中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! "#$% &# 2 (!% # (! 2,)5.#!#$ 3!# (* (* ()$+!# ) * 6(; 6( (. (* 8 & ). (* 2 8 : 8 : 6.$ 6.$ 4 6).$ ! ) ) & 2.! (* 2 8 :8 : %

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1 中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! "#$% &# 基础研究 白花蛇舌草对香豆酸组合物对急性髓系白血病细胞 (* ) 生长抑制作用 陈 智 林圣云 蒋剑平 王 博 沈英英 裘 玫 李建新 摘要 目的 研究白花蛇舌草对香豆酸组合物 #($.# (!) * # 2+#)* 2) *( )$$2 / 对急性髓系白血病 (* ) 细胞株生长抑制作用 方法 采用不同浓度的 / 314 作用于对数生长期的 (* ) 细胞 法检测 / 对 (* ) 细胞株作用 5 后的生长抑制作用 再以经一定浓度 314 的 / 处理 5 后的 (* ) 细胞为对象 采用 #.5* 染色法观察 (* ) 细胞凋亡的形态学改变 *! 6$# 检测 (* ) 细胞中有关凋亡信号传导通路蛋白 (* (* 家族 6.$ 家族 凋亡抑制蛋白 78* 家族 78 * 信号通路蛋白的变化情况 结果 的 / 可明显抑制白血病 (* ) 细胞株的增殖 与空白组比较 细胞存活率明显降低 8 : 呈时间 浓度依赖性 (* ) 细胞核内凋亡小体随着药物浓度的增加逐渐增多 与空白组比较 / 314 组 (* (* 家族蛋白 6(;6( (. (* 8 & 升高 8 : 8 : 6.$6.$ 46).$ ! ) ) & 降低 8 : 8 : 结论 / 可抑制 (* ) 细胞增殖并诱导其凋亡 其凋亡机制与 (* (* 家族蛋白 6.$ 家族蛋白和 78* 家族蛋白表达变化以及 78 * 信号通路的激活相关 关键词 白花蛇舌草对香豆酸组合物 急性髓系白血病 细胞凋亡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基金项目 浙江省中医药优秀青年人才基金项目 &#% ' 作者单位 % 华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院小儿血液肿瘤科 武汉 % 浙江中医药大学附属第一医院血液科 杭州 % 湖北中医药大学中医临床学院伤寒教研室 武汉 通讯作者 林圣云 $ ()$$*+,,- %.# /0 1. )

2 中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! "#$% &# 2 (!% # (! 2,)5.#!#$ 3!# (* (* ()$+!# ) * 6(; 6( (. (* 8 & ). (* 2 8 : 8 : 6.$ 6.$ 4 6).$ ! ) ) & 2.! (* 2 8 :8 : % #.$ *)# /.# $2 *)3 ) ).( $+ ) 5) ) 5!#$)!()# # ( * ). $$* ( 2 ) 2. )* ( # #*)*% *.5( )* (+ ) #$ 5 (* (* 6.$ ( 2 78* ()$+!# ) * ( *)3 ($) 3 (5,(+*% 0 / #($.# (!) * # 2+#)* 2) *( )$$2 (. + $#3 # * $ ; )( ( # #*)* 急性髓系细胞白血病 (. + $#)2 $ ; ) ( 7 4 是一类具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤 尽管治疗方法和新技术的不断优化和发展 绝大多数患者仍面临复发并最终死亡的结局 因此 迫切需要新的药物来提高疗效 从传统中草药中开发出高效低毒甚至高度特异性的靶向药物是目前临床热点之一 对香豆酸属于酚酸类化合物 研究发现其有很 好的抗氧化和抗菌 抗突变活性 但最重要的是能抑制肿癌细胞生长 尤其对消化道肿瘤 而对白血病的作用研究较少 因此本研究将从白花蛇舌草中提取到的对香豆酸组合物 #($.