我委拟修订北京第一生物化学药业有限公司生产的转移因子口朊溶液的国家标准[标准编号WS1-（X-451）-2003Z，具体修订内容见附件]，并拟将本品通用吊称恢夊为原试行标准采用的“脾氨肽口朊溶液”

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蛙扬车
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1 脾氨肽口服溶液 pi'antai koufurongye Spleen Aminopeptide Oral Solution 本品为健康牛脾提取制得的脾氨肽水溶液含多肽以牛血清白蛋白计, 应为标示量的 90.0%~110.0% 含核苷酸以 D- 核糖 (C 5 H 10 O 5 ) 计, 不得低于标示量的 80% 性状本品为无色至微黄色澄清液体, 有特臭鉴别 (1) 取本品 1ml, 加茚三酮试液数滴, 加热, 溶液应显蓝紫色 (2) 取本品, 加水制成每 1ml 中约含多肽 40 g 的溶液, 照紫外 - 可见分光光度法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 IV A) 测定, 在 264nm 的波长处有最大吸收检查 ph 值应为 6.0~7.5( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅵ H) 蛋白质取本品 2ml, 加 20% 磺基水杨酸溶液 2ml, 混匀, 不得发生沉淀或浑浊游离氨基酸精密量取本品 5.0ml, 置 10ml 量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 用 0.45 m 滤膜滤过, 取续滤液作为供试品溶液 ; 分别精密称取 17 种氨基酸 ( 门冬氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸甘氨酸苏氨酸精氨酸丙氨酸酪氨酸胱氨酸缬氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸和脯氨酸 ) 对照品适量, 置同一量瓶中, 用 0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释制成每 1ml 中约含每种对照品 100μg 的溶液, 摇匀, 作为混合对照品溶液用适宜的仪器和方法或照下列高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅴ D) 测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 (4.6mm 150mm; 3 m), 以磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液 ( 将 10mmol/L 磷酸氢二钠溶液与 10mmol/L 硼酸钠溶液混合, 制成 ph 8.2 的溶液 ) 为流动相 A, 以乙腈 - 甲醇 - 水 (45:45:10) 为流动相 B, 按下表进行梯度洗脱, 流速约为每分钟 1.5ml, 柱温 40, 检测器为二极管阵列检测器,0~16 分钟, 检测波长 338nm,16~20 分钟为 262nm 时间 ( 分钟 ) 流动相 A(%) 流动相 B(%) 测定法分别精密量取混合对照品溶液与供试品溶液, 采用在线自动衍生 ( 衍生程序见下表 ) 后进样, 记录色谱图, 按外标法以峰面积分别计算各氨基酸含量本品每 1ml 中含游离氨基酸总量不得少于 1.3mg No. 衍生化操作步骤 1 吸取 0.4mol/L 硼酸盐缓冲液 ( 取 4.96g 硼酸和 2.28g 氢氧化钠, 加水溶解

