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1 35 中国热带医学 217 年第 17 卷第 4 期 China Tropical Medicine,April 217,Vol.17,No.4 方法 论著 白藜芦醇诱导肺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞的分子机制 摘要 : 目的 高晓天, 容秋萍, 宋泽庆 广东医科大学附属医院心胸外科, 广东湛江 5241 探讨白藜芦醇对肺癌细胞系 A549 细胞增殖与细胞周期阻滞及细胞凋亡之间的联系 采用 MTT 法检测白藜芦醇对 A549 细胞增殖的影响 ; 用 Western 印迹法检测白藜芦醇作用后 A549 和 中凋亡相关蛋白 cleaved-caspase-3 cleaved-caspase-7 cleaved-caspase-9 cleaved-parp 及细胞周期相关蛋白 cyclin D1 cyclin D3 和 CDK2 CDK4 CDK6 p53 p18 p21 p27 的表达情况 ; 通过流式细胞仪技术检测白藜芦醇诱导 A549 细胞凋亡率以及细胞周期阻滞的影响 结果 白藜芦醇对 A549 的生长均有抑制作用, 呈浓度 依赖性 ; 经白藜芦醇处理后,A549 的周期蛋白 cyclin D1 cyclin D3 和 CDK2 蛋白的表达水平上调, 而周期蛋白 CDK4 CDK6 p53 p18 p21 p27 的表达水平下调 ;A549 的凋亡相关蛋白 cleaved-caspase-3 cleaved-caspase- 7 cleaved-caspase-9 cleaved-parp 的表达水平上调 ; 流式细胞仪检测 A549 的细胞凋亡率随白藜芦醇的浓度 上升而增加, 流式细胞仪检测细胞周期即可观察到随白藜芦醇的浓度的增加, 细胞周期明显阻滞于 G 1/S 期 结论 藜芦醇可能是通过促进 caspases 通路的活化, 从而促进细胞凋亡 ; 周期蛋白 cyclin D1 cyclin D3 和 CDK2 蛋白的表达水 平的上调和 CDK4 CDK6 p53 p18 p21 p27 的表达水平的下调可能是白藜芦醇诱导人肺癌细胞发生 G 1/S 期阻滞的关 键机制 关键词 : 白藜芦醇 ; 细胞周期 ; 细胞凋亡 ;A549; 中图分类号 :R734.2 文献标识码 :A 文章编号 :9-9727(217) DOI:1.1364/j.cnki /r Molecular mechanism of resveratrol inhibiting proliferation of human lung cancer cells through inducing cell cycle arrest and apoptosis GAO Xiaotian, RONG Qiuping, SONG Zeqing Department of Cardiothoracic Surgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong 5241, Abstract: Objective China To elucidate the potential action mechanisms of resveratrol on human lung cancer cell lines. Methods The MTT method was used to detect the cell proliferation activity of the lung cancer cell lines A549, and the Western blot method was used to detect the expressions of the apoptosis related proteins (cleaved caspase- 3, cleaved caspase- 7, cleaved caspase- 9, and cleaved PARP) and the cell cycle related proteins (cyclin D1, cyclin D3, CDK2, CDK4, CDK6, p53, p18, p21 and p27). The flow cytometry was used to detect the cell cycle change and apoptosis situation of resveratrol- treated cell populations. Results Resveratrol displayed the concentration- dependent inhibitory effect in lung cancer cell lines A549 growth. Treated with resveratrol, the