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1 1252 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (10): 藤黄酸增敏 TRAIL 诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡 叶记林 1 *, 于有江 1, 吴爱莲 1, 王冬艳 1, 刘永春 2, 刘延庆 3 (1. 扬州市职业大学医学院, 江苏扬州 ; 2. 江苏省苏北人民医院, 江苏扬州 ; 3. 扬州大学医学院, 江苏扬州 ) 摘要 : 研究藤黄酸 (GA) 与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 联合作用对人结肠癌 HT-29 细胞的影响 采用 TRAIL GA 单独及联合作用的方法诱导 HT-29 细胞凋亡, MTT 法检测细胞增殖的抑制 ; 琼脂糖凝胶电泳法和流式细胞术判断细胞凋亡 ; 通过流式细胞术检测胞浆内的活性氧自由基 (ROS) 水平 ; 用分光光度法检测 Caspase 相对活性 ; 免疫印迹实验分析 c-flip CHOP DR4 和 DR5 蛋白表达水平 联合应用 1 µg ml 1 GA 12 h, 显著促进 40 ng ml 1 TRAIL 对 HT-29 细胞的生长抑制和诱导凋亡作用 ; 使细胞出现了清晰的 凋亡特有的 DNA ladder 条带, 细胞凋亡率达 (45.5 ± 4.9) %; 明显升高胞浆内 ROS 含量 ; 显著提高 CHOP DR4 和 DR5 的表达, 分别至对照组的 (7.38 ± 0.41) (5.41 ± 0.60) 和 (4.85 ± 0.31) 倍, 使细胞内 Caspase 活性明显升高 (P < 0.05); 下调抗凋亡蛋白 c-flip 表达, 仅为对照组的 (0.22 ± 0.08) 倍 GA 可能是通过 ROS 升高激活内质网应激 (ERS) 凋亡途径 上调 DR4 DR5 和下调 c-flip 表达来增敏 TRAIL 诱导人结肠癌 HT-29 细胞的凋亡 关键词 : 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 ; HT-29 细胞 ; 细胞凋亡 ; 藤黄酸中图分类号 : R966 文献标识码 : A 文章编号 : (2015) Sensitization of human colon cancer HT-29 cells to TRAIL-induced apoptosis by gambognic acid YE Ji-lin 1 *, YU You-jiang 1, WU Ai-lian 1, WANG Dong-yan 1, LIU Yong-chun 2, LIU Yan-qing 3 (1. Yangzhou Polytechnic College, Yangzhou , China; 2. Subei People's Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou , China; 3. School of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou , China ) Abstract: To investigate the effects of gambognic acid (GA) on TRAIL-induced apoptosis of cancer cells, human colon HT-29 cancer cells were treated with GA to promote apoptosis. Inhibition of the cell proliferation was measured with MTT assay and cell apoptosis was detected with formation of DNA ladders in agarose gel electrophoresis, and activation of caspase activity. The content of cytosolic reactive oxygen species (ROS) was measured with flow cytometry. The activities of Caspase-3, -8, -9 were detected using spectrophotometric assay. The levels of c-flip, CHOP, DR4 and DR5 in cells were tested by Western blot. Combination of GA (1 µg ml 1 ) and TRAIL (40 ng ml 1 ) significantly reduced proliferation and increased apoptosis of HT-29 cells over those induced by each agent alone. Percentage of apoptotic cells was increased to 45.5%. GA markedly enhanced the intracellular ROS generation. Expression of CHOP, DR4 and DR5 was up-regulated to 7.38, 5.41, and 4.85 times of the control group, respectively. GA promoted activation of Caspase-3, -8, and -9 by TRAIL (P < 0.05). Furthermore, the expression of anti-apoptotic protein c-flip was down-regulated to 0.22 ± 0.08 times of the control group. In conclusion, GA sensitizes HT-29 cells to TRAIL-induced apoptosis 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 江苏省卫生职业技术教育研究科研课题基金 (J201311). 