床上应用较广的抗肿瘤中药制剂之一 [3 4] 华蟾酥毒基 (cinobufagin,cb) 作为华蟾素中提取的主要毒性配基之一, 亦具有良好的抗肿瘤作用先前有许多研究证实华蟾素可以通过抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡来发挥抗肿瘤作用研究发现其对肝癌乳腺癌小细胞肺癌结肠癌前列腺癌等多种恶性肿瘤具

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恳滕邹
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1 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＳＶＮ基础研究华蟾酥毒基对ＵＯＳ细胞增殖和凋亡的影响余铃郭卫春代国武汉大学人民医院骨科湖北武汉摘要目的观察华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞系ＵＯＳ增殖和凋亡的影响从而探讨华蟾酥毒基诱导骨肉瘤８法检测不同浓度华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞系ＵＯＳ凋亡的可能机制方法体外培养人骨肉瘤细胞系ＵＯＳＣＣＫ增殖的抑制作用ＡＶＦＩＴＣＰＩ染色流式细胞术检测细胞凋亡Ｈ８染色显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化应用逆转录荧光定量ＰＣＲ法检测华蟾酥毒基对凋亡通路相关ｍｒｎａ表达的影响结果ＣＣＫ８检测ｍＬ时显示华蟾酥毒基可抑制人骨肉瘤ＵＯＳ细胞增殖并具有时间和剂量依赖性在华蟾酥毒基浓度为对细胞增殖的抑制作用明显增强流式细胞术检测显示华蟾酥毒基可明显诱导骨肉瘤细胞凋亡Ｈ８染色８较用可见凋亡小体逆转录荧光定量ＰＣＲ分析显示经华蟾酥毒基处理后的骨肉瘤细胞系ＵＯＳ表达Ｃ药前明显增高结论华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞系ＵＯＳ的增殖有显著抑制作用并可诱导其发生凋亡其作用机制可能与激活Ｃ依赖的凋亡途径有关关键词华蟾酥毒基骨肉瘤细胞增殖细胞凋亡ＥＣＰＡＵＯＳＹＵＬＧＵＯＷＤＡＩＧＤｍＯＲｍＨＷＵＷＣＡＯｊＴｗＣｍｒｎａｍｍＵＯＳＭＯｍＵＯＳｗＣ８ＴＡＶＰＩｗｗｗＣＣＫ８ＣＣＫＨ８ｗｍＴｍｒｎａｍＦＣＭＣＵＯＳｗＲＴＰＣＲＲＴｍｍＵＯＳＴｗｗＴＵＯＳｗｗｍＬＡＨ８ＴＣｍｒｎａｍｍＵＯＳＣＣｍｍＵＯＳＩｍｍｍＣｗＫｗＣｍｊ８８骨肉瘤是最常见的骨的原发性恶性肿瘤好发的药物上以寻求更好的治疗效果于儿童和青少年主要发生于长骨远端目前主要华蟾素是中华大蟾蜍全皮经过水化萃取而制成的治疗方法是行新辅助化疗后再手术切除得益的中药制剂具有清热解毒利水消肿化瘀溃坚于此治疗方案使得骨肉瘤患者的年生存率提高等作用其化学成分复杂包括吲哚生物碱还原诱导肿瘤细胞发生凋亡是治疗的一糖氨基酸以及蟾蜍毒素蟾蜍色胺等华蟾素具个重要目标近年来许多学者把目光放在寻找新有低毒抗癌谱广等诸多优点目前已成为我国临到了基金项目国家自然科学基金８８通信作者代国住院医师研究方向脊柱外科与骨肿瘤Ｅｍｍ

2 床上应用较广的抗肿瘤中药制剂之一 [3 4] 华蟾酥毒基 (cinobufagin,cb) 作为华蟾素中提取的主要毒性配基之一, 亦具有良好的抗肿瘤作用先前有许多研究证实华蟾素可以通过抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡来发挥抗肿瘤作用研究发现其对肝癌乳腺癌小细胞肺癌结肠癌前列腺癌等多种恶性肿瘤具有良好的抗癌功效 [5 8] 但将华蟾酥毒基应用于骨肉瘤的研究并不多见本实验探讨了华蟾酥毒基对人骨肉瘤 U2OS 细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用, 并检测了其对凋亡相关 mrna 表达的调控, 为进一步明确华蟾酥毒基的抗肿瘤机制提供理论依据 1 材料 DMEM 培养基新鲜小牛血清 (Hyclone 公司 ); 华蟾酥毒基 ( 美国 Sigma 公司 ), 用二甲基亚砜 (DM SO) 溶解配制成 0 01mol L -1 的储备液分装备用, 使用时用无血清 DMEM 培养基稀释到所需浓度, DMSO 的含量小于 1 ;CelCountingKit 8(CCK 8, 日本同仁化学研究所 );AnnexinV FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 ( 南京凯基生物科技有限公司 ); DMSO