# (!) * # 2+#)* 2) *( )$$2 / 作用于 7 4 细胞株 (* ) 以研究 / 在体外对 (* ) 的作用和机制 为临床治疗白血病提供新的候选药物 材料与方法 细胞株及培养 人髓系细胞白血病细胞株 (* ) 细胞株由浙江大学血液学研究所惠赠 购自美国标准生物品收藏中心 货号 4 0 饱和湿度环境下 胎牛血清的 8 培养液中培养 细胞密度为 14 9 天换液传代 次 取对数生长期细胞进行实验 药物 / 由浙江省中医院中药制剂室从白花蛇舌草 购自杭州萧山医药公司中药分公司 批号 提取和制备 将全草粉碎后加乙醇萃取 将提取物用蒸馏水溶解 利用乙酸乙酯液 液萃取 再将提取物溶解于蒸馏水中 乙醇连续多次洗脱 将乙醇馏分洗脱物收集和干燥后 用蒸馏水配成 314 样品 其中主要成分为对香豆酸 以上 反式 0 对香豆酰鸡屎藤苷甲酯 以上 并已申请专利 专利号 主要试剂及仪器 二甲基亚砜 / 0 购自中国杭州化学试剂有限公司 四甲基偶氮唑蓝 及碘化丙啶 8 试剂盒购自美国 )3(7$2!).5 公司 流式凋亡检测试剂盒购自美国 6)# )A! 公司 (* (* +#8 786(26.$6.$ 46(;6( 6)26).$ ! ) ) (. 抗体购自美国 $$ )3 ($) 3 公司 (.) 抗体购自美国 ( (! = 公司 *! 6$# $ ) #$ 试剂盒 4 购自以色列 6)#$#3).($ 2 *!) * 公司 细胞培养箱购自美国?#!(.) ) ). 公司 荧光倒置显微镜购自日本 0$+ * 公司 垂直电泳及转膜装置购自美国 60 7/ 公司 检测指标及方法 比色法检测细胞增殖抑制情况 取对数生长期 (* ) 细胞以 14 接种于 孔培养板 使每孔终体积为 4 按终浓度 314 分别加入 / 置于培养箱中孵育 和 5 后 每孔加入 4 0 饱和湿度的培养箱中继续培养 5!1) 离心 ) 弃上清 加入二甲基亚砜 / 0 41 孔 待蓝紫色甲 充分溶解后 于紫外分光光度仪测 处吸光度值 0/ 值 按照公式计算细胞存活率 B 处理组 0/ 值 1 对照组 0/ 实验重复 次 设复孔 个 取平均值为最终结果 用 4#3) 法计算半数抑制浓度 #.5* 荧光染色检测细胞凋亡 取对数生长期 (* ) 细胞以 个 14 进行实验 将细胞悬液接种于 孔板 使每孔终体积为 4 分别加入 / 使终浓度分别达到 314 设置空白组 作用于 (* ) 细胞 5 后 收集空白组及药物处理组细胞 离心 86 洗涤 次 弃上清 甲醛 4 分别移至 8 管 放入培养箱中 ) 离心弃甲醛 用移液器在干净玻璃片上涂单层细胞 待涂层干燥后 86 摇床洗 次 每次 ) 的 86 在摇床上透化 ) 再用 86 摇床洗 次 每次 ) 每张玻片用 314 #.5* 染液均匀滴涂于细胞涂层 避光反应 ) 弃 #

3 " %" $! 中国中西医结合杂志!"#$ 年 % 月第 &$ 卷第 % 期 '()*+,! -./0.12.3!"#$! 4567 &$! 85!%.FSB0&&!=> 染液!VT- 摇床洗 & 次!每次 #" 1AM ( 分 别用低倍$#" '%'高倍$;" '%'油镜$#"" '% 观察并拍 或作用时间延长! 对 K@BL1A # # 细胞增殖抑制作用加 强!抑 制 作 用 呈 现 出 时 间 "浓 度 依 赖 关 系 $ 3 f 照( 每张片随机选取 & 个视野!实验重复! 次( %<! % ( *'OG+ 作用后的 K@BL1A # # 细胞! 存活率 与空白组比较明显下降 $V X! "# V X "= % ( 且相 ;! & $+.B0.3M T650 分析相关蛋白表达水平 $ 检 测 '@B/@B. 家 族 蛋 白 $ [U[V! '@B/@B. # &! '@B/@B. # >! '@B/@B. # %! 'C05 # ' % ' TF6 #! 家族蛋白 $ T@P! T@Y! T@Z! TF6 #!! TF6 # \R! TAP! TA1!,F6 # #%! 同浓度$ "< W #" 1QI1R % 时!作用 ;> S 的细胞存 活率 比 作 用!; S 的 也 明 显 降 低 $ V X "#! V X "= % ( 细胞凋亡抑制蛋白 $ \)UV! ')UV#! ')UV!! -L3]A]AM! -1@F % 及,UVKB 信 号 通 路 蛋 白 $?