标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

甯韧满
5 years ago
Views:

1 中华人民共和国国家标准 GB 食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定发布实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布

2 前言本标准代替 GB/T 红曲类产品中桔青霉素的测定 SN/T 进出口粮谷中桔霉素含量检测方法液相色谱法和 SN/T 出口食品中桔霉素的测定方法免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定 ; 增加了净化步骤 ; 增加了适用范围 Ⅰ

3 食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定 1 范围本标准规定了食品中桔青霉素的测定方法本标准第一法适用于大米玉米辣椒红曲类产品中桔青霉素的测定, 第二法适用于大米大麦燕麦小麦中桔青霉素的测定第一法免疫亲和柱净化 - 高效液相色谱法 2 原理试样中的桔青霉素用甲醇 - 水提取, 提取液经过滤稀释后, 用免疫亲和柱净化, 采用液相色谱结合荧光检测器测定桔青霉素的含量, 外标法定量 3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB6682 规定的二级水 3.1 试剂甲醇 (CH 3OH): 色谱纯乙腈 (CH 3CN): 色谱纯磷酸 (H 3PO 4 ): 色谱纯冰乙酸 (C 2H 4O 2 ): 色谱纯氢氧化钠 (NaOH) 吐温 20(C 58H 114O 26 ) 氯化钠 (NaCl) 磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4 ) 磷酸二氢钾 (KH 2PO 4 ) 氯化钾 (KCl) 3.2 试剂配制氢氧化钠溶液 (2mol/L): 称取 80.0g 固体氢氧化钠, 溶于 1L 水中磷酸溶液 (10mmol/L,pH7.5): 准确移取 ml 磷酸加水定容至 2000 ml, 用 2 mol/l 的氢氧化钠溶液调节 ph 至磷酸溶液 (10mmol/L,pH2.5): 准确移取 ml 磷酸加水定容至 2000 ml, 用 2 mol/l 的氢氧化钠溶液调节 ph 至 PBS 缓冲溶液 : 称取 8.0g 氯化钠 1.2g 磷酸氢二钠 0.2g 磷酸二氢钾 0.2g 氯化钾, 用水溶解, 1

4 调节 ph 至 7.0, 用水定容至 1000mL % 吐温 20-PBS 溶液 : 准确移取 1mL 吐温 20 以 PBS 缓冲溶液定容至 1000mL % 磷酸溶液 : 准确移取 1mL 磷酸加水定容至 1000mL 洗脱液 Ⅰ: 甲醇 -10mmol/L 磷酸溶液 (ph2.5)(70+30) 洗脱液 Ⅱ: 甲醇 -0.1% 磷酸溶液 (70+30) 3.3 标准品桔青霉素 (C 13H 14O 5,CAS 号 : ), 纯度 99.0% 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 3.4 标准溶液配制标准储备液 : 准确称取一定量的桔青霉素标准品, 以甲醇溶解并定容至 10.0 ml 作为标准储备液, 浓度为 100μg/mL, 于 4 下保存标准中间液 : 准确移取 1.0 ml 桔青霉素标准储备液于 10 ml 容量瓶中, 用甲醇定容, 浓度为 10μg/mL, 于 4 下保存基质标准工作液 : 根据需要, 取适量的标准中间液, 用空白样品提取液配成不同浓度的基质标准工作液, 现用现配 3.5 材料桔青霉素免疫亲和柱 : 柱体积 3mL, 最大柱容量 20ng, 或等效柱玻璃纤维滤纸 : 直径 11cm, 孔径 1.5μm 4 仪器和设备 4.1 高效液相色谱仪, 配荧光检测器 4.2 分析天平 : 感量 g 和 0.01g 4.3 高速均质器 : 12000r/min 4.4 混匀器 5 分析步骤 5.1 提取大米玉米辣椒称取经充分粉碎均质试样 10.0g( 精确至 0.1g) 于 150 ml 具塞锥形瓶中, 加入 50 ml 甲醇 - 水 (70+30) 提取液, 以高速均质器高速均质提取 2 min, 过滤提取液, 移取 1.0 ml 滤液, 置于另一干净的容器中, 加入 49mL10mmol/L 磷酸溶液 (ph7.5) 稀释混匀 ; 以玻璃纤滤纸过滤待免疫亲和柱净化红曲及其制品称取经充分粉碎均质试样 1.0g( 精确至 0.1g) 于 50 ml 具塞锥形瓶中, 加入 20 ml 甲醇 - 水 (70+30) 提取液, 以高速均质器高速均质提取 2 min, 过滤提取液, 移取 1.0 ml 滤液, 置于另一干净的容器中, 加入 39mLPBS 缓冲溶液稀释混匀 ; 以玻璃纤滤纸过滤待免疫亲和柱净化 2