Hoechst33258 及胰蛋白酶 ( 美国 Sigma 公司 );TRIzol 试剂 ( 美国 InvitrogenLifeTechnologies 公司 );RevertAid 第一链 cdna 合成试剂盒 ( 美国 Ther mofisherscientific 公司 );2XSYBR 绿色荧光染料反应混合液 ( 美国 Ambino 公司 ) Caspase 3,8,9 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成 2 方法 2 1 细胞培养用含 10% 胎牛血清 100 U ml -1 青霉素 100μg ml -1 链霉素的 DMEM 培养液在 37 饱和湿度 5% CO 2 培养箱中常规培养, 每 24h 换液, 用 0 25% 含 EDTA 胰酶消化液隔天消化传代, 取对数生长期的细胞进行后续实验 2 2CCK 8 法检测华蟾酥毒基对 U2OS 细胞增殖的影响取对数生长期的细胞, 制成 ml -1 的细胞悬液, 接种于 96 孔板, 每孔 100μL, 培养 24h 待其贴壁后加入终浓度分别为 nmol L -1 的华蟾酥毒基, 阴性对照组加等体积的 DMEM 培养液处理 ( 每个浓度设 5 个复孔 ), 每个浓度处理 h 后, 加入 CCK 810μL 培养 1h, 酶标仪 450nm 波长下检测各孔吸光度 (A) 值, 实验重复 3 次按公式 (1) 计算细胞存活率 1250 细胞存活率 =(A 给药组 A 空白组 )/(A 阴性对照组 A 空白组 ) 100% (1) 2 3AnnexinV FITC/PI 双染结合流式细胞术检测华蟾酥毒基对 U2OS 细胞凋亡的影响收集处于对数生长期的骨肉瘤 U2OS 细胞, 制备单细胞悬液, 计数后调整细胞密度为 ml -1, 按 2mL/ 孔接种于 6 孔板,37 5% CO 2 饱和湿度培养箱中常规培养 24h, 待细胞完全贴壁后吸弃原培养液, 加入终浓度分别为 nmol L -1 的华蟾酥毒基的新鲜 DMEM 培养液, 同时设立空白对照组药物作用 48h 后, 各组重复 3 次, 经胰酶消化, 收集细胞于流式管内,1500r min -1 4 离心 5min, 弃上清液,4 预冷的磷酸缓冲液 (PBS) 洗涤细胞 1 次, 用稀释好的结合缓冲液 [ 结合缓冲液去离子水 (1 10)] 500μL 重悬细胞每管依次加 AnnexinV FITC5μL, 再加入 5μLPI 染色液, 轻轻混匀, 室温下避光孵育 5min, 上流式细胞仪进行细胞凋亡检测以 AnnexinV 为横坐标,PI 为纵坐标, 左上象限代表坏死细胞碎片, 左下象限代表活细胞 (AnnexinV 和 PI 双阴性 ) 右下象限代表凋亡早期 (AnnexinV 阳性,PI 阴性 ) 右上象限代表凋亡晚期 (AnnexinV 和 PI 双阳性 ) 2 4Hoechst33258 检测细胞凋亡选取对数生长期的 U2OS 细胞接种于 6 孔板, 采用经 CCK 8 和流式检测作用较明显的 20 50nmol L -1 的华蟾酥毒基分别作用, 含等体积 DMSO 的 DMEM 培养基作为对照收集作用后 48h 的细胞,PBS 洗 2 次, 用 75% 的乙醇水 4 固定 5min,PBS 冲洗, Hoechst33258 染色 10min 后置于荧光显微镜下观察 2 5 实时荧光定量 PCR 分析细胞 CaspasemRNA 表达的变化收集不同浓度华蟾酥毒基作用 48h 后的 U2OS 细胞约个, 应用 TRIzol 法提取细胞总 RNA, 紫外分光光度计检测总 RNA 含量使用 RevertAid 第一链 cdna 合成试剂盒合成 cdna cdna(5μl; 1 100) 被添加到 12 5μL 的 2XSYBR 绿色荧光染料反应混合液, 使得总体积为 25μL, 以 GAPDH 为内参, 通过观察扩增曲线来测量 Caspase 3 Caspase 8 Caspase 9 的 CT 值 ( 扩增曲线达到阈值时的循环圈数 ) 数据处理采用相对定量中的 2 -ΔΔCt 计算结果来表示各个基因表达的水平, 最后取 3 次重复实验平均值作为最终

结果, 具体引物见表 1 表 1 引物信息表引物名称序列长度 /bp Caspase 3 上游引物 TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC 533 下游引物 CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG Caspase 8 上游引物 CTGGTCTGAAGGCTGGTTGT 275 下游引物 CAGGCTCAGGAACTTGAGGG Caspase 9 上游引物