[K! / #?[K! [@B!/ # V&>!(8K! / # (8K % 表达( 总蛋白提取后! 按 T3@N53P 法测蛋白浓度! 取 #"!Q 蛋白样品与! '加 样缓冲液等体积混合! 煮沸变性 = 1AM 后进行 #"" ' #!" 或 #=" QIR 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离! 电转移至 V4Gc 膜上!室温封闭 # S!立即加入一抗溶液!平缓摇 动!; &过夜!室温下加二抗溶液孵育 # S ( 作为内 参 照! 显 影 参 照?'R 试 剂 盒 说 明 书 操 作! 用 )VV 灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平! 各实验均重 复 & 次( +.B0.3M T650 显 示 的 蛋 白 条 带 扫 描 后 用 )1@Q.eL@M0=! # 软件进行量化分析! 其灰度用 HG 值 $$注#与空白组比较! " "=! S 组比较! V X! V X "=!!! V X "#&与同浓度!; "" V X "# 图 #%各浓度 *'OG+ 组 K@BL1A# # 细胞株增殖 抑制作用比较 计算( = $统计学方法 $ 实验数据采用 -V-- #$!" 软 件分析! 计 量 资 料 用 Z )B 表 示 ( 方 差 齐 性 检 验 后!! $各组 K@BL1A # # 细胞株凋亡形态学结果$ 图! % 荧光显微镜下发现空白组细胞内几乎未见蓝色荧光增 组内多组间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析! 组 间 两 两 比 强的凋亡小体! 而在实验组中! 随着药物浓度增加! 凋 较时采 用-8K#e 检 验! V X "!"= 为 差 异 有 统 计 学 意义 ( 亡小体逐渐增多( 结$$果 # $各组 K@BL1A # # 细胞株存活率比较$ 图 #%$K@# BL1A # # 细 胞 经 *'OG+ $ ' ";' "<' ">' #" 1QI1R % 作 用!; S 和 ;> S 后! 不 同 浓 度 的 *'OG+ 均可抑制细胞增殖! 随着 *'OG+ 浓度增加 & $各组 K@BL1A # # 细胞 '@B/@B. 家族蛋白表达比 较$ 图 &!表 # % $ 与空白组比较! *'OG+# 1QI1R 组 '@B/@B. # > 升高$V X "= %& *'OG+ "; 1QI1R 组 VU[V' '@B/@B. # > ' '@B/@B. # % 升 高 $ V X "#! V X "= %&*'OG+ "< 1QI1R 组 VU[V''@B/@B. # & ' '@B/@B. # > ' '@5/@B. # % ' 'C05 # ' 表 达 升 高 $V X "#!V X "= %( $$注#U 为空白组&T 为 *'OG+ 1QI1R 组&' 为 *'OG+ "; 1QI1R 组&G 为 *'OG+ "< 1QI1R 组&箭头所示为凋亡 小体 图!%各组 K@BL1A# # 细胞株凋亡形态学结果$$ O5FS.B0&&!=> 荧光! '#""%

4 中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! "#$% &# 图 各组 (* ) 细胞 6.$ 家族蛋白表达 图 各组 (* ) 细胞 (* (* 家族蛋白表达 各组 (* ) 细胞 6.$ 家族蛋白表达比较 表 图 与空白组比较 / 314 组 6).$ 降低 8 : / 314 组 6( 升高 8 : 6.$ 46).$ 降低 8 : 8 : / 314 组 6(;6( 升高 8 :6.$6.$ 46).$ 降低 8 :8 : 各组 (* ) 细胞凋亡抑制蛋白表达比较 图 表 与空白组比较 / 314 组 78 78! ) ) 降低 8 : / 314 组 ! ) ) 降低 8 : (. 