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燃充
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1 乳酸脱氢酶 (LDH) 测试盒 Cat numberkgt02424/kgt02448 Store at -20 for 3 months For Research Use Only( 科研专用 ) 说明书修订日期一. 测定原理乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase LDH) 能催化乳酸生成丙酮酸, 丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙, 在碱性溶液中呈棕红色, 通过比色可求出酶活力二. 试剂盒组份组份 KGT02424 KGT02448 保存条件 24 assays 48 assays Buffer A 15ml 30ml 4 试剂 B 2 支 3 支冷冻保存 Buffer C 15ml 30ml 室温避光 Buffer D(4M NaOH) 15mL 30ml 密封保存丙酮酸钠标准液 (2mmol/L) 1 支 1 支 4 Buffer B 辅酶应用液, 试剂 B 每支粉剂加 1.3ml 双蒸水溶解, 溶解后冻存可保存 2 周, 如需多次使用, 建议分装冷冻, 避免反复冻融 buffer A 基质缓冲液 Buffer C2,4- 硝基苯肼 Buffer D4M NaOH 以蒸馏水稀释 10 倍, 成为 Buffer D 工作液三. 操作步骤 1. 用前请将样本及试剂放置至室温, 按下表步骤进行检测试剂标准管标准空白管测定管对照管 2mmol/L 丙酮酸钠标准液 (ml) a* 蒸馏水 (ml) a* 0.05 样品 (ml) a* a* Buffer A(mL) 试剂 B 工作液 (ml) 0.05 混匀,37 水浴 15min Buffer C(ml) 混匀,37 水浴 15min Buffer D 工作液 (ml) 混匀, 室温放置 3 分钟,440nm, 蒸馏水调零,1cm 光径, 测各管吸光度 * 参考取样量 0.2% 小鼠脑组织匀浆取 10~50µl, 大鼠血清取 10~30µl 若样本中 LDH 酶活力太

2 大, 可将样本用生理盐水稀释后再测注 1. 测定空白管中不加辅酶 I 2. 严格按照说明书操作, 不可先加辅酶 I 再加基质液四. 计算 (1) 血清 ( 浆 ) 乳酸脱氢酶定义及计算公式 1 定义1000ml 血清 ( 浆 )37 与基质作用 15 分钟, 在反应体系中产生 1µmol 丙酮酸为 1 单位 2 计算公式 ODU ODC 血清 ( 浆 ) 中乳酸脱氢酶 ( LDH) 活性 ( U / L) = CS N 1000 OD -OD (2) 组织乳酸脱氢酶定义及计算公式 1 定义每克组织蛋白 37 与基质作用 15 分钟, 反应体系中产生 1µmol 丙酮酸为 1 单位 2 计算公式 ODU ODC 组织中乳酸脱氢酶 ( LDH) 活性 ( U / gprot) = CS C OD -OD 式中 S S B B prot OD U 测定管吸光度值 ; C S 标准浓度 (2mmol/L); OD B 空白管吸光度值 ; N 样品测试前稀释倍数 ; OD S 标准管吸光度值 ; C prot 待测样本蛋白含量 (gprot/ml) OD C 对照管吸光度值 ; (3) 血清 ( 浆 ). 组织中乳酸脱氢酶活力计算 1 血清( 浆 ) 计算举例取大鼠血清 0.02ml 检测乳酸脱氢酶活力, 测得测定管吸光度为 0.313, 测定空白管吸光度为 0.099, 标准管吸光度为 0.298, 标准空白管吸光度为血清中 LDH 活力 ( U / L) = = U / L 组织计算举例 (1) 取 1% 大鼠肺组织匀浆 0.015ml 检测乳酸脱氢酶活力, 测得测定管吸光度为 0.485, 测定空白管吸光度为 0.069, 标准管吸光度为 0.240, 标准空白管吸光度为 0.070,1% 匀浆蛋白浓度为 0.635mg/ml 即 g/ml 组织中 LDH 活力 ( U / gprot) = 2 ( ) = U / gprot

3 (2) 取 0.2% 小鼠脑组织匀浆 0.02ml 检测乳酸脱氢酶活力, 测得测定管吸光度为 0.472, 测定空白管吸光度为 0.264, 标准管吸光度为 0.298, 标准空白管吸光度为 0.075,2% 匀浆蛋白浓度为 0.850mg/ml 即 g/ml 组织中 LDH 活力 ( U / gprot) = 2 ( ) = U / gprot 六附录附录一以 ROCHE 公司的乳酸脱氢酶 LDH 标准品做标准曲线附录二大鼠血浆 LDH 取样量摸索附录三 0.2% 小鼠脑匀浆 LDH 取样量摸索附录 ( 一 ) ( 以 ROCHE 公司的乳酸脱氢酶 LDH 标准品做标准曲线 ) 7.5U/ml LDH 标准品的配制取 10µl LDH 标准液 (37 时活力为 7500U/ml) 稀释并定容至 10ml 管号 U/ml LDH 标准品 (ml) 蒸馏水 (ml) 基质缓冲液 (ml) ,4- 二硝基苯肼液 (ml) mol/l 氢氧化钠 (ml) 混匀, 静置 3 分钟, 在 440nm 处,1cm 光径, 蒸馏水调零, 测各管吸光度相当于 LDH 单位本所吸光度参考值本所绝对吸光度参考值以所测得的吸光度为纵坐标, 以相应的单位为横坐标, 绘制标准曲线

4 一操作表附录 ( 二 ) 大鼠血浆 LDH 取样量摸索标准管标准管空白管测定管测定管空白管蒸馏水 (ml) 标准品 (ml) 0.02 不同浓度的样本 (ml) 基质缓冲液 (ml) 辅酶 I 溶液 (ml) ,4 二硝基苯肼溶液 (ml) mol/L 氢氧化钠溶液 (ml) 混匀, 室温放置 3 分钟,440nm, 蒸馏水调零,1cm 光径, 测各管吸光度二. 结果管号 0 测定 1 测定 2 测定 3 测定 4 测定 5 测定 6 测定 7 血浆 (ml) 双蒸水 (ml) 测定 OD 值测定空白 OD 值绝对吸光度二大鼠血浆检测 LDH 时最佳取样量的摸索曲线 ( 水浴温度为 37 )

5 参考取样量大鼠血浆为 10-30µL, 最佳取样量为 20µL 在其范围内酶曲线通过回归曲线的处理, 相对成正比关系若取样量过大或过少, 则在实验结束后, 再进行统计学处理时会出现无显著差异附录 ( 三 ) 一操作表 0.2% 小鼠脑匀浆 LDH 取样量摸索标准管标准管空白管测定管测定管空白管蒸馏水 (ml) 标准品 (ml) 0.02 不同浓度的样本 (ml) 基质缓冲液 (ml) 辅酶 I 溶液 (ml) ,4 二硝基苯肼溶液 (ml) mol/L 氢氧化钠溶液 (ml) 混匀, 室温放置 3 分钟,440nm, 蒸馏水调零,1cm 光径, 测各管吸光度二结果管号 0 测定 1 测定 2 测定 3 测定 4 测定 5 测定 6 测定 7 0.2% 的匀浆 (ml) 双蒸水 (ml) 测定 OD 值测定空白 OD 值绝对吸光度三 0.2% 小鼠脑匀浆检测 LDH 时最佳取样量的摸索曲线

6 参考取样量 0.2% 小鼠脑匀浆为 20-50µL, 最佳取样量为 35-40µL 在其范围内酶曲线通过回归曲线的处理, 相对成正比关系若取样量过大或过少, 则在实验结束后, 再进行统计学处理时会出现无显著差异

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