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1 第 17 卷第 5 期北华大学学报 ( 自然科学版 ) Vol. 17 No 年 10 月 JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science) Oct 文章编号 : (2016) DOI: / j. issn 白藜芦醇对卵巢癌细胞株 SKOV-3 细胞周期的影响及诱导其凋亡的机制研究 唐锐先 1, 张颖 2 1, 张巍 (1. 吉林医药学院直属医院, 吉林吉林 ;2. 永吉县医院, 吉林永吉 ) 摘要 : 目的探讨白藜芦醇对人卵巢癌 SKOV-3 细胞的细胞周期及诱导其凋亡机制的影响 ; 探讨白藜芦醇诱导人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡的机制. 方法设置不同浓度的白藜芦醇实验组 (20,40,80) μmol / L 及细胞对照组, PI( 碘化丙啶 ) 单染后应用流式检测分析其凋亡细胞在细胞周期中不同阶段所占百分率 ; 应用 Annexin-v / PI 双标记法染色后流式检测并通过散点图分析白藜芦醇诱导对人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡情况 ; 免疫组织化学法检测白藜芦醇对 SKOV-3 细胞中凋亡相关蛋白 Caspase-3 的表达影响. 结果 PI( 碘化丙啶 ) 单染后流式检测结果提示 : 白藜芦醇可以将卵巢癌 SKOV-3 细胞周期阻滞于 S 期 ; 三色散点图提示白藜芦醇可诱导 SKOV-3 细胞早期凋亡的增加, 此作用与白藜芦醇浓度呈正相关性 ; 白藜芦醇可使人卵巢癌 SKOV-3 细胞中的 Caspase-3 表达增加. 结论白藜芦醇可阻断 SKOV-3 细胞周期并诱导其早期凋亡 ; 白藜芦醇诱导人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡的发生可能与 Caspase 通路的激活有关. 关键词 : 白藜芦醇 ;SKOV-3 细胞 ; 凋亡 ; 流式检测 ; 免疫组织化学中图分类号 :R93,R737 文献标志码 :A 引用格式 唐锐先, 张颖, 张巍. 白藜芦醇对卵巢癌细胞株 SKOV-3 细胞周期的影响及诱导其凋亡的机制研究 [ J]. 北华大学学报 ( 自然科学版 ),2016,17(5): On Effect of Resveratrol on the Cell Cycle of Ovarian Cancer Cell Strain SKOV-3 and the Apoptosis Mechanism Induced by Resveratrol Tang Ruixian 1,Zhang Ying 2,Zhang Wei 1 (1. Directly Subordinate Hospital of Jilin Medical Collage,Jilin ,China;2. Yongji County Hospital of Jilin City,Jilin ,China) Abstract: Objective To investigate the effects of resveratrol on the cell cycle of human ovarian cancer cell SKOV-3,and to explore the apoptosis mechanism of human ovarian cancer cell SKOV-3 induced by resveratrol. Method The experimental group treated with different concentrations of resveratrol ( 20,40 and 80 μmol / L) and the cell control group were set. The apoptosis rates of SKOV-3 at different stages in the cell cycles were analyzed by flow cytometry after PI ( propidium iodide) single staining. The apoptosis of human ovarian cancer cell SKOV-3 induced by resveratrol was tested by flow cytometry ( Annexin-v / PI double labeling staining) and analyzed by scatter plot. The effect of resveratrol on the expression of apoptosis-related protein Caspase-3 in SKOV-3 cells was detected by immunohistochemical method. Results After PI ( propidium iodide) single staining,the flow cytometry results suggested that resveratrol could arrest the cell cycle of ovarian cancer SKOV-3 收稿日期 : 基金项目 : 吉林省教育厅科学技术研究项目 ( ). 作者简介 : 唐锐先 (1971-), 男, 副主任医师, 主要从事临床新药研发及应用研究, @ qq. com; 通信作者 : 张巍 (1970-), 女, 博士, 副教授, 主要从事抗肿瘤中药筛选研究, jlmmczw@ 163. com.