升高 8 : 图 各组 (* ) 细胞凋亡抑制蛋白表达 各组 (* ) 细胞 78 * 信号转导通路蛋白表达比较 表 图 与空白组比较 / 314 组 & 升高 8 : / 314 组 (* 8 & 升高 & 降低 8 :8 : 讨 论急性白血病的发生与细胞的增殖失控 凋亡受阻等原因密切相关 故抑制细胞增殖是抗白血病药物发 表 各组 (* ) 细胞 (* (* 家族蛋白表达比较 * 组别 87 8 (* (* (* (* (* (* +# (.) 空白 / 314 / 314 / 314 注 与空白组比较 8 : 8 : 下表同 表 各组 (* ) 细胞 6.$ 家族蛋白表达比较 * 组别 6(2 6(; 6( 6.$ 6.$ 4 6)2 6).$ (.) 空白 / 314 / 314 / 314

5 中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! "#$% &# 表 各组 (* ) 细胞凋亡抑制蛋白表达比较 * 组别 ! ) ) (. (.) 空白 / 314 / 314 / 314 表 各组 (* ) 细胞 78 * 信号通路蛋白表达比较 * 组别 (* 8 & & (.) 空白 / 314 / 314 / 314 图 各组 (* ) 细胞 78 * 信号转导通路蛋白表达挥效应的关键 本研究显示 / 作用于 (* ) 细胞后 细胞株的生存率较空白组降低 8 : 314 / 作用 (* ) 细胞 和 5 以上 提示 / 可抑制白血病 (* ) 细胞株增殖 并表现为剂量 时间效应 诱导白血病细胞凋亡是治疗白血病的一条可行途径 / 作用于 (* ) 细胞 5 后 #.5 * 染色检测提示在细胞形态学所呈现出的典型凋亡特征性改变 即核染色质凝集成团块状或凋亡小体 提示 / 可诱导 (* ) 细胞发生凋亡 且细胞的凋亡率随着 / 浓度的增加而升高 因此 / 抑制 (* ) 细胞增殖的机制之一是诱导细胞凋亡 细胞凋亡过程中 (* (* 蛋白酶的级联激活是关键 而 (* (* 是执行者 它的激活标志着凋亡进入不可逆阶段 6.$ 家族蛋白和 78* 家族蛋白是主要控制因素 本研究发现经 / 处理后 细胞中 (* (* 明显激活 并呈浓度依懒性 而上一 级联中的 (* (* (* (* 的激活 提示了 / 诱导 (* ) 细胞凋亡过程中 细胞凋亡的外源途径和内源途径均参与其中 内源性细胞凋亡途径主要由线粒体介导 可以通过 6.$ 凋亡蛋白家族调控 本研究发现 / 对 (* ) 细胞作用后 6.$ 家族中抗凋亡蛋白 6.$ 6.$ 4.$ 下调明显 而促凋亡蛋白 6(; 和 6( 显著上调 尤其是.$ 在造血干细胞生存中起着关键作用 有研究已经发现当.$ 过度表达时 肿瘤细胞对临床上广泛应用的抗肿瘤药物易产生耐药作用 因此 / 在促进.$ 下调诱导细胞凋亡的同时 可能还能克服肿瘤细胞耐药作用的发生 另外笔者还发现促凋亡蛋白 6) 水平下调 相关文献报道其能与所有的抗凋亡 6.$ 家族蛋白结合 也可直接与 6( 或 6(; 结合后诱导其聚合促进凋亡 而 6) 在 / 诱导白血病细胞株 (* ) 凋亡过程中所发挥的具体作用还有待深入研究 凋亡抑制蛋白 78* 家族成员在血液系统恶性肿瘤的发生发展中起到了关键作用 78* 主要是通过抑制 (* (* 家族中的 (* (* 的活性来达到抑制细胞凋亡的作用 其中 78 被认为与白血病细胞产生耐药有关 并在白血病细胞中常常过度表达 本研究观测到 / 作用于 (* ) 细胞 5 后 细胞内 和! ) ) 蛋白的表达减少 而促凋亡蛋白 (. 表达增加 且呈浓度依耐性 表明 / 可能通过增加 (. 的表达 降低凋亡抑制蛋白 和! ) ) 的水平 从而诱导白血病细胞凋亡 对 78 蛋白的影响 还提示 / 可能存在降低肿瘤细胞的凋亡阈 增加药物敏感性并克服耐药的作用 78 成员中有很多与血液系统肿瘤密切相关 如