结果 3 1 华蟾酥毒基对骨肉瘤 U2OS 细胞增殖的影响 CCK 8 检测发现, 用不同浓度华蟾酥毒基处理后, 在 24~72h 内 U2OS 细胞生长增殖均受到明显抑制 ( 与对照组相比,P<0 05 或 P<0 01), 并且抑制作用呈剂量依赖性, 在浓度为 20nmol L -1 时即出现抑制细胞增殖的作用, 在一定范围内随着华蟾酥毒基剂量的增加和作用时间的延长抑制效果增加,

着色均匀, 荧光呈弥散状, 比较黯淡 ( 见图 3) 华蟾酥毒基 (20 50nmol L -1 ) 处理 48h 后组细胞染色质凝聚, 细胞核裂解, 着色不规则, 部分浓聚, 呈现出细胞凋亡的典型变化即核碎裂, 产生凋亡小体 ( 见图 3) 图 3 Hoechst33258 荧光染色法显示不同浓度华蟾酥毒基处理后细胞形态学的改变 3 4 华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞 Caspase

3 结果, 具体引物见表 1 表 1 引物信息表引物名称序列长度 /bp Caspase 3 上游引物 TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC 533 下游引物 CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG Caspase 8 上游引物 CTGGTCTGAAGGCTGGTTGT 275 下游引物 CAGGCTCAGGAACTTGAGGG Caspase 9 上游引物 CTGCGAACTAACAGGCAAGC 290 下游引物 CTAGATATGGCGTCCAGCTG GAPDH 上游引物 ACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCAT 255 下游引物 GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAGG 2 6 统计学分析所有数据以 ( x±s) 珋表示, 用 SPSS13 0 软件进行 t 检验或 F 检验, 以 P<0 05 表示差异具有统计学意义 3 结果 3 1 华蟾酥毒基对骨肉瘤 U2OS 细胞增殖的影响 CCK 8 检测发现, 用不同浓度华蟾酥毒基处理后, 在 24~72h 内 U2OS 细胞生长增殖均受到明显抑制 ( 与对照组相比,P<0 05 或 P<0 01), 并且抑制作用呈剂量依赖性, 在浓度为 20nmol L -1 时即出现抑制细胞增殖的作用, 在一定范围内随着华蟾酥毒基剂量的增加和作用时间的延长抑制效果增加, 各个剂量及作用时间对 U2OS 细胞增殖的抑制作用均有统计学差异, 见图 1 注 : 与对照组比较, P<0 05, P<0 01; 下同图 1 CCK 8 法检测华蟾酥毒基对骨肉瘤 U2OS 细胞的抑制作用图 2 流式细胞术检测不同浓度华蟾酥毒基对骨肉瘤 U2OS 细胞的凋亡率 3 3Hoechst33258 荧光染色法观察细胞形态学改变荧光显微镜下对照组人骨肉瘤 U2OS 细胞核完整, 着色均匀, 荧光呈弥散状, 比较黯淡 ( 见图 3) 华蟾酥毒基 (20 50nmol L -1 ) 处理 48h 后组细胞染色质凝聚, 细胞核裂解, 着色不规则, 部分浓聚, 呈现出细胞凋亡的典型变化即核碎裂, 产生凋亡小体 ( 见图 3) 图 3 Hoechst33258 荧光染色法显示不同浓度华蟾酥毒基处理后细胞形态学的改变 3 4 华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞 Caspase 依赖的凋亡通路相关 mrna 表达的影响不同浓度的华蟾酥毒基作用于 U2OS 细胞 48h 后, 应用 RT PCR 法检测 Caspase 依赖的凋亡信号通路相关 mrna Caspase 3 Caspase 8 和 Caspase 9 的表达情况结果显示, nmol L -1 的华蟾酥毒基均能够提高 Caspase 3 Caspase 8 Caspase 9 mrna 的表达水平, 且随着浓度的增加, 促凋亡 mr NA 的表达量不断增高, 见图华蟾酥毒基对骨肉瘤 U2OS 细胞凋亡的影响通过 AnnexinV FITC 和 PI 双染标记法检测, 结果显示, 随着华蟾酥毒基浓度的增加, 凋亡率逐渐升高, 华蟾酥毒基 nmol L -1 组处理 48h 时, 其凋亡率分别为 (25 4±1 3)% (52 7±0 8)% (65 9±2 8)%, 与空白对照组 (2 1±0 3)% 比较, 差异均具有统计学意义 (P<0 01), 见图 2 图 4 不同浓度华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞 Caspase 依赖的凋亡通路相关 mrna 的表达 1251

