ 基金项目浙江省自然科学基金项目 / 浙江省科技计划项目. 浙江理工大学科研启动基金项目 % 作者简介孙笑竹 /0 女辽宁锦州人硕士研究生主要从事癌症的靶向基因 % 病毒疗法方面的研究通信作者王毅刚 % A 6

2 第期孙笑竹等 *: 抑制剂 # #% 联合 4*%4>> 对肝癌细胞 %. 的体外抗癌作用. 血小板源生长因子受体而发挥作用 # #% 可通过同时抑制 9 > 和 ) % 来克服 &84 抗 / 性 # #% 可用于多种肿瘤的治疗包括急性粒细胞性白血病 5 4) 慢性淋巴性白血病 > 5 多发性骨髓瘤 > )) 结肠癌非小细胞肺癌 % # % 等的治疗目前该药物已处于 )) 及其转移性难治性实体瘤的 % 期临床试验阶段癌症细胞由于其代谢信号纷繁复杂且具有多基因遗传特性因此单一药物对其治疗效果有限药物联用可以取得更好的治疗效果一直是抗癌研究的热点本课题组之前的研究表明 4*%4>> 相对于 *4* 有更好的安全性以及对肝癌不同细胞株的杀伤能力且 # #% 对部分肿瘤细胞有良好的抑制生长作用将两者联合期待达到更好的对 %. 细胞的杀伤作用本研究证明 # #% 联合 4*%4>> 对肝癌细胞株 %. 具有更强的杀伤作用为病毒基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症的进一步研究提供参考材料与方法材料 )&& 凋亡试剂购于 # 公司 *9 膜购自 ) > 公司二甲基亚砜 *)#+ 购自上海国药病毒 4*%4>> 为本实验室所有 : 细胞肝癌 %. 细胞肝正常 % 细胞肺癌 4 细胞乳腺癌 ) 9%. 细胞胰腺癌 4 % 细胞结肠癌 # 细胞都来自于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库 > %./ 以及 48C4?4* 抗体均购自 #& 公司二抗购自 # 蛋白胶配制相关溶液均购自碧云天公司 & 超净台 *:%/* 型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司 C*#% 倒置生物显微镜 + > 公司 *4 型号的流式细胞仪 * 公司方法细胞培养 : 细胞 %. 细胞 % 细胞 4 细胞 ) 9%. 细胞 4 % 细胞 # 细胞用含 2 胎牛血清的高糖 *)) 完全培养基于. 2 + 培养箱中进行培养 6 传代取对数生长期细胞进行实验 4*%4>> 的靶向复制能力分析将对数生长期的肝正常细胞 % 及肝癌细胞 %. 按 = 孔密度接种到孔板中待细胞贴壁后加入 )+ 鉴定好的溶瘤腺病毒 4*% 4>>. 后用移液器将细胞吹打下来之后收集培液与细胞于离心管中反复冻融次彻底裂解细胞离心取上清 & * 法测量病毒滴度 4*%4>> 的安全性分析向孔板中按照 = 孔的密度接种肝正常细胞 % 待其贴壁后分别加入 )+ )+ )+ 溶瘤腺病毒 4*%4>> 每组设置个复孔不加细胞组为调零组不加 4*% 4>> 组为对照组按照上述培养条件培养向每个孔中加入预先配置好的 )&& 溶液继续培养用真空泵小心吸去上清每孔加入的 *)#+ 溶液摇床震荡甲瓒晶体完全溶解后利用酶标仪测. 吸光值. 按照公式计算细胞存活率重复次 )&& 法分析不同处理组对肝癌细胞株 %. 的体外抑制作用向孔板中按照 = 孔的密度接种肝癌细胞 %. 待其贴壁后分别加入不同浓度待测药物每组设置个复孔不加细胞组为调零组不加药物组为对照组按照上述培养条件培养 /. 向每个孔中加入预先配置好的 )&& 溶液继续培养用真空泵小心吸去上清每孔加入的 *)#+ 溶液摇床震荡甲瓒晶体完全溶解后利用酶标仪测. 吸光值. 按照公式计算细胞存活率重复次 )&& 法分析不同处理组对不同肿瘤细胞系的体外抑制作用向孔板中按照 = 孔的密度接种对数生长期的肺癌细胞 4 乳腺癌细胞 ) 9%. 胰腺癌细胞 4 % 结肠癌细胞 # 肝癌细胞 %. 待其贴壁后分别加入不同浓度待测药物每组设置个复孔不加细胞组为调零组不加药物组为对照组按照上述培养条件培养 /. 向每个孔中加入预先配置好的 )&& 溶液继续培养用真空泵小心吸去上清每孔加入的 *)#+ 溶液摇床震荡甲瓒晶体完全溶解后利用酶标仪测.