2 612 北华大学学报 ( 自然科学版 ) 第 17 卷 in S phase. Three scatter plot indicated that resveratrol could induce SKOV-3 early apoptosis,and this effect was positively correlated to the concentration of resveratrol. Resveratrol was able to increase the expression of Caspase- 3 in human ovarian cancer SKOV-3 cells. Conclusion Resveratrol can block the cell cycle and induce the early apoptosis of SKOV-3,which may relate to the activation of caspase pathway. Key words: Resveratrol;SKOV-3 cells;apoptosis;flow cytometry( FCM);immunohistochemistry 卵巢癌是妇产科临床中最常见的恶性肿瘤之一, 具有较高的致死率, 其发病率也于近年来呈逐年上升趋势 [1-2]. 本研究通过广泛存在于药用植物内的抗毒素 白藜芦醇对人类卵巢癌 SKOV-3 细胞核形态学 细胞周期 早期凋亡的影响, 探讨白藜芦醇对人卵巢癌治疗作用的实验依据. 1 材料与方法 1. 1 仪器和设备 HF90 / HF240 CO2 细胞培养箱 ( Heal Force 公司 ); 超净工作台 ( 吉林医药学院实验中心 ); 流式细胞仪 ( 美国 becton-dickinson 公司 ); 投射式荧光显微镜 ( 上海荼明光学仪器 );96 孔培养板 ( 美国 Corning 公司 ); 台式冷冻离心机 ( 德国 Heraus 公司 ); 低温冰箱 ( 日本 ) 主要试剂 Annexin V-FITC / PI 双染细胞凋亡检测试剂盒 ( 碧云天生物技术 ); 纯度 % 白藜芦醇粉末 ( 天津迈迪瑞康生物医药科技 );Hoechst33258 试剂盒 ( 南京凯基生物工程研究所 ); 细胞培养基 RPMI-1640( 碧云天生物技术 ); 胎牛血清 ( 吉林血研所 ); DMSO ( 二甲基亚砜, 淄博荣悦进出口公司 );0. 25% 胰蛋白酶消化液 ( 吉林医药学院实验中心 );DAB 试剂盒 ( 碧云天生物技术 );Caspase-3 抗体 ( 美国 SANTA 公司 ) 试剂的配置 1) 白藜芦醇原液的配制 : 电光天平精确称取纯度 % 的白藜芦醇粉末 228 mg 溶于 DMSO 1 ml 中, 混合均匀后置于 -80 低温冰箱中保存. 临用时再配制成所需工作浓度 ( 原液浓度为 1 mol / L). 2) FITC 染液配制 :Annexin V-FITC / PI 细胞凋亡检测试剂盒中取 (1 ) binding buffer 液 200 μl, FITC 5 μl / 管, 将两者均匀混合后滴加 EP 管中,4 避光保存备用. 3) PI ( 碘化丙啶 ) 染液配制 : PI ( 碘化丙啶 ) 10 mg,triton X ml,pbs 缓冲液 ml, 枸橼酸钠 200 mg, 蒸馏水 200 ml, 调 ph 7. 4,4 避光保存. 4)DAB 试剂配制 ( 使用前 30 min): 在 1. 5 ml EP 管中先加入 ml 二次蒸馏水, 严格按 DAB 试剂盒说明分别加入盒内 A,B,C 液各 50 μl, 混匀后即为 1 ml DAB 显色液 实验方法 细胞的复苏 培养人类卵巢癌细胞系 ( SKOV-3) ( 中科院上海研究所细胞库 ) 由吉林医药学院科学实验室冻存. 细胞培养于 RPMI-1640 培养液中, 培养条件为在 5% CO 2 湿度 95%. 