2 并稀释至 200ml, 用 2mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph 值至 10.2 )2.5μl; 2 吸取测定溶液 1.0μl; 3 在空气中以最大速度混合 5 次, 混合体积 3.5μl; 4 等待 0.2 分钟 ; 5 吸取邻苯二甲醛衍生剂 ( 取邻苯二甲醛 100mg, 加上述硼酸盐缓冲液溶解, 加入 3- 巯基丙酸 100μl, 用硼酸缓冲液稀释至 10ml, 摇匀 )0.5μl; 6 在空气中以最大速度混合 10 次, 混合体积 4.0μl; 7 吸取 9- 芴甲基氯甲酸酯衍生剂 ( 取 9- 芴甲基氯甲酸酯 25mg, 用乙腈溶解并稀释至 10ml, 摇匀 ) 0.4μl; 8 在空气中以最大速度混合 10 次, 混合体积 4.4μl; 9 吸取进样溶剂 (100ml 流动相 A 加入 0.25ml 磷酸, 混匀 ) 32μl; 10 在空气中以最大速度混合 8 次, 混合体积 20μl; 11 进样活力测定取本品适量, 照 T 细胞活性测定法 - 脱 E 受体法 ( 见附件 1) 测定, 供试品管的 E 玫瑰花结百分率与对照管的 E 玫瑰花结百分率之差不得低于 12.0% 微生物限度取本品, 依法检查 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅺ J), 细菌计数霉菌和酵母菌计数均采用常规平皿法, 大肠埃希菌检查沙门菌检查均采用常规法本品每 1ml 中细菌数不得过 100cfu, 霉菌和酵母菌总数不得过 100cfu, 大肠埃希菌不得检出 ; 本品每 10ml 中沙门菌不得检出其他应符合口服溶液剂 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅰ O) 项下有关的各项规定含量测定多肽精密量取本品适量, 用水定量稀释制成每 1ml 中含多肽 0.1mg 的溶液, 依法测定 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅶ M 第二法 ) 根据回归方程计算本品中以牛血清白蛋白计的多肽含量核苷酸标准曲线的制备精密称取 D- 核糖对照品适量, 加 5% 的三氯醋酸溶液溶解并制成每 1ml 中含 20μg 的溶液, 摇匀, 作为对照品溶液精密量取对照品溶液 0.0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 和 1.0ml 分别置具塞试管中, 各加入 5% 的三氯醋酸溶液适量至 2.0ml, 分别精密加入 1% 的 3,5- 二羟基甲苯溶液 [ 取 3,5- 二羟基甲苯 1g, 溶于 0.1% 三氯化铁的盐酸溶液 ( 取三氯化铁 0.5g, 加盐酸溶解使成 500ml)100ml 中, 临用新配 ]2.0ml, 摇匀, 置沸水浴中准确加热 30 分钟, 迅速冷却至室温, 以 0 号管为空白, 照紫外 - 可见分光光度法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅳ A), 在 650nm 的波长处测定吸光度, 以对照品溶液浓度与相应的吸光度进行线性回归, 其相关系数应大于测定法精密量取本品适量, 用 5% 三氯醋酸溶液定量稀释制成每 1ml 中含核糖 5μg 的溶液, 作为供试品溶液精密量取供试品溶液 2.0ml, 照标准曲线的制备项下, 自分别精密加入 1% 的 3,5- 二羟基甲苯溶液 2.0ml 起, 依法操作, 测定吸光度, 根据回归方程计算本品中以 D- 核糖计的核苷酸含量类别免疫调节药规格 10ml:10mg( 多肽, 以牛血清白蛋白计 ):0.1mg( 核苷酸, 以 D- 核糖计 ) 贮藏密闭, 在凉暗处保存

3 曾用名 : 转移因子口服溶液

4 附件 1 T 细胞活性测定法脱 E 受体法本法系根据脾氨肽可使脱 E 受体后的胸腺 T 细胞恢复其 E 受体功能, 从而反映其生物活性一试剂 (1)Hank's 液将 0.3% 磷酸二氢钾溶液 0.76% 磷酸氢二钠溶液 2% 氯化钾溶液及 20% 氯化钠溶液依次按 20:20:20:40 比例混合, 加葡萄糖 1g, 溶解并混匀, 用水稀释至 1000ml, 并用 4% 碳酸氢钠溶液调节 ph 值至 7.2~7.3( 临用配制 ) (2) 阿氏液取氯化钠 0.420g, 枸橼酸 0.055g, 枸橼酸钠 0.766g, 葡萄糖 2.05g, 加水溶解并稀释至 100ml, 湿热灭菌 (121,30 分钟 ) (3) 分离液为淋巴细胞分离液 (4) 羊血取绵羊静脉血 5ml, 加入 5ml 阿氏液中, 冰箱保存 (5) 固定液取 25% 戊二醛溶液 3.5% 碳酸氢钠溶液及 Hank's 液依次按 1:1:38 比例混合 (6) 姬姆萨染色液原液取姬姆萨染料 0.5g, 加甘油 33ml,55~60 加热至姬姆萨染料溶解, 冷至室温, 加入 33ml 甲醇, 室温放置 24 小时后, 用滤纸过滤, 滤液即为原液密封室温保存 (7) 染色液取姬姆萨染色液原液 2ml, 加 Hank's 液 6ml, 摇匀, 以每分钟 1500 转离心 10 分钟, 取上清液待用二操作法 (1) 脱 E 受体胸腺 T 细胞悬液的制备取新鲜猪胸腺, 去脂肪并剪碎, 加适量 Hank's 液使成细胞悬液, 经 100 目筛过滤, 以每分钟 1500 转的速率离心 3~5 分钟, 弃去上清液, 加入少量 Hank's 液打匀, 将此溶液加入已具有 1/3 滤液量的分离液的离心管中, 以每分钟 2000 转离心 20 分钟, 小心吸出中间层的胸腺细胞, 放入另一离心管中, 加适量 Hank's 液洗涤, 摇匀, 以每分钟 1500 转离心 3~5 分钟, 弃去上清液, 洗涤一次后, 在沉淀物中加入适量 Hank s 液, 混匀,45 恒温水浴保温 30 分钟 ( 每隔 5 分钟振摇一次 ) 以每分钟 1500 转离心 3~5 分钟, 弃去上清液, 再加入适量 Hank's 液, 混匀后, 置 45 恒温水浴保温 30 分钟, 取出后以每分钟 1500 转离心 3~5 分钟, 弃去上清液用 Hank's 液洗涤三次 ( 操作同前 ), 最后用 Hank's 液适当稀释并计数, 使最终浓度为每 1ml 中 ( )~( ) 个细胞 (2) 绵羊红血球悬液的制备取适量羊血, 用适量 Hank's 液洗三次 ( 同前 ) 弃去上清液, 加适量 Hank's 液稀释并计数, 使最终浓度为脱 E 受体胸腺 T 细胞悬液浓度的 8~10 倍 (3) 供试品溶液的制备取供试品, 用 Hank's 液配制成每 1ml 中含 1mg 的溶液 (4) 测定取小试管 6 支, 其中 3 支各加 Hank's 液 0.1ml 作对照管, 另 3 支各加供试品溶液 0.1ml 作测定管, 每管中各加脱 E 受体胸腺 T 细胞悬液 0.2ml,37 保温 1 小时后, 加入绵羊红血球悬液 0.2ml, 摇匀, 以每分钟 500 转离心 3 分钟, 放入 4 冰箱过夜, 次日取出, 弃去上清液, 每管中各加入固定液一滴, 轻轻摇匀, 静置 10 分钟, 加入染色液 2 滴并摇匀, 静置 15 分钟后开始计数, 显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞, 共数计数板 16 个大方格上所有淋巴细胞的个数 ( 不少于 200 个 ), 统计其中的 E 玫瑰花结形成的细胞