expression levels of cyclin D1, cyclin D3 and CDK2 proteins were up-regulated but the expression levels of CDK4, CDK6, p53, p18, p21 and p27 were down-regulated in A549 cell lines. There was an obvious up-regulation to the expression levels of cleaved caspase- 3, cleaved caspase-7, cleaved caspase- 9, cleaved PARP in A549 cell lines with resveratrol treatment. The flow cytometry detection showed that with the increase of the concentration of resveratrol, the apoptosis proportion increased in A549 lung cancer cell lines and the cell cycle was blocked in G 1/S phase obviously. Conclusions 白 Resveratrol can promote the caspase activation and cell apoptosis, and down-regulate the expression levels of cyclin D1, cyclin D3 and CDK2, but up-regulate the expression levels of CDK4, CDK6, p53, p18, p21 and p27, which may be the key mechanisms that resveratrol induces G 1/S phase block in human lung cancer cells. Key words: resveratrol; cell cycle; cell apoptosis; A549; 肺癌是一种对人类健康和生命威胁很大的恶性 [1] 肿瘤, 在我国肺癌发病率和死亡率呈上升趋势 目前肺癌已位居恶性肿瘤发病率和死亡率之首, 寻找一种作用靶点多而副作用少的药物至关重要 白藜芦醇 (resveratrol,res) 是一种含有芪类结构的非黄酮类 多酚化合物, 其化学名称为 3,5,4 - 三羟基 -1,2- 二苯乙烯, 主要来源于虎杖 葡萄 花生 桑椹 松树等多种植物 近年来, 研究显示白藜芦醇能够抑制多种肿瘤的发生 发展, 如乳腺癌 结肠癌 前列腺癌 白血病 [2] 肝癌等 研究也发现白藜芦醇对肺癌具有一定的抗 作者简介 : 高晓天 (1983 ), 男, 博士, 主治医师, 研究方向 : 肺癌的基础与临床

2 中国热带医学 217 年第 17 卷第 4 期 China Tropical Medicine,April 217,Vol.17,No 肿瘤作用, 其抗肿瘤作用机制未得到明确阐述 本研究通过 MTT 法 Western 印迹法及流式细胞仪技术, 进一步探讨白藜芦醇引起人肺癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的分子机制, 以期对肺癌细胞分子生物学特征和白藜芦醇在肺癌治疗的临床应用提供理论依据 1 材料与方法 1.1 材料 细胞系人肺癌细胞系 A549 由广东医科大学附属医院呼吸内科研究室提供 试剂和仪器白藜芦醇 (resveratrol) 购于美国 SIGMA 公司, 细胞周期蛋白试剂盒和细胞凋亡蛋白试剂盒购于 Cell Signaling Technology (Beverly, MA) 公司, 细胞周期流式试剂盒购于 Beyotime, China 公司, BCA 蛋白浓度检测试剂盒购于 Beyotime Institute of Biotechnology 公司 1.2 方法 细胞培养用含 1% 小牛血清及含青霉素 链霉素的 RPMI-164 培养基来培养细胞, 置于 37 5%CO 2 饱和湿度的细胞培养箱中进行培养, 每 1~2 d 换液或传代培养 取生长对数期的细胞用于以下实验 肺癌细胞 A549 细胞形态学观察肺癌细胞 A549 分别按 /ml 的密度接种于 24 孔板中, 每孔.5 ml; 培养液中分别加白藜芦醇 25 5 和 μmol/l 设置为实验组, 同时设阴性对照组, 每组设 5 个复孔, 培养 24 h, 在显微镜下观察细胞形态并拍照 MTT 检测 RES 对肺癌 A549 细胞增殖活性的影响收集生长对数期细胞, 调整细胞悬液浓度, 每孔加 μl, 使待测细胞调密度至 5 ~1 个 / 孔 ( 边缘孔用无菌 PBS 填充 ),5%CO 2,37 孵育, 待细胞单层铺满孔底 (96 孔平底板 ), 加浓度梯度的 RES, 每孔 μl, 设 5 个复孔 5%CO 2,37 孵育 2~4 h, 倒置显微镜下观察 每孔加 2 μl MTT 溶液 (5 mg/ml, 即.5% MTT), 继续培养 4 h 若药物与 MTT 能够反应, 可先离心后弃去培养液, 小心用 PBS 冲 2~3 遍后, 再加含 MTT 的培养液 终止培养, 吸去孔内培养液 每孔加 15 μl 二甲基亚砜 (DMSO), 置摇床低速振荡 1 min, 使结晶物充分溶解 在酶联免疫检测仪 OD 49 nm 测各孔吸光值 同时设置调零孔 ( 培养基 MTT DMSO), 对照孔 ( 细胞 相同浓度的药物溶解介质 培养液 MTT DMSO) 流式细胞仪检测人肺癌细胞株 A549 细胞凋亡率加入 RES 各浓度后培养 A549 细胞 24 h, 用胰酶将细胞消化收集对照组和实验组不同浓度 RES 作用后的肺癌细胞制备成细胞悬液 胰 酶消化时间不宜过长, 否则易引起假阳性 离心去上清 用 PBS 洗涤细胞 2 次并离心去上清 将试剂盒内的 Binding Buffer 稀释 1 倍, 分别加 5 μl FITC 及 5 μl PI μl 稀释后的 Binding Buffer( 每管量 ), 混匀, 室温下避光孵育 2 min, 后加 4 μl 稀释后的 Binding Buffer( 每管量 ), 尽快上机进行流式检测 Annexin V 阳性 PI 阴性细胞为早期凋亡细胞, Annexin V 和 PI 双阳性细胞为晚期凋亡细胞 流式细胞仪检测 A549 细胞周期加入 RES 各浓度后培养 A549 细胞 24 h, 用胰酶消化收集细胞, 离心去上清 预冷 PBS 洗 2 遍, 离心弃上清, 加 1 ml 7% 预冷乙醇, 轻吹打均匀,4 固定 12 h 以上 PBS 洗涤去乙醇, 洗 2 遍.5 ml PBS 重悬细胞, 加 PI 和 RNaseA 至终浓度 5 μg/ml,37 避光温浴 3 min, 用流式细胞仪测定细胞周期 Western bloting 采用 Western bloting 检测 RES 对肺癌细胞周期阻滞相关周期蛋白的表达水平 细胞凋亡相关蛋白的表达水平 1.3 统计学分析数据采用 SPSS17. 统计软件进行统计分析, 正态分布资料以均数 ± 标准差表示 多样本间均数比较先采用方差分析, 两样本间均数比较采用 t 检验, 以 P<.5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 RES 可抑制人肺癌细胞系 A549 的增殖活性正常培养条件下的 A549 细胞呈饱满梭形, 核为椭圆, 细胞增殖明显 当分别用 25 5 μmol/l 的 RES 处理细胞 24 h 时, 细胞开始出现明显的形态学改变, 表现为细胞变得细长, 呈细线样, 并有若干十分明显的突起 ( 触 ) 与正常对照组相比, 细胞增殖受到明显抑制, 细胞数量明显减少 同时可观察到细胞凋亡现象, 并在 24 h 时这种现象更为明显, 见图 1 MTT 结果表明, 在同一时间点 (24 h), 随着 RES 的浓度增加,A549 细胞存活的数量随之减少, 细胞增殖受到明显抑制, 见表 1~2 RES 对 A549 细胞的最佳抑制作用浓度约为 μmol/l 由此可见,RES 对 A549 细胞具有抑制增殖作用, 且具有浓度 - 时间依赖性 2.2 白藜芦醇阻滞 A549 的细胞周期于 G 1/ S 期前期研究发现, 白藜芦醇可以使 A549 细胞系细胞周期阻滞于 G 1/S 期, 为进一步探讨白藜芦醇对 细胞系细胞的细胞周期进程的影响, 我们采用流式细胞技术来检测并分析细胞周期的变化情况, 结果显示 : 在 A549 细胞系中, 经白藜芦醇处理 24 h 后, 随着药物浓度的增高细胞阻滞于 G 1/S 期的现象越来越明显, 见图 2

3 352 中国热带医学 217 年第 17 卷第 4 期 China Tropical Medicine,April 217,Vol.17,No.4 Control 25 μmol/l 5 μmol/l μmol/l A549 Fig. 1 图 1 白藜芦醇处理前后 A549 的细胞形态学变化 ( ) Cell morphological changes of A549 after resveratrol action( ) A549 Number G/G1:3.69 S:29.42 G2/M:39.89 Control 25 μmol/l 5 μmol/l μmol/l G/G1:57.99 S:25.15 G2/M: Channels (PI-A) Fig. 2 图 G/G1:61.78 S:34.92 G2/M:3.3 G/G1:36.66 S:43.13 G2/M: 白藜芦醇处理前后 A549 细胞系中细胞周期的变化 Cell cycle changes of A549 before and after resveratrol action G/G1:38.1 