同为第一作者. * 通讯作者 Tel: , Fax: , yejilin126yejilin@126.com

2 叶记林等 : 藤黄酸增敏 TRAIL 诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡 1253 by promoting ROS-activated ERS pathways, up-regulating of DR4 and DR5, and inhibiting c-flip expression. Key words: tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand; HT-29 cel1; apoptosis; gambognic acid 结肠癌是最为常见的恶性肿瘤之一, 发病率处 于恶性肿瘤的第 3 位 [1] 在我国, 随着饮食习惯的改 变, 结肠癌的发病率呈快速上升态势 结肠癌现有的 治疗手段效果不佳且不良反应较大, 患者 5 年生存 率不足 50% [1] 因此, 寻找一种高效低毒的新型结肠 癌药物治疗方案已成为国内外研究的重要领域 肿 瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL) 能够选择性 地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性作用, 具 有极大的临床应用前景 然而, 包括人结肠癌细胞 HT-29 在内的相当多的肿瘤细胞对 TRAIL 耐药阻碍 了 TRAIL 的应用 [2] [3] 虽然目前有文献报道多种化疗 药物能克服 TRAIL 的耐药问题, 但寻找与低价高效 毒副作用小的药物联合进行抗癌非常迫切和重要 藤黄酸 (gambognic acid, GA) 是中药藤黄的主 要活性成分, 作为一种具有广谱抗肿瘤的天然药物备 受关注 [4, 5] 实验证实 GA 能选择性抑制多种癌细胞 的增殖, 而对正常组织损伤较小, 尤其是对造血系统 和免疫系统的安全性高 [4, 5] 近年研究发现 GA 抑制 多种肿瘤的机制是通过诱导活性氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 升高而激活肿瘤细胞的凋亡 [6, 7] 而多种药物联合 TRAIL 诱导肿瘤细胞凋亡与 ROS 增 多密切相关 [8, 9] 因此猜想 GA 能增敏 TRAIL 诱导人 结肠癌 HT-29 细胞凋亡, 而国内外尚无相关文献报 道 为此, 本文将探讨 GA 联合 TRAIL 对人结肠癌 细胞 HT-29 的影响, 并分析其作用机制, 为寻找新的 治疗人结肠癌的有效方式提供实验依据 材料与方法 材料人结肠癌细胞 HT-29 购自中国科学院上海 细胞库 Human TRAIL 蛋白购于 Millipore 公司 GA 单体购自 Biomol 公司, 纯度 98% McCoy s 5A 培养 基购于 Gibco 公司 小牛血清购于杭州四季青公司 MTT 和二甲基亚砜 (dimethyl sulphoxide, DMSO) 购 于 Amresco 公司 N- 乙酰半胱氨酸 (N-acetyl cysteine, NAC) 购于 Calbiochem 公司 DNA ladder 提取试剂 盒购自北京普利莱基因技术有限公司 Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自德国 BM 公司 c-flip CHOP DR4 和 DR5 抗体购自 Cell Signaling Technology 公 司 流式细胞仪为 BIO-RAD 公司产品 Caspase 活性检测试剂盒购自碧云天公司 细胞培养和处理 HT-29 细胞用含 10% 小牛血清的 McCoy s 5A 培养液, 在 37 5% CO 2 饱和湿度下培养 设未用任何药物处理的空白对照组 40 ng ml 1 TRAIL 单药组 1 µg ml 1 GA 单药组 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA 联合组 10 mmol L 1 NAC + 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA 联合组 当药物处理细胞时, 换含 2% 小牛血清的培养液进行培养 MTT 法检测细胞生长取对数生长期细胞接种于 24 孔板, 每孔 1 ml, 细胞数为每毫升 个, 待细胞贴壁后换含 2% 小牛血清的培养液培养 10~12 h 分组处理细胞 12 h, 每组设 3 个平行孔 实验终止前 4 h 每孔加入 0.5 mg ml 1 MTT 300 μl, 培养结束时倾去培养液, 加入 DMSO 500 μl 完全显色后, 转移至 96 孔板, 以酶联免疫检测仪在 570/630 nm 波长测光密度 OD 值 (OD 值代表相对活细胞数 ) 并按下列公式计算细胞生长抑制率 : 生长抑制率 (%) = (1 OD 实验组平均值 /OD 对照组平均值 ) 100 琼脂糖凝胶电泳和 AnnexinV-FITC/PI 检测细胞凋亡取对数生长期细胞接种于 6 孔板, 细胞数为每毫升 个, 每孔 2 ml, 待细胞贴壁后换含 2% 小牛血清的培养液培养 10~12 h, 分组处理细胞 12 h 一部分细胞按 DNA ladder 提取试剂盒说明书提取 DNA 取所制的样品 20 μl 上样进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 40 min, 紫外灯下观察 摄影 一部分细胞按 Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明书处理, FACS Calibur 流式细胞仪检测凋亡率 流式细胞仪测定胞内 ROS 水平分组处理细胞 12 h, 0.25% 胰蛋白酶消化, 1500 r min 1 离心 5 min, 收集细胞, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤 2 次, 加 PBS 200 μl 重悬细胞, 用 DCFH-DA ( 终浓度为 5 μmol L 1 ) 对胞浆内的 ROS 进行标记, 流式细胞仪检测荧光 ( 激发光波长为 488 nm, 发射光波长为 530 nm) Western blot 检测 c-flip CHOP DR4 和 DR5 收集分组处理 12 h 后的各组细胞, PBS 洗涤 2 次 按常规方法提取蛋白质, 恒压进行 SDS 电泳分离, 然后电转到 PVDF 膜上, 分别与兔抗人 c-flip CHOP DR 4 和 DR 5 单抗 4 孵育过夜, 再加入羊抗兔 IgG- HRP 室温孵育 1 h, 将膜洗涤干净后, 加 TMB 显色液

3 1254 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (10): 显色 摄影 图像分析仪对显色条带进行灰度分析 计算条带的积分吸光度值并与内参作对比 分光光度法检测 Caspase 蛋白活性分组处理细胞 12 h, 具体操作步骤和方法按照 Caspase 活性检测试剂盒说明书进行 参考 Chemicon 公司的 Caspase 酶活力单位的定义, 计算样品中所含有酶活力单位 统计与分析应用 Sigma Plot 12.0 及 Excel 2003 统计软件, 所有实验重复 3 次, 结果以 x ± s 表示, 两样本差异显著性分析采用 t 检验, 检验水准 α = 0.05 率显著低于单独 GA 作用组 (P < 0.05) 表明 GA 能增敏 TRAIL 对结肠癌 HT-29 细胞的生长抑制作用 而 NAC 明显逆转两药联合引起的细胞增殖抑制作用 2 GA 联合 TRAIL 引起 HT-29 细胞 DNA 的损伤 HT-29 细胞经 GA 处理 12 h 后, 出现了约 180~ 200 bp 间距的凋亡细胞所特有的 DNA ladder 现象 ( 图 2) TRAIL + GA 处理组条带更加清晰, 说明 GA 能增敏 TRAIL 诱导的 HT-29 细胞凋亡作用 而 NAC 明显减弱 GA 联合 TRAIL 所引起的 DNA 损伤作用 结果 1 GA 联合 TRAIL 对 HT-29 细胞增殖的抑制作用 MTT 结果显示 ( 图 1), GA 与 TRAIL 合用对 HT-29 细胞增殖的抑制作用较单药更为明显, 且细胞存活 Figure 2 Agarose-gel electrophoresis for detecting DNA fragmentation in human colon cancer HT-29 cells treated for 12 h in the following groups. Lane M: DNA size marker; Lane 1: Control; Lane 2: 40 ng ml 1 TRAIL; Lane 3: 1 µg ml 1 GA; Lane 4: 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA; Lane 5: 10 mmol L 1 NAC + 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA Figure 1 The inhibitory effect of gambognic acid (GA) combined with tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) on viability of human colon cancer HT-29 cells was detected by MTT assay. HT-29 cells were treated with 40 ng ml 1 TRAIL, 1 µg ml 1 GA, 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA or 10 mmol L 1 NAC (N-acetyl cysteine) + 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA for 12 h, respectively. Cell viabilities were calculated as the percentage of living cells in drug-treated groups compared to those