3 浙江理工大学学报年第卷吸光值. 按照公式计算细胞存活率重复次计算各组对不同细胞系的抑制作用染色荧光显微镜下观察细胞形态向孔板中按照 = 孔的密度接种对数生长期的 %. 细胞细胞贴壁后加入的 # #% 或和 )+4*%4+& 按照上述条件培养 / 后加入染料避光孵育荧光显微镜下检测细胞核变化. 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率孔板以 = 的密度接种 %. 细胞. 2 + 培养后加药组加入的 # #% 或和 )+4*%4+& 对照组中加入等体积的 # 继续培养 / 之后按照凯基流式凋亡试剂盒说明书操作 / 检测凋亡相关蛋白孔板以 = 的密度接种 %. 细胞. 2 + 培养后加药组加入的 # #% 或和 )+4*%4+& 对照组中加入等体积的 # 继续培养 / 后将孔板置于冰上吸去培养基用预冷的 # 洗两次每组加入含 )#9 的裂解液冰上静置用细胞刮将其收集起来离心取上清加入 = 上样缓冲液煮沸用 4 试剂盒定量上述蛋白之后每孔加入总蛋白进行 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳结束后利用半干转将蛋白转移到 *9 膜上 2 脱脂奶粉封闭 & #& 洗膜次每次按照说明书稀释一抗一抗孵育过夜 & #& 洗膜次每次加入稀释好的二抗避光孵育 & #& 洗膜次每次加入显色液扫膜检测目的蛋白的表达统计学处理所有实验数据使用 ). 及? > 6 处理以. ) 表示为显著性差异结果 4*%4>> 的靶向复制能力分析肝正常细胞株 % 和肝癌细胞株 %. 经 )+ 溶瘤腺病毒 4*%4>> 感染. 后收集培液和细胞反复冻融次离心取上清 & * 法测病毒滴度图如图所示改造后的溶瘤病毒在肿瘤细胞株 %. 中的复制能力远远大于在肝正常株 % 中的复制能力这说明启动子 49 的改造可增强其对 %. 细胞株的靶向性图 4*%4>> 的靶向复制能力分析 4*%4>> 的安全性分析分别用 )+4*%4>> 感染 % 细胞或 %. 细胞根据测量出的 +* 值计算细胞存活率结果如图图显示 4*% 4>> 对肿瘤细胞株 %. 的杀伤效果明显高于正常细胞株 % 说明其安全性良好图 4*%4>> 的安全性分析 )&& 分析不同处理组对肝癌细胞株 %. 的体外抑制作用分别用的 # #% 处理 %. 细胞 /. 检测细胞存活率分别用 )+ 的病毒感染细胞 /. 后测量细胞存活率根据两者单独作用的实验结果选用 )+ 的病毒与的化疗药物 # #% 联合处理 %. 细胞结果如图图显示 # #% 对肿瘤细胞的杀伤效果不是时间依赖而是剂量依赖的选择合适的用药量 # #% 可明显增强 4*%4>> 对肝癌细胞株 %. 的杀伤作用

细胞结果如图所示 # #% 对不同癌细胞均可不同程度增强 4*%4>> 的抗癌作用说明其对癌症治疗具有普遍意义图特异性分析染色观察各处理组细胞核形态各组处理 %. 细胞 / 后加入避光染色之后在荧光显微镜下观察各组细胞核形态从图可以看出单独用药组与联合用药组的 %.