4 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＳＶＮ用来进行凋亡细胞的形态学检测的研究本文通过讨论荧光显微镜下观察显示ｍＬ的华蟾酥毒尽管早期手术治疗结合新辅助化疗已很大程度基处理后可诱导骨肉瘤ＵＯＳ细胞发生凋亡细胞但目提高骨肉瘤患者的年生存率出现核固缩碎裂以及凋亡小体以上这些结果前仍有的患者死于骨肉瘤的远处转移都说明华蟾酥毒基可以诱导骨肉瘤细胞发生凋亡如何延缓其生长及转移进一步提高其治疗效果仍然是目前骨肉瘤治疗的难题之一传统化疗药研究发现细胞凋亡机制失调是恶性肿瘤发生发展的机制之一在细胞凋亡的执行过程中天因其毒副作用高和耐药性等原因常导致化疗失败冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶Ｃ家族起着非因此寻找一种具有高抗肿瘤活性的新型药物能够常重要的作用这种凋亡方式称为Ｃ依赖的细协助或者替代传统化疗药物促进骨肉瘤细胞的凋亡胞凋亡Ｃ家族包含多个成员在细胞凋亡过以减少传统化疗药物的使用时间和使用剂量降低以无程中起着非常关键的作用正常情况下Ｃ其毒副作用或逆转耐药性的发生从而提高骨肉瘤活性的酶原形式存在在促凋亡因素的作用下级联患者的耐受性和长期生存率是目前骨肉瘤的研究热激活而触发凋亡本文检测不同浓度华蟾酥毒基对点之一现代研究发现中药蟾皮或蟾酥的主Ｃ８ｍｒｎａ表达的影响从图的结果要成分华蟾酥毒基是一种甾体类具有较强的抗肿中可以看到ＵＯＳ细胞中Ｃ８ｍｒｎａ的瘤活性而得到广泛的关注华蟾素作为抗肿瘤中药表达在加入华蟾酥毒基处理后均有不同程度明显增制剂在肿瘤治疗方面应用很广对肝癌胃癌高提示华蟾酥毒基诱导的ＵＯＳ细胞凋亡与肺癌乳腺癌骨肉瘤等多种肿瘤都有一定的治疗Ｃ级联活化有关并可能同时涉及线粒体通路作用８此外相关毒理研究还证实其具有副作和死亡受体通路用小使用安全的特点目前认为华蟾酥毒基主要综上华蟾酥毒基具有抑制骨肉瘤ＵＯＳ细胞通过线粒体或ＦＦＬ介导的凋亡通路上调增殖并诱导细胞凋亡的作用其效应呈时间和浓度Ｃ蛋白酶诱导凋亡抑制Ｎ信号通路诱依赖性华蟾酥毒基可能通过Ｃ依赖的凋亡途导细胞周期阻滞调节凋亡抑制基因的表达等多种径诱导了ＵＯＳ骨肉瘤细胞凋亡其作用机制涉及机制诱导肿瘤细胞凋亡而对肿瘤起到治疗ｍｒｎａ表达最终可能与启动了细胞凋上调Ｃ作用８亡的信号转导的级联反应过程有关总之本研究在本实验中采用不同浓度的华蟾酥毒基体外作用于人骨肉瘤系ＵＯＳ通过ＣＣＫ８法检测细胞为华蟾酥毒基治疗骨肉瘤提供了新的实验依据下一步我们将进行更加深入的在体实验研究增殖发现不同浓度华蟾酥毒基可以抑制骨肉瘤细胞的增殖且其存活率与华蟾酥毒基的浓度和作用时间均有关当华蟾酥毒基浓度为ｍＬ作用时间８时抑制作用明显增强与对照组相比见图本研究与国差异有统计学意义Ｐ外其他学者研究结果相似提示华蟾酥毒基可以抑制骨肉瘤细胞的增殖对骨肉瘤细胞起到杀伤作用凋亡在肿瘤治疗中起着重要作用凋亡与肿瘤的发生发展有很大关系诱导肿瘤细胞凋亡对肿瘤治疗有重要意义许多抗癌药物都是通过诱导凋亡而发挥杀伤癌细胞的作用本文流式分析结果参考文献ＭＫＺＣＨＭＹＣｍｍｍｕｏｓＲＯＳＪＮＫ８ｗＯＲ８ＹＪＱＷＬＷＬＣＴＢｗｍＴＬ８李泉旺孙韬胡凯文华蟾素抗肿瘤机制的研究进展中华中医药杂志８ＱＦＬＡＩＹＡｍ显示华蟾酥毒基在体外试验中诱导人骨肉瘤ＵＯＳｍｍＢｚ细胞发生凋亡且其凋亡率随着华蟾酥毒基浓度的ＣＩＩｍｍｍ８可透过细胞膜增加而增加见图ＨＹＣＫＳＰＨＡ并对ＤＮＡ染色而发出明显而强烈的蓝色荧光常常

5 humanprostatecancercels[j].cancersci,2008,99(12): [6] QiF,InagakiY,GaoB,etal.Bufalinandcinobufaginin duceapoptosisofhumanhepatocelularcarcinomacelsvia Fas andmitochondria mediatedpathways[j].cancersci, 2011,102(5): [7] XieC,ChanW Y,YuS,etal.Bufalininducesautophagy mediatedceldeathinhumancoloncancercelsthroughre activeoxygenspeciesgenerationandjnk