S: G2/M: G/G1:65.6 S:31.32 G2/M: G/G1:66.18 S:25.71 G2/M:8.11 G/G1:42.75 S:11.82 G2/M: 表 1 Table 1 组别 Group 对照 Control RES 注 :*: 与空白对照组比较,P<.5;#: 与 25 μmol/l 组比较,P<.5; : 与 5 μmol/l 组比较,P<.5 Note:*: Compare to control,p<.5;#: Compare to 25 μmol/l group,p<.5; : Compare to 5 μmol/l group,p<.5. Res 处理 A549 24h 后细胞抑制 (%) Cell inhibition ratios of A549 after resveratrol act in 24 h(%) 药物剂量 Drug dose 细胞抑制率 Cell inhibition ratio A549 细胞 A549 cells 1.1± ±.7 * 47.8±1.2 *# 53.9±1.5 *# 细胞 cells 2.± ±2.4 * 42.5±.8 * 51.8±1.6 *# 表 2 Res 处理 A549 细胞 24h 后细胞凋亡率 (%) Table 2 组别 Group 对照 Control RES 注 :*: 与空白对照组比较,P<.5;#: 与 25 μmol/l 组比较,P<.5; : 与 5 μmol/l 组比较,P<.5 Note:*: Compare to control,p<.5;#: Compare to 25 μmol/l group,p<.5; : Compare to 5 μmol/l group,p<.5. Cell apoptosis rates of A549 after resveratrol act in 24 h(%) 药物剂量 Drug dose 细胞抑制率 Cell inhibition ratio(%) A549 细胞 A549 cells 11.1± ±2.1 * 34.2±1.8 *# 43.1±1.4 *# 细胞 cells 5.7± ±2. * 29.8±1.5 * 34.3±1.4 *#

4 中国热带医学 217 年第 17 卷第 4 期 China Tropical Medicine,April 217,Vol.17,No RES 对 A549 凋亡率和凋亡相关蛋白 的影响 经流式细胞仪检测, 在 A549 细胞 系中, 随 RES 的浓度增加, 细胞凋亡率随之增加, 且两 种细胞系的凋亡率相近, 见表 2 Western blot 结果显 示 : 在 A549 细胞系中, 正常对照组与 RES 处 理组 (25 5 和 μmol/l) 中均检测出凋亡相关蛋白 cleaved- caspase- 3 cleaved- caspase- 7 cleavedcaspase-9 cleaved-parp 的表达水平上调, 见图 RES 作用前后 A549 细胞周期蛋白的 表达 Western blot 结果显示, 在 A549 中, cyclin D1 cyclin D3 和 CDK2 蛋白的表达水平下调, 而 CDK4 CDK6 p53 p18 p21 p27 的表达水平上调 ; 两 种细胞系相关的蛋白表达水平没有明显的差异, 总的 趋势是一致的, 见图 4 cleaved-caspase-3 cleaved-caspase-7 cleaved-caspase-9 图 3 Fig. 3 cleaved-parp GAPDH A549 resveratrol resveratrol Control 25 5 Control 25 5 RES 对 A549 细胞系中凋亡相关蛋白的影响 p52 p21 p27 CDK2 CDK4 CDK6 p18 CyclinD1 CyclinD3 图 4 Fig. 4 GAPDH Expressions of apoptosis related proteins of A549 and before and after resveratrol action A549 resveratrol resveratrol Control 25 5 Control 25 5 RES 对 A549 细胞系周期蛋白表达的影响 Expressions of cyclin proteins before and after resveratrol action 3 讨论 白藜芦醇是一类多酚类化合物, 具有抗肿瘤 抗 炎 抗氧化 抗血小板聚集 抗动脉粥样硬化等多种 药理学活性, 许多研究显示白藜芦醇是一种很有前 景的预防及治疗癌症的药物, 其可通过抑制肿瘤增 殖 调控肿瘤细胞周期及引起肿瘤细胞凋亡等多种 作用机制发挥其抗肿瘤作用, 如在结肠癌 前列腺 [3-5] 癌 乳腺癌 胰腺癌 肝癌 白血病等多种肿瘤中已 深入研究得到证实, 在肺癌中的相关研究也是一大 研究热点 本研究是从细胞周期调控 