每 2 d 胰酶消化 重悬 更换 1 次培养液, 分瓶培养, 按 1 3 传代 实验中的加药方案取浓度为 100 mmol / L 白藜芦醇 4 μl 加入到培养瓶中 ( 瓶中原有 5 ml 混合培养液 ), 使工作浓度达 80 μmol / L; 取浓度为 25 mmol / L 白藜芦醇 8 μl 加入到培养瓶中 ( 瓶中原有 5 ml 混合培养液 ), 使工作浓度达 40 μmol / L; 取浓度为 25 mmol / L 白藜芦醇 4 μl 加入到培养瓶中 ( 瓶中原有 5 ml 混合培养液 ), 使工作浓度达 20 μmol / L 实验分组细胞对照组 : 设置 RPMI-1640 细胞培养液培养的 SKOV-3 细胞 二甲基亚砜 (DMSO)100 μl, 其中不加入白藜芦醇制剂, 作为不同浓度白藜芦醇实验组的共同对照. 白藜芦醇实验组 : 将相同的细胞分瓶后, 滴加不同浓度的白藜芦醇溶液 (20,40,80) μmol / L( 相同体积 ) 继续培养 24 h 后实验 PI 单染流式细胞术 ( FCM) 检测细胞周期的变化取用不同浓度白藜芦醇药物 (20,40,80)μmol / L 处理的细胞 3 瓶及对照组细胞 1 瓶,PBS 缓冲液冲洗后分别加入胰蛋白酶消化 5 min, 离心后加入冰预冷的 70% 的乙醇固定 (4 ) 过夜 ( 破膜 ). 每瓶加入 500 μl PI( 碘化丙啶 ) 染液后, 于低温 (4 ) 孵育箱中孵育 30 min. 上机检测, 碘化丙啶 ( PI) 用氩离子以激光波长 488 nm 激发荧光, 发射波长为 632 nm. 一般计数 2. 5 万个细胞, 结果用细胞周期拟和软件分析凋亡细胞所占百分率. 根据凋亡率 = 凋亡细胞数 / ( 凋亡细胞数 + 正常细胞数 ) 100% 计算细胞凋亡率.

3 第5 期 唐锐先,等:白藜芦醇对卵巢癌细胞株 SKOV-3 细胞周期的影响及诱导其凋亡的机制研究 613 Annexin-v / PI 双标记法流式细胞术( FCM) 然冷却至室温. 羊血清工作液封闭,弃去血清,不冲 取 用 不 同 浓 度 白 藜 芦 醇 药 物 ( 20, 40, 克隆抗体于 4 过夜. 滴加生物素标记羊抗兔 IgG 检测 80) μmol / L 处理的细胞 3 瓶及对照组细胞 1 瓶, PBS 缓冲液冲洗后分别加入胰蛋白酶消化 5 min, 吹打细胞使之悬浮,弃上清. 1 ml PBS 缓冲液悬起 细胞,转入 1. 5 m LEP 管中离心,弃上清液. 重悬后 洗标本,加入稀释至 的兔抗 Caspase-3 多 工作液,37 孵育 20 min 后滴加链霉素-生物素-辣 根过氧化 物 酶 工 作 液. DAB 显 色, 冲 洗, 脱 水 透 明 中性树脂封片. 染色结果以细胞质或核内有棕 黄色高出背景的细胞为阳性细胞. 平均分配于 1 ml EP 管中, 按 200 μl / 管及 FITC 1. 5 色 50 min. 每管再加入 300 μl binding buffer 后离 以均数±标准差( x ± s) 表示,F 检验方差齐性后,t 细胞. 每管加入 300 μl binding buffer,将细胞悬起, 意义,P<0. 01 为差异具有显著性统计学意义. 5 μl / 管将两者均匀混合后滴加 EP 管中,避光染 心 5 min,弃上清液,500 μl binding buffer 冲洗两次 统计学处理 实验数据采用 SPSS 统计软件处理,结果 检验进行组间比较,取 P<0. 05 为差异具有统计学 并将其移入流式管中. 各管加入 Annexin V-FITC / 2 结 检测. 流式检测和分析:用流式细胞仪于激发波长 2. 1 PI 单染流式细胞术( FCM) 检测细胞周期的 PI 细胞凋亡检测试剂盒中 PI 染液 5 μl,立即上机 为 488 nm 处检测彩色荧光,散点图检测细胞凋亡 早 晚时期及坏死细胞所占比率 免疫细胞化学法检测 Caspase-3 的表达 取 40 μmol / L 白藜芦醇处理组细胞及对照组 细胞各 1 瓶,培养液 PBS 清洗 2 次. 4% 多聚甲醛 4 固定后清洗标本,3% H2 O2 37 孵育 15 min. 于 mol 柠檬酸缓冲液中加热 15 min(95 ),自 Tab. 1 变化实验结果 表 1 表明:以 20,40,80 μmol / L 浓度的白藜芦 醇处理卵巢癌 SKOV-3 细胞 24 h 后,随药物剂量的 增加,各组细胞的凋亡率均显著增高;而且 G1 期细 胞所占百分率降低,S 期细胞所占百分率上升,提 示白藜芦醇可以将卵巢癌 SKOV-3 细胞周期阻滞 于 S 期. 