5 5.2 净化大米玉米辣椒将免疫亲和柱连接于 10mL 玻璃针筒下, 准确移取 10.0mL( 相当于 0.04g 试样 ) 上述澄清滤液过免疫亲和柱, 以 1 滴 /s~2 滴 /s 的流速全部通过亲和柱 ; 加入 5mL10mmol/L 磷酸 (ph7.5) 以 1 滴 /s~ 2 滴 /s 的流速淋洗柱子, 直至空气进入到亲和柱中, 弃去全部流出液准确加入 1.0 ml 洗脱液 Ⅰ 进行洗脱, 洗脱流速为 1 滴 /s~2 滴 /s 收集全部洗脱液于玻璃试管中, 供检测用红曲及其制品将免疫亲和柱连接于 10mL 玻璃针筒下, 准确移取 10.0mL 上述澄清滤液过免疫亲和柱, 以 1 滴 /s~ 2 滴 /s 的流速全部通过亲和柱 ; 加入 10mL0.1% 吐温 20-PBS 溶液, 以 1 滴 /s~2 滴 /s 的流速淋洗柱子, 直至空气进入到亲和柱中, 弃去全部流出液准确加入 1.0 ml 洗脱液 Ⅱ( 红曲及其制品 ) 进行洗脱, 洗脱流速为 1 滴 /s~2 滴 /s 收集全部洗脱液于玻璃试管中, 供检测用 5.3 空白试验除不加试样外, 均按上述操作步骤进行 5.4 测定液相色谱参考条件大米玉米辣椒液相色谱分析条件列出如下 : a) 色谱柱 :C 18 柱, 柱长 150mm, 内径 4.6mm, 粒径 5μm, 或等效柱 ; b) 柱温 :30 ; c) 流速 :1.0mL/min; d) 进样量 :50μL; e) 检测条件 : 激发波长 350nm, 发射波长 500nm; f) 流动相 A 液 : 乙腈, 流动相 B 液 :10mmol/L 磷酸 (ph2.5) 流动相及梯度洗脱条件见表 1 表 1 流动相及梯度洗脱条件时间 /min 流动相 A 液 /% 流动相 B 液 /% 红曲及其制品液相色谱分析条件列出如下 : a) 色谱柱 :C 18 柱, 柱长 150mm, 内径 4.6mm, 粒径 5μm, 或等效柱 ; 3

6 b) 柱温 :30 ; c) 流速 :0.7mL/min; d) 进样量 :50μL; e) 检测条件 : 激发波长 350nm, 发射波长 500nm; f) 流动相 A 液 : 乙腈, 流动相 B 液 :0.1% 磷酸流动相及梯度洗脱条件见表 2 表 2 流动相及梯度洗脱条件时间 /min 流动相 A 液 /% 流动相 B 液 /% 标准曲线的制作配制 0.0ng/mL 1.0ng/mL 2.0ng/mL 5.0ng/mL 10.0ng/mL 20.0ng/mL6 个浓度的基质标准工作液在仪器最佳工作条件下, 用基质标准工作溶液分别进样, 以相应的桔青霉素的色谱峰的峰面积为纵坐标, 以基质标准工作溶液中桔青霉素的浓度为横坐标, 绘制标准曲线桔青霉素标准的色谱图参见图 A.1 和图 A 试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪, 测定相应的峰面积由标准曲线得到试样溶液中桔青霉素的浓度 6 分析结果的表述试样中桔青霉素含量按式 (1) 计算 : 式中 : X = ρ V f m X 试样中桔青霉素的含量, 单位为微克每千克 ( μ g/kg); ρ 样液中桔青霉素的浓度, 单位为微克每升 ( μ g/l); V 定容体积, 单位为毫升 (ml); f 样液稀释倍数 ; m 样液所代表的试样量, 单位为克 (g) 计算结果需扣除空白值计算结果保留两位有效数字 (1 ) 7 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 4