5 数 ( 结合 3 个以上绵羊红细胞的淋巴细胞 ), 求得结花百分率, 取平均值即为供试品管或对照管的平均值样品活力 = 供试品测定管 E 玫瑰花结百分率 - 对照管 E 玫瑰花结百分率

6 附件 2 脾氨肽溶液本品系用健康牛脾脏为原料, 经去脂肪细胞破碎超滤制成的多肽氨基酸和多核苷酸混合物的溶液每 1ml 中含多肽以牛血清白蛋白计不得少于 1.2mg, 含核苷酸以 D- 核糖计不得少于 0.012mg 性状本品为无色至微黄色澄清液体有特臭鉴别取本品, 加水制成每 1ml 中含多肽 40μg 的溶液, 照分光光度法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 IV A) 测定, 264nm 的波长处有最大吸收检查 ph 值应为 6.0~7.5( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅵ H) 蛋白质取本品 2ml, 加 20% 磺基水杨酸溶液 2ml, 混匀, 不得发生浑浊或沉淀游离氨基酸精密量取本品 5.0ml, 置 10ml 量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 用 0.45 m 滤膜滤过, 取续滤液作为供试品溶液 ; 分别精密称取 17 种氨基酸 ( 门冬氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸甘氨酸苏氨酸精氨酸丙氨酸酪氨酸胱氨酸缬氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸和脯氨酸 ) 对照品适量, 置同一量瓶中, 用 0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释制成每 1ml 中约含每种对照品 100μg 的溶液, 摇匀, 作为混合对照品溶液用适宜的仪器和方法或照下列高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅴ D) 测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 (4.6mm 150mm; 3 m), 以磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液 ( 将 10mmol/L 磷酸氢二钠溶液与 10mmol/L 硼酸钠溶液混合, 制成 ph 8.2 的溶液 ) 为流动相 A, 以乙腈 - 甲醇 - 水 (45:45:10) 为流动相 B, 按下表进行梯度洗脱, 流速约为每分钟 1.5ml, 柱温 40, 检测器为二极管阵列检测器,0~16 分钟, 检测波长 338nm,16~20 分钟为 262nm 时间 ( 分钟 ) 流动相 A(%) 流动相 B(%) 测定法分别精密量取混合对照品溶液与供试品溶液, 采用在线自动衍生 ( 衍生程序见下表 ) 后进样, 记录色谱图, 按外标法以峰面积分别计算各氨基酸含量本品每 1ml 中含游离氨基酸总量不得少于 1.3mg No. 衍生化操作步骤 1 吸取 0.4mol/L 硼酸盐缓冲液 ( 取 4.96g 硼酸和 2.28g 氢氧化钠, 加水溶解并稀释至 200ml, 用 2mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph 值至 10.2 )2.5μl; 2 吸取测定溶液 1.0μl;