表 1 不同浓度的白藜芦醇对 SKOV-3 细胞的平均凋亡率及细胞周期的影响 Effects of different concentrations of resveratrol on the average apoptosis rate and cell cycle of SKOV-3 cell 分组 细胞对照组 20 μmol / L 白藜芦醇组 40 μmol / L 白藜芦醇组 80 μmol / L 白藜芦醇组 细胞周期分布 G S Annexin-v / PI 双标记法流式细胞术( FCM) 检测结果 不同浓度白藜芦醇处理组流式检测三色散点 图说明:左下象限显示活细胞,为 Annexin V / PI ; - Fig. 1 - G 注:与细胞对照组比较,:P<0. 01;与各组间比较,:P< 果 η ( 凋亡率) / % 2. 15± ± ± ±3. 97 右下象限为早期凋亡细胞,为 Annexin V + / PI - ;右 上象限是凋亡晚期细胞,为 Annexin V + / PI + ;左上 象限显示死亡细胞. 见图 1. 图 1 不同浓度白藜芦醇处理组流式检测三色散点图 Three color scatter plots of the cells treated by resveratrol with different concentrations determined by flow cytometry

4 614 第 17 卷 北华大学学报( 自然科学版) Tab. 2 表 2 白藜芦醇对 SKOV-3 细胞凋亡的影响 Effect of resveratrol on the apoptosis of SKOV-3 cells 分组 细胞对照组 早期凋亡细胞 晚期凋亡细胞 2. 08± μmol / L 白藜芦醇组 ± μmol / L 白藜芦醇组 ± μmol / L 白藜芦醇组 1. 36± ± ± ± ±0. 12 注:与细胞对照组比较,:P<0. 01;与各组间比较, :P<0. 05 不同工作浓度白藜芦醇作用于人卵巢癌 ( n = 3, x ±s,η / % ) 0. 05),且呈浓度依赖性. SKOV-3 细胞 24 h 后,经 Annexin V-FITC / PI 双染 2. 3 藜芦醇处理后人卵巢癌 SKOV-3 细胞早期凋亡率 呈长梭形. 40 μmol / L 白藜芦醇实验组细胞核着色 增,诱导人 卵 巢 癌 SKOV-3 细 胞 作 用 越 明 显 ( P < 图 2. 后流式细胞检测仪结果( 见图 1,表 2) 提示:经白 明显增加( P<0. 01),并随白藜芦醇工作浓度的递 免疫组化检测结果 结果显示:未加白藜芦醇细胞贴壁,排列紧密, 加深( 阳性结果胞核 胞质呈棕黄色细颗粒状). 见 图 2 免疫组织化学检测白藜芦醇对 SKOV-3 细胞 Caspase-3 蛋白表达的影响( DAB 400) Fig. 2 Influence of resveratrol on the expression of Caspase-3 protein in SKOV-3 cells detected with immunohistochemical method( DAB 400) 3 讨 有研究 论 [3-5] 表明:卵巢癌的形成是由于机体内 正常卵巢细胞在致癌因素的刺激下,于 DNA 水平 上发生了碱基对的错配,使卵巢细胞畸形生长及生 长失控,导致癌性细胞的急剧扩增,并获得侵袭和 转移能力. 本研究从白藜芦醇对卵巢癌细胞周期的 影响 诱导其早期凋亡的作用及机制来探究将白藜 芦醇应用于卵巢癌临床治疗的实验室依据. 在本研究的加药方案中,保证了溶剂及培养液 标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞 膜的通透性,才能使 PI 进入细胞内,与细胞内的核 酸结合 [7]. 本研究通过流式检测技术检测经不同 浓度白藜芦醇处理后的卵巢癌 SKOV-3 细胞周期 中 G1 期细胞,其百分比随药物浓度增高而逐渐降 低,S 期细胞百分比逐渐增加,表明白藜芦醇抑制 肿瘤细胞的增殖能力体现在可将卵巢癌 SKOV-3 细胞 周 期 阻 滞 于 S 期, 这 与 同 类 研 究 的 成 果 相似 [8-9]. 此外本实验还应用 Annexin V / PI 双染色,利 中 DMSO( 二甲基亚砜) 的浓度小于千分之一,从而 用流式检查技术来进一步研究白藜芦醇诱导卵巢 响. 