in the control group (untreated with any drugs). * P < 0.05 vs the control group; # P < 0.05 vs GA group; P < 0.05 vs TRAIL + GA group; n = 3, x ± s 3 GA 联合 TRAIL 增加 HT-29 细胞的凋亡率图 3 中第三象限 (Annexin V /PI cells) 第四象限 (Annexin V + /PI ) 第一象限 (Annexin V + /PI + ) 和第二象限 (Annexin V /PI + ) 分别代表活细胞 早期凋亡 晚期凋亡和坏死细胞的百分率 检测结果显示, 对照组 TRAIL 组 GA 组 HT-29 细胞凋亡率分别为 (5.2 ± 1.1) % (7.3 ± 1.9) % 和 (23.5 ± 3.4) %, GA 联合 TRAIL 能明显促进 HT-29 细胞的凋亡, 凋亡率达到 (45.5 ± 4.9) % 与对照组及 GA 单药组相比, 均有统计学意义 (P < 0.05) 而 NAC 能明显减少 GA 联合 TRAIL 所引起的细胞凋亡, 凋亡率降至 (21.8 ± 2.6) % Figure 3 The apoptosis rates of human colon cancer HT-29 cells treated with 40 ng ml 1 TRAIL or 1 µg ml 1 GA alone or in combination or 10 mmol L 1 NAC + 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA for 12 h were detected by flow cytometry. Control: Treated without any drug

4 叶记林等: 藤黄酸增敏 TRAIL 诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡 1255 由此表明, GA 能有效地诱导 HT-29 细胞的凋亡, 并且 和 DR5 的表达 40 ng ml 1 TRAIL 联合 1 µg ml 1 两者联用可以显著提高 HT-29 细胞的凋亡率 (图 3) GA 作用后能进一步下调 c-flip 表达至对照组的 4 (0.22 ± 0.08) 倍; 显著提高 CHOP DR4 和 DR5 的 GA 联合 TRAIL 引起 HT-29 细胞 ROS 的升高 DCFH-DA 进入细胞后被酯酶水解为 DCFH, 该 表达, 分别是对照组的 (7.38 ± 0.41) (5.41 ± 0.60) 物质被氧化后生成 DCF, DCF 发射的绿色荧光强度值 (4.85 ± 0.31) 倍 而单独 TRAIL 对各蛋白的表达影响 可以代表细胞内 ROS 水平 图 4 结果显示, 对照组 很弱 和单独 TRAIL 处理组的细胞胞浆荧光均较弱, 经 GA 6 处理后荧光增强, TRAIL + GA 组的细胞荧光最强 -9 活性的变化 GA 联合 TRAIL 引起 HT-29 细胞 Caspase-3-8 表 明 GA 能 诱 导 细 胞 内 ROS 的 产 生, 且 能 增 敏 通过比色法测定生成的对硝基苯胺 (pna) 含 TRAIL 诱导 ROS 的升高 而 NAC 明显拮抗两者联 量反映蛋白活性的高低 由图 6 可知, 在 GA 单独作 合所引起的 ROS 升高 用下, HT-29 细胞的 Caspase 活性都有明显 5 提高, 而 GA 联合 TRAIL 组细胞 Caspase GA 联合 TRAIL 引起 HT-29 细胞 c-flip CHOP DR4 和 DR5 蛋白表达量的变化 活性升高更为显著, 与对照组及单独用药组相比有 1 图 5 显示, 与对照组相比, 1 µg ml GA 作用 12 h 后能明显下调 c-flip 的表达, 显著提高 CHOP DR4 显著性差异 (P < 0.05) 提示 GA 能增敏 TRAIL 提高 Caspase 的活性 Figure 4 The ROS levels of human colon cancer HT-29 cells treated with 40 ng ml 1 TRAIL or 1 µg ml 1 GA alone or in combination or 10 mmol L 1 NAC + 40 ng ml 1 TRAIL + 1 µg ml 1 GA for 12 h were detected by flow cytometry ( 400). *P < 0.05 vs control group; # P < 0.05 vs GA group; P < 0.05 vs TRAIL + GA group; n = 3, x ± s Figure 5 The expressions of c-flip, CHOP, DR4 and DR5 in human colon cancer HT-29 cells treated with 40 ng ml 1 TRAIL or 1 µg ml 1 GA alone or in combination for 12 h were detected by Western blotting. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs GA group; n = 3, x ± s