细胞凋亡多个角度研 究白藜芦醇对人肺癌细胞株 A549 细胞的抑 制作用 结果发现, 不同浓度白藜芦醇作用下的人肺 癌细胞株 A549 细胞, 与空白对照组相比, 随 着浓度增加,G /G 1 期及 S 期的细胞比例显著升高 由 此可说明白藜芦醇可通过诱导特定信号通路使细胞 周期阻滞于 G /G 1 期及 S 期, 从而抑制肿瘤细胞增殖, 两种不同的肺癌细胞株无明显差别 研究表明 [6] 白 藜芦醇可通过上调 p21 p27 和下调 cyclin A cyclin D1 使白血病细胞阻滞于 G /G 1 期, 这与 Joe AK [7] 等人 的关于上皮腺癌细胞株 A431 和食管癌细胞株 Bic-1 的研究发现可被阻滞于 G /G 1 期的结果一致, 而 Notas 等 [8] 研究发现肝癌细胞株 HepG2 被阻滞于 G 2/ [9] M 期 ;Panayiotidis 等研究认为人肺癌 A549 细胞株 被阻滞于 G 2 /M 期, 而本实验结果发现细胞周期阻滞 于 G /G [1] 1 期及 S 期, 这与国内陈加顺等研究结果相一 致, 其发现白藜芦醇能明显抑制人肺腺癌 A549 细胞 的增殖, 其可通过调节细胞周期蛋白 cyclin D1 p21cip1 的表达调控细胞周期进程, 使细胞阻滞于 G / G 1 期, 抑制细胞的增殖 本实验结果显示, 经白藜芦醇作用后, 人肺癌细 胞株 A549 导致周期蛋白 cyclin D1 cyclin D3 和 CDK2 蛋白的表达水平下调, 而周期蛋白 CDK4 CDK6 p18 p21 p27 的表达水平上调, 细胞将被阻滞 于 G 1/S 期, 与此同时, 可诱导细胞凋亡蛋白 cleavedcaspase- 3 cleaved- caspase- 7 cleaved- caspase- 9 cleaved- PARP 的表达水平上调, 从而促进细胞凋 亡 cyclind1 为 G 1 期细胞周期素, 定位于染色体 11q13 区, 具有持家基因和生长调节基因特点, 它可 与 CDK4 /CDK6 结合而形成复合物, 使 Rb 发生磷酸 化而与细胞转录因子分离, 驱动细胞由 G1 期进入 S 期, 促进细胞增殖 因而当 cyclin D1 或 CDK4 /CDK6 表达失控时, 可能导致细胞增殖周期失调 p21cip1 基因定位于人的染色体 6p21. 2 区, 又称 WAF1 或 Cip1 基因 p21cip1 几乎能与所有的 cyclin-cdk 复 合物结合, 抑制 cyclin-cdk 复合物的蛋白激酶活性,

5 354 中国热带医学 217 年第 17 卷第 4 期 China Tropical Medicine,April 217,Vol.17,No.4 使蛋白质磷酸化受阻, 细胞停滞在 G1 期 本实验发 现白藜芦醇下调 cyclin D1 cyclin D3 和 CDK2 的表 达, 上调 CDK4 CDK6 p18 p21 p27 的表达 Kim [11] 等研究 A431 细胞株认为白藜芦醇下调 cyclin D1 表 [12] 达, 上调 p21cip1 表达 ; 而 Nakamura 等研究 CaCo-2 细胞株认为, 白藜芦醇下调 cyclin D1 表达, 对 [13] p21cip1 表达无影响 ;Prazakova 等研究 HL6 细胞表 明白藜芦醇对 cyclin D1 和 p21cip1 的表达都未产生影 [14] 响 研究显示二倍酰基 - 白藜芦醇通过活化白血病 细胞株 HL-6 的 caspase 3 促进凋亡 发挥促凋亡 细 胞周期阻滞 抑制淋巴 - 上皮细胞间隔的分化等的多 方面的抗癌作用主要是通过,cyclin D1 的显著下降, Chk2 表达的增加, 下调 Cdc25A 的表达, 上调 p21 (Cip/ Waf 的表达使细胞阻滞于 G1 期 还可抑制核苷酸还 原酶活性, 还表明可抑制球状体的脂氧合酶代谢从而 控制肿瘤的转移速度 参考文献 [1] 王秦, 葛华, 李长江. 非小细胞肺癌组织中 BRCA1 和 C-Myc 的表达 与临床意义 [J]. 中国热带医学,215,15(7): [2] 韩志远, 张慧, 杨巧媛. 白藜芦醇抑制 H46 肺癌细胞的增殖作用研 究 [J]. 中国热带医学,214,14(1): [3] MOHAPATRA P,SATAPATHY S R,DAS D, et al. Resveratrol mediated cell death in cigarette smoke transformed breast epithelial cells is through induction of p21waf1/cip1 and inhibition of long patch base excision repair pathway[j].toxicol Appl Pharmacol,214, 275(3): [4] YANG L,YANG L,TIAN W,et al. Resveratrol plays dual roles in pancreatic cancer cells[j]. Cancer Res Clin Oncol,214,14(5): [5] 唐梦君. 