此 外, 在 实 验 操 作 中 避 免 取 样 量 的 体 积 小 于 用 Annexin V 与凋亡早期细胞的胞膜结合稳定的 消除 并 忽 略 DMSO 对 培 养 细 胞 的 毒 性 作 用 及 影 0. 5 μl,从而避免了取样量的体积过小导致的误 差. 因此,本研究不再单独设立 DMSO 对细胞影响 的空白对照组,从而达到简化实验步骤,同时保证 研究结果的说服力及准确性 [6]. 碘化丙锭 ( PI) 可以嵌入凋亡晚期细胞及死亡 细胞的双链 DNA,并发出红色荧光,但 PI 不能通 过细胞膜完整的细胞,如活细胞和早期凋亡细胞在 癌 SKOV-3 细胞凋亡作用的相关情况,其原理是应 特性,利用 Annexin V 与 PI 匹配能更加准确地观 测白藜 芦 醇 对 人 卵 巢 癌 SKOV-3 细 胞 凋 亡 的 影 响 [10-11]. 本研究选取 20,40,80 μmol / L 3 个不同浓 度的白藜芦醇,利用流式检测技术进一步进行人卵 巢癌 SKOV-3 细胞凋亡实验. 散点图结果显示:随 白藜芦醇工作浓度的递增,其诱导人卵巢癌的早期 凋亡率及总凋亡率逐渐上升,确切说明白藜芦醇诱

5 第 5 期 唐锐先, 等 : 白藜芦醇对卵巢癌细胞株 SKOV-3 细胞周期的影响及诱导其凋亡的机制研究 615 导人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡呈工作浓度依赖性. induces stemness and promotes ovarian cancer cell 综上所述, 白藜芦醇可明显改变人卵巢癌细胞 SKOV-3 的细胞核形态, 诱导人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡, 其作用主要是诱导其早期凋亡. invasion and metastasis [ J]. Oncol Rep,2012,27 ( 5 ): [6] 王振斌, 马海乐, 许文荣, 等. 有机溶剂对肿瘤细胞的细胞 毒作用 [ J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2005,13 (3): 免疫组织化学法是细胞生物学研究中检测各 种抗原物质 ( 多肽 蛋白质 激素 酶 病原体 受体 [7] 刘江惠, 郭建文, 王静, 等. 流式细胞术 PI 染色法检测等 ) 的新技术之一, 它将显微镜的放大 直观作用胃蛋白酶消化时间对细胞凋亡的影响 [ J]. 第三军医 与免疫反应的特异性及组织化学的可见性巧妙结合 [12], 消弭了免疫学可以定量 定性而不能定位的不足之处, 并将形态学改变与代谢及功能结合起来 [13]. 根据我们已发布的相关实验成果的结论即白藜芦醇诱导人卵巢癌 SKOV-3 凋亡的半数抑制浓度 (IC 50 = μmol / L) [14-15], 本研究选取与其接近的中间工作浓度 40 μmol / L 白藜芦醇来做免 大学学报,2007,11(22): [8] Piotrowska H, Myszkowski K, Zikowska A, et al. Resveratrol analogue 3, 4, 4, 5-tetramethoxystilbene inhibits growth,arrests cell cycle and induces apoptosis in ovarian SKOV-3 and A-2780 cancer cells[ J]. Toxicol Appl Pharmacol,2012,263(1): [9] 蓝鸿雁, 张纪妍, 陈杰, 等. 白藜芦醇诱导卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡的作用机制 [J]. 山东医药,2014,54(1): 疫化学实验, 以便能准确及客观地反映白藜芦醇诱 [10] 张伟, 梁智辉. Annexin V-FITC/ PI 双标记与 Hoechst 导人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡的机制. 实验结果发 33342/ PI 双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较 [J]. 