5 1256 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (10): Figure 6 The relative enzyme activities of Caspase-3, -8, -9 in human colon cancer HT-29 cells treated with 40 ng ml 1 TRAIL or 1 µg ml 1 GA alone or in combination for 12 h were detected by colorimetric assay. * P < 0.05 vs control group; # P < 0.05 vs GA group; n = 3, x ± s 讨论 TRAIL 又称凋亡素 2 配体 (Apo-2 ligand, Apo2L), 能选择性诱导肿瘤细胞凋亡, 成为肿瘤治疗的研究热点 但多种肿瘤细胞株能抵抗 TRAIL 诱导的凋亡 [2], 抵抗 TRAIL 的机制包括死亡受体 (DR4 和 DR5) 表达减少 诱骗受体 (DR1 和 DR2) 表达增加 抑制促凋亡因子的表达 (Caspase-3 Caspase-8 FADD Caspase-9 Bax Smac 和细胞色素 C 等 ), 上调抗凋亡因子水平 (c-flip NF-κB 和 XIAP 等 ) [3] 针对这些机制来选择与 TRAIL 联合应用的药物, 成为提高 TRAIL 疗效的重要策略 传统的化疗药物往往会产生不良反应, 特别是对造血系统和免疫系统极易造成不可逆的损伤, 影响整体治疗效果 寻找安全有效 增强 TRAIL 抗癌效果的药物是将 TRAIL 投入临床应用的一个重要课题 [3] 大量研究表明, 天然中草药藤黄的活性成分 GA 是一种多靶点的抗肿瘤药物, 主要通过诱导 ROS 升高 上调促凋亡蛋白 (Bax P53 DIO-1 和 SRC-3) 下调抗凋亡蛋白 (Bcl-2 NF-κB 和 survivin) 及转铁蛋白受体诱导细胞发生凋亡 [5 7] 藤黄酸能否增敏 TRAIL 诱导耐药肿瘤细胞凋亡却未见报道 本实验结果显示 GA 能明显增敏 TRAIL 对结肠癌 HT-29 细胞的生长抑制作用 ; 能促使对 TRAIL 耐药的 HT-29 细胞发生明显的细胞凋亡, 与单独 GA 组比较, GA 与 TRAIL 联用后凋亡细胞特有的 DNA ladder 现象明显增强, 细胞凋亡率由 (23.5 ± 3.4) % 上升到 (45.5 ± 4.9) % 图 1~3 结果显示, ROS 清除剂 NAC 能明显减弱 GA 增敏 TRAIL 所引起的细胞生长抑制作用和细胞凋亡效应, 进一步实验结果表明 GA 联合 TRAIL 作用后细胞内 ROS 水平明显升高, 而 NAC 能明显逆转此过程, 提示 ROS 的升高可能在 GA 增敏 TRAIL 抑制 HT-29 细胞生长和诱导凋亡中 起重要作用 近年来, 国内外研究发现在 TRAIL 诱导多种肿 瘤细胞的凋亡过程中, ROS 升高会引起内质网应激 (endoplasmic reticulum stress, ERS), ERS 上调其特异 转录因子 C/EBP 同源蛋白 (C/EBP homologous protein, CHOP), 而 DR5 是 CHOP 调控的重要靶基因, 因此 CHOP 可通过上调死亡受体 DR5 激活 Caspase 蛋白酶 解级联反应进而发生细胞凋亡 [10, 11] TRAIL 作用的主 要途径是与死亡受体 DR4 和 DR5 结合, 招募 FADD (Fas-associated death domain protein), 并进一步激活 Caspase-8, 形成死亡诱导信号复合物, 最后将活化 信号传递并激活 Caspase-3, 从而发挥诱导细胞凋亡 的生物学功能, 这是 TRAIL 诱导凋亡的非线粒体途 径 [12 14] 本实验结果显示 GA 联合 TRAIL 能显著提 高 CHOP DR4 和 DR5 的表达, 使细胞内 Caspase 活性显著升高 提示 ROS 升高激活的 ERS 凋 亡途径和死亡受体途径在 GA 增敏 TRAIL 诱导 HT-29 细胞凋亡中起重要作用, 与 Cao [10] 和 Trivedi [11] 等报 道一致 c-flip 是一种凋亡抑制蛋白, 可与 Caspase-8 竞 争性结合 FADD, 抑制非线粒体凋亡途径的激活而抑 制细胞凋亡 既往的研究发现 c-flip 的过表达与肺 癌 结肠癌等肿瘤细胞对 TRAIL 耐药密切相关, 下调 c-flip 是增强结肠癌等肿瘤细胞对 TRAIL 敏感性的 重要措施之一 [15] 本研究发现 HT-29 细胞内有较高 的 c-flip 表达, GA 联合 TRAIL 作用后能下调 c-flip 水平, 提示 c-flip 的下调可能是 GA 增强 TRAIL 诱 导 HT-29 细胞凋亡的机制之一 综上所述, GA 可能通过 ROS 升高激活 ERS 凋亡 途径 上调 DR4 DR5 的表达和下调 c-flip 蛋白水 平来增强人结肠癌 HT-29 细胞对 TRAIL 诱导凋亡的 敏感性, 提示 GA 可能是 TRAIL 良好的增敏剂, 这为 今后两者的联合应用治疗结肠癌提供了实验依据 后 续的研究工作在阐明 GA 增强 TRAIL 抑癌分子机制 的同时, 将开展体内动物实验研究, 为 TRAIL 用于 临床肿瘤治疗提供更多的可靠依据 References [1] Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014 [J]. CA Cancer J Clin, 2014, 64: [2] Park MH, Kim SY, Kim YJ, et al. ALS2CR7 (CDK15)

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