白藜芦醇对肝癌 Bel-744 细胞增殖 凋亡 侵袭影响机制研究 [J]. 海峡药学,213,25(2): [6] GE J,LIU Y,LI Q,et al. Resveratrol induces apoptosis and autophagy in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt/mTOR and activating p38-mapk[j].biomed Environ Sci,213,26(11) : [7] JOE A K,LIU H,MASUMI S,et al.resveratrol induces growth inhibition,s- phase arrest, apoptosis and changes in biomarker expression in several human cancer cell lines[j]. Clin Cancer Res, 22,8(3): [8] NOTAS G,NIFLI A P,KAMPA M,et al.resveratrol exerts its antiproliferative effect on HepG2 hepatocellular carcinoma cells,by inducing cell cycle arrest, and NOS activation[j].biochim BiophysActa,26,176( 11) : [9] PANAYIOTIDIS M I,RANCOURT R C,PAPPA A,et al.effect of cell cycle growth arrest on global DNA methylation status in human lung epithelial-like ( A549) cells[j].in Vivo,26,2 ( 6B): [1] 陈加顺, 吕俊明, 束永前, 等. 白藜芦醇对人肺腺癌 A549 细胞周期的影响及其机制研究 [J]. 临床肿瘤学杂志,211,16( 6): [11] KIM Y A,LEE W H,CHOI T H,et al.involvement of p21waf1/cip1, prb, Bax and NF-kappaB in induction of growth arrest and apoptosis by resveratrol in human lung carcinoma A549 cells[j].int J Oncol, 23,23(4): [12] NAKAMURA H,SAJI H.Worldwide trend of increasing primary adenocarcinoma of the lung[j].surg Today,214,44(6): [13] PRAZAKOVA S,THOMAS PS,SANDRINI A,et al.asbestos and the lung in the 21st century: an update[j].clin Respir J. 214,8(1):1-1. [14] MADLENER S,SAIKO P,VONACH C,et al. Multifactorial anticancer effects of digalloyl- resveratrol encompass apoptosis, cell- cycle arrest, and inhibition of lymphendothelial gap formation in vitro[j].br J Cancer,21,12(9): 收稿日期 : 编辑 : 符式刚 中国热带医学 诚邀国内外审稿专家 为充实审稿专家队伍, 完善审稿机制, 把握来稿科学性 鉴定创新性和确定应用性, 保障期刊质量的不断提高, 我编辑部诚邀国内外从事热带医学范畴研究的病原生物学 临床治疗学 临床诊断学 现场流行病学 教学或管理及相关领域的专家学者为我刊审稿人 如果您具有副高级及以上职称, 了解国内外本领域的研究进展, 能按杂志审稿要求进行审稿, 请申请, 诚挚欢迎您成为我刊审稿人 为表谢意, 本刊向每位审稿人免费赠阅 中国热带医学, 优先发表审稿人或审稿人推荐的论文, 并支付审稿费, 每卷卷终期刊出全年审稿专家名单 编辑部地址 : 海南省海口市海府路 44 号, 邮政编码 :5723 中国热带医学 编辑部; 联系人 : 符式刚, 电话 : , 传真 : ( 自动 ), ctmffff@vip.163.com;ctmffff@163. com; 网址 :

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