现 : 白藜芦醇可使人卵巢癌 SKOV-3 细胞中的 Caspase-3 表达增加. Caspase-3 作为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白依赖的细胞凋亡通路中的起始蛋白, 其表达的增加说明白藜芦醇诱导人卵巢癌 SKOV-3 细胞凋亡的发生可能与 Caspase 通路的激活而引起的不可逆的层叠级联反应相关联, 这也与 细胞与分子免疫学杂志,2014,30(11): [11] S M Bernier, Y Yamada. Modulation of Annexin-V during chondrocytic different iation in vitro[ J]. Annals of New York Academy Sciences,2008,28(6): [12] Yang G, Zhang H, Liu Y, et al. Epigenetic and immunohistochemical characterization of the Clusterin gene in 国外的研究报告相契合 [16]. 但是其诱导卵巢癌 ovarian tumors [ J ]. Archives of Gynecology and Obstetrics,2013,287(5): SKOV-3 细胞凋亡的过程中其他相关蛋白表达及 [13] Sylvia M T,Kumar S,Dasari P. The expression of immunohistochemical markers estrogen receptor,progesterone 变化规律还有待进一步研究与探讨. 参考文献 : receptor,her-2-neu,p53 and Ki-67 in epithelial ovarian tumors and its correlation with clinic opathologic [1] Bei L, John N, Carolyn R, et al. Ovarian cancer immunotherapy: opportunities, progress and challenge [ J ]. Hematology & Oncology,2010,3:7-11. [2] 张雯碧. 卵巢癌化疗耐药相关基因与预后的研究进展 [J]. 国外医学 : 妇产科学分册,2007,34(3): [3] Zhang Y,Zhao F J,Chen L L,et al. MiR-373 targeting of the Rab22a oncogene suppresses tumor invasion and metastasis in ovarian cancer[ J]. Oncotarget,2014,11(23): [4] Huang X,Zhu H L. Reservatrol and its analogues:promising antitumor agents[ J]. Anticancer Agents Med Chem, 2011,11(5): [5] Lu Z Y, Dong R, Li D, et al. SNAI1 overexpression variables[ J]. Indian J Pathol Microbiol,2012,55 (1): [14] 唐锐先, 张巍, 赵行宇. 白藜芦醇诱导卵巢癌细胞 SKOV-3 凋亡作用的研究 [J]. 中成药,2015,37(10): [15] 唐锐先, 张颖, 李伟, 等. 白藜芦醇对人卵巢癌 SKOV- 3 细胞形态及增殖作用 [ J]. 吉林医药学院学报, 2015,36(5): [16] Rahman M A,Kim N H,Kim S H. anti-proliferative and cytotoxic effect of resveratrol in mitochondria-mediated apoptosis in rat b103 neuroblastoma cells[ J]. Korean J Physiology Pharmaco,2012,16(5): 责任编辑: 陈丽华

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