7 3 在空气中以最大速度混合 5 次, 混合体积 3.5μl; 4 等待 0.2 分钟 ; 5 吸取邻苯二甲醛衍生剂 ( 取邻苯二甲醛 100mg, 加上述硼酸盐缓冲液溶解, 加入 3- 巯基丙酸 100μl, 用硼酸缓冲液稀释至 10ml, 摇匀 )0.5μl; 6 在空气中以最大速度混合 10 次, 混合体积 4.0μl; 7 吸取 9- 芴甲基氯甲酸酯衍生剂 ( 取 9- 芴甲基氯甲酸酯 25mg, 用乙腈溶解并稀释至 10ml, 摇匀 ) 0.4μl; 8 在空气中以最大速度混合 10 次, 混合体积 4.4μl; 9 吸取进样溶剂 (100ml 流动相 A 加入 0.25ml 磷酸, 混匀 ) 32μl; 10 在空气中以最大速度混合 8 次, 混合体积 20μl; 11 进样活力测定取本品适量, 照 T 细胞活性测定法 - 脱 E 受体法 ( 附件 1) 测定, 供试品管的 E 玫瑰花结百分率与对照管的 E 玫瑰花结百分率之差应不低于 12.0% 微生物限度取本品, 照微生物限度检查法 (2010 年版二部附录 Ⅺ J) 检查, 细菌计数霉菌和酵母菌计数均采用常规平皿法, 大肠埃希菌检查沙门菌检查均采用常规法本品每 1ml 中细菌数不得过 500cfu, 霉菌和酵母菌计数不得过 100 cfu, 大肠埃希菌每 1ml 不得检出 ; 每 10ml 中沙门菌不得检出含量测定多肽精密量取本品适量, 用水定量稀释制成每 1ml 中含多肽 0.15mg 的溶液, 依法测定 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅶ M 第二法 ) 根据回归方程计算本品中以牛血清白蛋白计的多肽含量核苷酸标准曲线的制备精密称取 D- 核糖对照品适量, 加 5% 的三氯醋酸溶液溶解并制成每 1ml 中含 20μg 的溶液, 摇匀, 作为对照品溶液精密量取对照品溶液 0.0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 和 1.0ml 分别置具塞试管中, 各加入 5% 的三氯醋酸溶液适量至 2.0ml, 分别精密加入 1% 的 3,5- 二羟基甲苯溶液 [ 取 3,5- 二羟基甲苯 1g, 溶于 0.1% 三氯化铁的盐酸溶液 ( 取三氯化铁 0.5g, 加盐酸溶解使成 500ml)100ml 中, 临用新配 ]2.0ml, 摇匀, 置沸水浴中准确加热 30 分钟, 迅速冷却至室温, 以 0 号管为空白, 照紫外 - 可见分光光度法 ( 中国药典 2010 年版二部附录 Ⅳ A), 在 650nm 的波长处测定吸光度, 以对照品溶液浓度与相应的吸光度进行线性回归, 其相关系数应大于测定法精密量取本品适量, 用 5% 三氯醋酸溶液定量稀释制成每 1ml 中含核糖 5μg 的溶液, 作为供试品溶液精密量取供试品溶液 2.0ml, 照标准曲线的制备项下, 自分别精密加入 1% 的 3,5- 二羟基甲苯溶液 2.0ml 起, 依法操作, 测定吸光度, 根据回归方程计算本品中以 D- 核糖计的核苷酸含量类别免疫调节药贮藏密闭,-20 以下保存制剂脾氨肽口服溶液

8 附件 3 牛脾本品为检疫合格未经免疫的, 国家定点屠宰机构屠宰的健康牛的脾脏性状肉眼观察脾脏表面为光滑平整粉红色无肿瘤及寄生虫病的病理现像贮藏置于 -20 以下的冷藏柜或低温冰箱中储藏, 冷藏时间不超过 6 个月牛脾在储藏运送过程中, 应需保持冰冻状态

Microsoft Word - 多肽水解氨基酸测定 doc

Microsoft Word - 多肽水解氨基酸测定 doc 测试报告样品信息样品名称多肽水解氨基酸测定编号 W20140504-001 样品重量 \ 剂型 \ 收样日期 2014/05/04 测试期间 2014/05/04-05/08 样品描述测试需求测试成分含测参考标准参考标准高效液相色谱法标样有仪器信息测试仪器高效液相色谱仪仪器型号安捷伦 1260 色谱条件 : 色谱柱 : 流动相 : 检测波长 : 月旭 Amino Acid,4.6