activation[j]. FreeRadicBiolMed,2011,51(7): [8] MaL,SongB,JinH,etal.CinobufaciniinducedMDA MB 231celapoptosis asociatedcelcyclearestandcytoskele tonfunction[j].bioorgmedchem Let,2012,22(3): [9] IsakofMS,BielackSS,MeltzerP,etal.Osteosarcoma:Cur renttreatmentandacolaborativepathwaytosucces[j].j ClinOncol,2015,33(27): [10] 赵亚恒, 冯和林, 郑丽华, 等. 骨肉瘤发病机制的研究进展 [J]. 肿瘤防治研究,2014,41(3): [11] 马瑞连, 王跃文, 包毅敏, 等. 骨肉瘤治疗新进展 [J]. 内蒙古医科大学学报,2013,35(S2): [12] 郭征. 我国骨肉瘤治疗的现状与问题及发展方向 [J]. 中国骨与关节杂志,2015,4(5): [13] 宋科官, 马德胜, 王洪智, 等. 华蟾素对 MG 63 骨肉瘤细胞杀伤作用的实验研究 [J]. 中国骨肿瘤骨病,2010,9 (3): [14] 宋科官, 张涛, 严峰, 等. 华蟾素和顺铂对骨肉瘤 MG 63 细胞联合杀伤作用的研究 [J]. 中国骨与关节杂志, 2014,3(3): [15]ChengL,ChenY,PengY,etal.Ceramideproductionmedi atescinobufotalin inducedgrowthinhibitionandapoptosis inculturedhepatocelularcarcinomacels[j].tumorbiol, 2015,36(8): [16] 邵淑丽, 刘盛楠, 张蕾, 等. 华蟾素诱导人胃癌 SGC 7901 细胞凋亡 [J]. 基因组学与应用生物学,2015,34(9): [17]KaiS,LuJ,HuiP,etal.Pre clinicalevaluationofcinobufo talinasapotentialanti lungcanceragent[j].biochembio physrescommun,2014,452(3): [18] SousaLQ,MachadoKD,OliveiraSF,etal.Bufadienolides from amphibians:a promisingsourceofanticancerproto typesforradicalinnovation,apoptosistriggeringandna + / K + ATPaseinhibition[J].Toxicon,2017,127: [19]YinPH,LiuX,QiuYY,etal.Anti tumoractivityandap optosis regulationmechanismsofbufalininvariouscancers: newhopeforcancerpatients[j].asianpacjcancerprev, 2012,13(11): [20]CaoY,YuL,DaiG,etal.Cinobufagininducesapoptosisofos teosarcomacelsthroughinactivationofnotchsignaling[j]. EurJPharmacol,2017,794: [21]WangD,BiZ.Bufalininhibitedthegrowthofhumanosteo sarcomamg 63celsviadown regulationofbcl 2/Baxand triggeringofthemitochondrialpathway[j].tumorbiol, 2014,35(5): [22]QiF,LiA,InagakiY,etal.Inductionofapoptosisbycinob ufacinipreparationthroughmitochondria andfas mediated caspase dependentpathwaysinhumanhepatocelularcarci nomacels[j].foodchemtoxicol,2012,50(2): [23] 邱淑敏, 陈涛, 刘美玲, 等. 中药诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展 [J]. 动物医学进展,2015,36(1): ( 收稿日期 ) 1253