7 8 其他本方法中大米玉米辣椒粉样品的检出限和定量限分别为 8μg/kg 和 25μg/kg; 红曲及其制品的检出限和定量限分别为 25μg/kg 和 80μg/kg 第二法 C 18 固相萃取小柱净化 - 高效液相色谱法 9 原理用乙腈 - 异丙醇 - 水的混合溶液提取试样中桔青霉素,C 18 固相萃取小柱净化, 用配荧光检测器的液相色谱仪测定, 外标法定量 10 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB6682 规定的二级水 10.1 试剂异丙醇 (C 3H 8O): 色谱纯乙腈 (CH 3CN): 色谱纯磷酸 (H 3PO 4 ): 优级纯甲醇 (CH 3OH) 10.2 试剂配制提取溶剂 : 乙腈 - 异丙醇 - 水 ( ), 用磷酸调 ph 为磷酸溶液 (0.08mol/L): 取 5.6mL 磷酸, 以水定容至 1L 流动相 : 乙腈 - 异丙醇 - 磷酸溶液 ( ) 10.3 标准品桔青霉素 (C 13H 14O 5,CAS 号 : ), 纯度 99% 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 10.4 标准溶液配制桔青霉素标准储备液 : 称取适量桔青霉素标准物质, 用乙腈溶解并定容至 1.0 mg/ml,0 ~ 4 保存桔青霉素标准工作液 : 根据需要用流动相将标准储备液稀释成 25ng/mL 50ng/mL 100ng/mL 500ng/mL 1000ng/mL 的标准工作溶液 10.5 材料 C 18 固相萃取柱 : 填料 500mg, 柱体积 3mL, 或等效柱玻璃纤维滤纸 : 直径 11cm, 孔径 1.5μm 5

8 11 仪器和设备 11.1 高效液相色谱仪 : 配有荧光检测器 11.2 振荡器 11.3 离心机 : 6500r/min 11.4 真空固相萃取装置 11.5 氮吹仪 11.6 分析天平 : 感量 g 和 0.01g 12 分析步骤 12.1 提取取样品 500g, 用粉碎机粉碎并通过 830μm 圆孔筛, 混匀, 分成 2 份, 装入洁净容器内, 密封保存称取试样约 5g( 精确至 0.01g) 于 50mL 离心管中, 加 10mL 提取溶剂 (10.2.1), 在振荡器上振荡提取 30min 以 3500r/min 离心 4 min, 上清液转入另一离心管中在残渣中再加入 5 ml 提取溶剂 (10.2.1), 重复上述操作, 合并上清液在提取液中加水至 40mL, 并用磷酸调 ph 为 1.5, 过玻璃纤维滤纸, 待净化 12.2 净化将上述溶液过预淋洗好的 C 18 固相萃取柱, 用 5 ml 水淋洗柱子待淋洗液全部流出柱子后, 减压抽干 3min 用 10mL 甲醇以 1.0 ml/min 的速度洗脱, 收集全部洗脱液, 在 40 下,N 2 吹干, 再以 1.0mL 流动相溶解, 过 0.22μm 的有机相微孔滤膜, 供液相色谱测定 12.3 空白试验除不加试样外, 均按上述操作步骤进行 12.4 测定液相色谱参考条件 a) 色谱柱 :C 18 柱, 柱长 250mm, 内径 4.6mm, 粒径 5μm, 或等效者 ; b) 流动相 : 乙腈 - 异丙醇 - 磷酸溶液 ( ); c) 流速 :1.0mL/min; d) 进样量 :50μL; e) 柱温 :28 ; f) 检测波长 : 激发波长 331nm, 发射波长 500nm 色谱测定根据样液中被测桔青霉素含量情况, 选定峰面积相近的标准工作溶液标准工作液和样液中桔青霉素响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下, 桔青霉素保留时间约为 9.1min, 标准物质色谱图见图 A.3 13 分析结果的表述试样中桔青霉素含量按式 (2) 计算 : 6

9 式中 : X = A ρ V A s m X 试样中桔青霉素含量, 单位为微克每千克 ( μ g/kg); A 样液中桔青霉素的峰面积 ; ρ 标准工作液中桔青霉素的浓度, 单位为微克每升 ( μ g/l); V 样液最终定容体积, 单位为毫升 (ml); A s 标准工作液中桔青霉素的峰面积 ; m 最终样液所代表的试样量, 单位为克 (g) (2 ) 计算结果需扣除空白值, 测定结果用平行测定的算术平均值表示, 结果保留两位有效数字 14 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10% 15 其他方法检出限为 3μg/kg, 定量限为 10μg/kg 7

10 附录 A 桔青霉素标准的液相色谱图桔青霉素标准的液相色谱图见图 A.1~ 图 A.3 图 A.1 桔青霉素标准溶液 (100ng/mL) 液相色谱图 ( 玉米基质标准工作液 ) 图 A.2 桔青霉素标准溶液 (100ng/mL) 液相色谱图 ( 红曲基质标准工作液 ) 8

11 图 A.3 桔青霉素标准溶液 (100ng/mL) 的液相色谱图 9

标题

中华人民共和国国家标准 GB 5009.209 2016 食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定 2016-12-23 发布 2017-06-23 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布前言本标准代替 GB/T5009.209 2008 谷物中玉米赤霉烯酮的测定 GB/T23504 2009 食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法 GB/T21982