6 中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期! "#$% &# & 入核后激活相应转录因子后能诱导死亡配体的表达 启动死亡受体途径的细胞凋亡 而 8 则可启动. +. 等原癌基因转录 诱导凋亡执行蛋白的表达 ( # 等在鼠白血病 4 细胞中发现 氨基乙酰喹啉通过激活 78 信号通路可诱导细胞凋亡 本次研究发现 / 处理过的 (* ) 细胞中 不仅 的表达上调 使活化型的 & 和 8 增多 而且 的上游 (* 蛋白表达也随药物浓度增加而逐渐上调 据此初步认识到 / 诱导白血病细胞凋亡的机制中 78 信号通路有明显改变 提示 / 可能通过协同活化 78 信号通路进而抑制 (* ) 细胞增殖以及促进其凋亡 综上所述 本研究证实了 / 可以明显抑制 (* ) 细胞增殖并诱导凋亡 其机制与下调抗凋亡蛋白 6.$6.$ 4 及.$ 以及凋亡抑制蛋白 和! ) ) 和激活 78 * 信通路有关 但本研究仅以对 / 在体外的作用进行了研究 其在生物体内对细胞凋亡影响尚需进一步研究 参考文献 ()# ;)!(( ) ($% 7 +!!#$# +!))2) 2!) () (!3 * 5 (!)(!+ 7 4 *. $$* ) ) # %.)!( *$ 2!( % 8( *!#*$?(! * ($% 2 ) ).()# # *($$ #$. $ * 5( * #! 5 ( $ ; )( *. $$ (.) )+ ) # % &( 5 #2* % 赵春贵 张立伟 王晖 % 肉桂酸及其衍生物抗氧化活性研究 % 食品科学 % 赵健 欧仕益 % 比光谱 导数分光光度法同时测定对香豆酸和阿魏酸 % 食品科学 %? )( 78 ( 2! ) "(3 ()$? ($%. # #$+ 5 #$).!(.*!#! 2,) ( 2 0.# (!). (.)2 # 2) 5+$5+2!(=) ) 2. 2.#$#.(!.) #3 *)* )!(* %! &! % ( ).; 6 0 ) 3 0! 2**# % /)! )($.* #! $). (.)2 ( 2.# (!). (.)2 # 5(* 2)*!) )# ( 2 $ 35 # 5(* ) 5 5 (.#$# ).. $$ $) (.# % 73!).?##2 5 % );2(! ;5! 7 5#*5 ($% # 2!( 3# 3$+.#*)2!).5.# # * *) $( /&7 2((3 ) $$.+.$ (!! * ( 2 0 2) ( 2.(* (* 2 2 ( # #*)* 5!# 35 ) 5) ))# #. $$!#$)!()# ) $ 3.(.!) )!# ( 2 ) ) # % )!# # ).#$ 85(!(.#$ % (5( ) /( )* 6(! ($% 7 # #*)* ) ;) (* ) 5) )#! 67 ) 5 ( $ ; )(. $$* ) #$ * 2#,! 3 $()# #.$ 5!# 35 ) 5) ))# #!( *$()# % 6)#$ 5 % #$2# (?#$$)* 7"!),(.;) % ( + $(+!* ) 6.$ ()$+ ( ()!* %! 2* 6)#.5.) % )*.5! / # ** 0) ( ($% 6.$! 3 $( 2. $$ 2 (5 *)3 ($) 3 ) 5! )# # ( #) )+ % $$ / (5 /)* %!=+ #,*;(=+2#!.=+; 0 $( 6 # (; ($%! **)# ( 2!#3 #*). *)3 ) ).(. # 5 ) 5) )#! # ( # #*)*!# ) 78 ()$+ ( 2 )* ( (3# )** ).5!# ). $+ 5#.+). $ ;( )( %! (.! % /!#$$ )2! (3! ).5( $( "(*#$2 #.5 ($ + # )(! 3 $( *!#$)!()# # (. + $#)2 $ ; )( ( 2 * *)) )+ (3() *.5 #5!( + 4 ; * % )$ ( 4 2 # =( 8 & *($ 2 #!( * ($% 78 ( 2 83$+.#!# ).#! **)# )*! $( 2 # )() )! *)*(. ).5!# ). + $#)2 $ ; ) (. $$* % 4 ; * % ( # ).;7 4 (*)# ($ 7) #(. +$A ) #$) ) 2. 2 ( # #*)* #!) 4 $ ; )(. $$* ) #$ * 0 )#.5# 2!) ($ 2)( 2 2 (5 *)3 ($) 3 ( 2 (.) ()# # 78 % $$ 6)#.5?. 收稿 修回 责任编辑 赵芳芳

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