4 第期孙笑竹等 *: 抑制剂 # #% 联合 4*%4>> 对肝癌细胞 %. 的体外抗癌作用图 )&& 分析细胞存活率注分别用浓度为的 # #% 处理 /. 后 %. 细胞的存活率分别用 )+ 的 4*% 4>> 处理 /. 后 %. 细胞的存活率的 # #% 或和 )+ 的 4*%4>> 处理 /. 后 %. 细胞的存活率 )&& 分析不同处理组对不同肿瘤细胞系的体外抑制作用用 )+ 的病毒或和的化疗药物 # #% 联合处理肺癌细胞 4 乳腺癌细胞 ) 9%. 胰腺癌细胞 4 % 结肠癌细胞 # 及 %. 细胞结果如图所示 # #% 对不同癌细胞均可不同程度增强 4*%4>> 的抗癌作用说明其对癌症治疗具有普遍意义图特异性分析染色观察各处理组细胞核形态各组处理 %. 细胞 / 后加入避光染色之后在荧光显微镜下观察各组细胞核形态从图可以看出单独用药组与联合用药组的 %. 细胞都有不同程度的凋亡图染色检测各处理组导致的 %. 细胞凋亡注箭头表示凋亡细胞标尺为法检测 %. 细胞早晚期凋亡根据凋亡检测试剂盒说明对 %. 细胞的凋亡情况进行检测检测结果见图图中右上象限与右下象限分别代表晚期凋亡与早期凋亡将两象限显示的百分比加和即为发生凋亡的细胞比率见图结果显示 # #% 或 4*%4>> 单独用药组凋亡率分别为 2 和 2 联合用药组凋亡率为 2 与单独用药组相比有明显的提高

#EI 浙江理工大学学报 #%&年第卷图&流式细胞术检测 O)0 F细胞凋亡率 #@ F` * +L 检测凋亡相关蛋白为进一步研究5>5 #联合 RB R +是如 *讨论何在分子水平上诱导 O)0 F 细胞凋亡的%本实验检目前溶瘤病毒治疗肿瘤的研究已重视携带抗癌测了凋亡相关蛋白的表达水平'如图F所示%联合用基因%以进一步提高其抗癌效果%并希望增强其安全药组 M & G

5 #EI 浙江理工大学学报 #%&年第卷图&流式细胞术检测 O)0 F细胞凋亡率 F` * +L 检测凋亡相关蛋白为进一步研究5>5 #联合 RB R +是如 *讨论何在分子水平上诱导 O)0 F 细胞凋亡的%本实验检目前溶瘤病毒治疗肿瘤的研究已重视携带抗癌测了凋亡相关蛋白的表达水平'如图F所示%联合用基因%以进一步提高其抗癌效果%并希望增强其安全药组 M & G 的表达量比各单独处理组明显增性'癌症的靶向基因病毒治疗策略是指通过生物各单独处理组 M 加% & G 的表达量比 A 6 S组技术手段改造病毒%增强其在肿瘤细胞内的靶向复明显增加 M F表达量与 RB R +单独处理变化不明显% 5>5 # 单独处理组 M F 表达随着病毒的复制%其携带的抗癌基因也在肿瘤细胞量与 A 6 S组相差也不明显这说明 5>5 #主要通过增加 M G 的表达量来促进肿瘤细胞凋亡% RB R +主要通过增加 M F% G 的表达量来促进肿瘤细胞凋亡%二者联合使得下游 M 表达量明显增加'此外% 5>5 #联合 RB R + 可显著增强 QRVQ 前体的剪切%下调抗凋亡蛋白 g DRQ的表达量%证明联合处理组可增强 O)0 F细胞的凋亡% 且具有更好的抗癌作用' 制能力从而使肿瘤细胞裂解对其产生杀伤作用%且内成千上万倍的复制%从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量#)' 本课题所用的 RB R +是本课题组在 /B 的基础上%将其天然 Y%R 的启动子改造成肝癌特异性启动子 RWQ%从而提高其对肝癌的靶向性和安全性#I)%携带的抗癌基因 R +%可特异性引起肿瘤细胞凋亡%而不影响正常细胞' 化疗药物治疗作为目前肿瘤治疗中最有效的疗法之一%其优点是可以通过血液循环作用于全身%对扩散到全身各处的肿瘤细胞都有作用'若肿瘤细胞对该药物敏感%则其能取得良好的疗效' 但在实际应用中发现%对所有肿瘤细胞都有良好治疗效果的化疗药物并不多%很多肿瘤细胞对化疗药物敏感度不高%在这种情况下%即使加大药量%延长用药时间% 治疗效果并不理想%甚至会对人体产生强烈的毒副作用#)'此外化疗效果有限%不能从根本上治愈且具有强烈的副作用%临床上应用的化疗药物常使癌症病人痛苦不堪'实验过程中我们观察到 5>5 # 能明显抑制 O)0 F细胞生长并诱导其凋亡%且这种杀伤作用是剂量依赖的' 本实验利用 MBX 抑制剂 5>5 # 联合癌症的图F` * +L 检测凋亡相关蛋白靶向基因病毒治疗药物 RB R + 处理肝癌 ' 细胞株 O)0 携带基因的溶瘤腺病毒 F R +

6 第期孙笑竹等 *: 抑制剂 # #% 联合 4*%4>> 对肝癌细胞 %. 的体外抗癌作用 4*%4>> 具有良好的靶向肿瘤细胞的能力良好的生物安全性 )&& 实验结果表明联合用药对肝癌 %. 细胞株的抑制作用要强于 # #% 或 4*%4>> 单独用药即使是对 4*% 4>> 不敏感的细胞株联合用药组都在一定程度上强于单独用药组流式结果表明 # #% 联合 4*%4>> 可在更大程度上促进 %. 细胞的凋亡实验从分子水平上证明了联合处理组可增强 %. 细胞的凋亡且具有更好的抗癌作用本实验结果证明 # #% 联合 4*% 4>> 具有更强的抗癌效果且这种增强效应具有一定的广谱性理论上可在降低用药剂量的同时达到相同甚至更好的效果为病毒基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症奠定基础参考文献 &8 4?+8?4 +#9 % % 6 > A > 6 )6 /% ' C? 4? :? # % % > &? & 6 > 6 >.%.. 4? +'? '+ C *% 6 > 8 /%/ 谌贺宽子梁天祥仇庆等组蛋白去乙酰化酶抑制剂 #4 4 联合溶瘤腺病毒 *%% % 诱导 #/ 细胞凋亡中国细胞生物学学报 % +'# 4? ) 4? ) >> % 66 6 )6 + /% 姚站馨吕茂民章金刚 4>> 与肿瘤细胞凋亡生物技术通讯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

7 浙江理工大学学报年第卷 4 # 4 )8 & %6> 6 5 # #% 4) 6 A 5 % +D'+ 4 & *8#? > %6> 6 5 # #% 8 /%/ #&+ :&&*4 :8* # #% > 6 *: > > > 6.%. 4& :)48& 8 4 > 6 # #% )#%/. > %6> A5 > A 6 A* /% 84 +'8& '8 * 6 6 > 46 6* * 8 A...%/ 4?:D4 4?# & % % > A >> A > > 6 # % 谭渊李喜英席璐等二氯乙酸钠对溶瘤腺病毒 *%# 抑制肝癌细胞生长的影响浙江理工大学学报../%. %6 % + + %% ) %# 8 # % % 6 & % & *#. % +@& * 5 # #%&' / & *: # #% 64*%4>> A 6 % )&& 6A 6 > 6 # #%4*%4>> # #% 64*%4>> A >.& > >> A 6 A A 6 >> 6 A 6 >> % 6> & A A )+4*% 4>> 6 # #% %. 2A )+4*%4>> 6 # #% > 6 2 6/2 > A 6 6 >> 6 >4 # #% 64*%4>> A > %. 6 6 >> ) ' %6> 6 5 *: # #%4*%4>> 责任编辑许惠儿

第期仇庆等组蛋白去乙酰化酶抑制剂 #343 联合 %&3 溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究 - 对 &3 敏感研究证实由于肝癌中含有较高抑制凋亡的蛋白故 &3 较难启动肝癌细胞的凋亡系统能够满足肿瘤基因病毒治疗的两个要求具有靶向性和可插入外源基因的特点并且携带外源基因的增殖性溶瘤

第期仇庆等组蛋白去乙酰化酶抑制剂 #343 联合 %&3 溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究 - 对 &3 敏感研究证实由于肝癌中含有较高抑制凋亡的蛋白故 &3 较难启动肝癌细胞的凋亡系统能够满足肿瘤基因病毒治疗的两个要求具有靶向性和可插入外源基因的特点并且携带外源基因的增殖性溶瘤浙江理工大学学报第卷第期年月! "#$!%&$'!! ( ) 文章编号 %%% 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 ' 联合 3-1 % 溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究仇庆谢国良谌贺宽子李敏周秀梅浙江理工大学生命科学院杭州. 摘要研究组蛋白去乙酰化抑制剂 #343!!0 0 ;!$ $!0 联合 %&3 对人肝癌细胞株的体外杀伤效果实验采用 )&& 法检测 #343 %&3